FDA藥物相互作用研究指南

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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,FDA藥物相互作用研究指南,藥學部,盧進,2010.7.13,介紹內(nèi)容,簡介,藥物相互作用研究的背景知識,藥物相互作用研究的一般策略,體內(nèi)藥物相互作用的實驗設計,藥物代謝酶的確認,CYP酶抑制/誘導作用的體外評價,P-gp底物和抑制劑的體外實驗研究,簡介,美國FDA,藥物

2、評價和研究中心(CDER),生物制品評價和研究中心(CBER),2006年9月,共同發(fā)布,藥物相互作用研究-實驗設計、數(shù)據(jù)分析及其在劑量調(diào)整和處方標簽中的應用的指南,簡介,指南為新藥和新生物制品的研發(fā)者提供了：,藥物代謝,藥物轉(zhuǎn)運,體內(nèi),體外,相互作用研究規(guī)范,簡介,內(nèi)容涉及藥物相互作用研究的全過程,包括：,實驗設計,研究人群或體外研究用細胞、微粒體,探針底物、抑制劑、誘導劑的選擇,觀察指標、樣本量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，等,除了代謝性藥物相互作用以外，還對P糖蛋白介導的藥物相互作用的研究方法給予了詳細的指導,（與1999年版本相比的增加內(nèi)容）,1.藥物相互作用研究的背景知識,包括細胞色素P450(C

3、YP)酶在內(nèi)的多個藥物代謝酶都能被聯(lián)用的藥物所抑制/誘導,藥物濃度發(fā)生巨大改變,影響藥物安全性和有效性,同時,藥物轉(zhuǎn)運蛋白,相關的藥物相互作用受到越來越多的關注,如:P-gp、有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白（OAT），等。,表一,：人類主要的轉(zhuǎn)運蛋白和已知的底物、抑制劑、誘導劑,2.藥物相互研究的一般策略,根據(jù)體外代謝、已知和誘導實驗的結(jié)果及體內(nèi)代謝實驗數(shù)據(jù)確定體內(nèi)相互作用研究必要性。,流程圖,目前尚未發(fā)現(xiàn)CYP2D6酶被誘導的情況，而,CYP2C,CYP2B和P-gp,是可以和,CYP3A,一起被誘導的。,CYP3A,對所有已知的誘導劑,都很敏感,。,因此，考察受試藥物能否能夠誘導,CYP1A2,CYP

4、2C8,CYP2C9,CYP2C19和CYP3A,時，只需要體外考察對,CYP1A2,和,CYP3A,酶的誘導情況即可。,若體外實驗顯示受試藥物對CYP3A無誘導作用，那么就可以免做對CYP2C和CYP2B的誘導研究。,3.體內(nèi)藥物相互作用實驗設計,實驗設計,研究群體,底物和作用藥物的選擇,給藥途徑,給藥劑量,3.1實驗設計,思路：比較底物（,S,）濃度在,有和沒有,作用藥物（,I,）時的變化情況。,隨機交叉法,（先服用,S,后服用,S+I,組、先服用,S+I,組后服用,S,組）,單次序交叉法,（總是先服用,S,后服用,S+I,組、或相反）,平行設計,（一組服用,S,一組服用,S+I,）,設計

5、方案時應該注意：,(1)如果實驗需要達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度而底物或作用藥物和(或)其代謝物的半衰期較長,此時,不能采用額外給予一個負荷劑量的方法,加快達到穩(wěn)態(tài)。,(2)如果作用藥物是一個快速可逆的抑制劑,其服用時間應該在測定當天服用底物前或同時服用,這樣才能增加其敏感性。,對于基于作用機制的抑制劑(如紅霉素),在服用底物藥物,前,服用作用藥物可以,放大相互作用強度,。,如果作用藥物(抑制劑或誘導劑)的吸收受多種因素的影響(如胃pH值),則需要采取適當?shù)姆椒?控制,吸收方面的變化。,(3)為了排除由于食物、飲料、果汁等影響代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白而引起誤差,指南建議實驗過程中要,嚴格控制飲食,。,3.2 研究

6、群體,一般是,健康受試者,。,在特定環(huán)境下，受試藥物表現(xiàn)的治療效果或者藥效學效果,不在健康者身上出現(xiàn),，此時要從,患者群體,中招募受試者。,藥物相互作用的程度可能因受試者某個具體CYP酶的基因型不同而有所差異。,3.3 底物和作用藥物的選擇,表二：指南推薦的CYP酶底物。,“雞尾酒”模式,釋義：在一個實驗中受試者同時服用,多種CYP酶底物,。,實驗設計需考慮下列因素：,(1)一種特定酶的底物對該酶具有較高的選擇性;,(2)底物之間沒有相互作用發(fā)生;,(3)受試者的數(shù)量達到統(tǒng)計學要求。,(4)藥物濃度變化在安全范圍內(nèi);,(5)入選的CYP酶都參與藥物代謝消除;,(6)藥物其他代謝途徑或者不被抑制

7、的途徑的藥物清除率低。,評價：,這種雞尾酒實驗的陰性結(jié)果可以免除對其中某個具體酶的進一步評價,然而,陽性結(jié)果則需要進一步的體內(nèi)研究,。,雞尾酒實驗可比單個相互作用研究提供更多的信息,而結(jié)論的確定程度取決于藥物其他不被抑制的代謝途徑的清除率分數(shù)(,清除率分數(shù)越小,確定程度越高,)。,如果單一的相互作用實驗顯示抑制效應可以導致嚴重的安全隱患,則不能進行雞尾酒設計法。,3.4 給藥途徑,受試藥物的給藥途徑應與,將來臨床應用,的方式一致。,體內(nèi)相互作用研究采取的給藥方式取決于,未來上市劑型,。,3.5 給藥劑量,實驗設計應盡可能將底物和作用藥物相互作用的結(jié)果,最大化,，因此指南推薦作用藥物（抑制劑/誘

8、導劑）使用,最大安全劑量和最短給藥間隔,。,當使用,低于,臨床常用劑量的給藥方案時，體內(nèi)藥物相互作用研究方案應在結(jié)果報告中,進行討論,。,4.藥物代謝酶的確認,如果某個酶對藥物的代謝量占整個藥物消除量,25%,則可以確認此酶是藥物的主要代謝酶。,將藥物和肝細胞或肝切片一起孵育,然后通過色譜方法分析孵育介質(zhì)和細胞內(nèi)藥物濃度,這種方法可以直接獲得氧化、水解或基團轉(zhuǎn)移形成的代謝物,提供平行代謝還是先后代謝的信息。,另一種方法是用HPLC來分析孵育介質(zhì)。實驗還需要優(yōu)化介質(zhì)中受試藥物濃度和孵育時間。臨床預期的穩(wěn)態(tài)血藥濃度可以用來指導體外實驗介質(zhì)中藥物濃度的選擇。,有三種方法可以很好地確認不同的CYP酶對

9、藥物代謝的貢獻:,(1)特定的化學物質(zhì)或抗體作為特定酶的抑制劑,表5：,列出了常用的,特異性,化學抑制劑。,在確定代謝酶種類及其在藥物代謝中的相對貢獻時,藥物的濃度要,K,m 值,而抑制劑的濃度既要保證其選擇性又要保證足夠的量,所以可以采用一系列的抑制劑濃度。當使用基于作用機制的抑制劑時,最好將抑制劑與酶預先孵育,15 30 min。,(2)應用不同的人重組CYP酶,這種技術對研究單個CYP酶在整個藥物代謝中的相對貢獻的大小具有很高的價值,但不能代表人肝微粒體酶中的絕對的代謝比率。,(3)根據(jù)不同供體來源的CYP酶不同活性建立人肝微粒體庫。,指南建議至少采用上述兩種方法來確認藥物代謝酶,5.C

10、YP酶抑制作用的體外評價,Review:,K,i,：抑制率常數(shù)，抑制作用越強，此值越小,IC,50,：反應被抑制一半時抑制劑的濃度，越低表明抑制劑的抑制能力越強。,5.CYP酶抑制作用的體外評價,CYP酶抑制劑體外實驗設計,注意事項,:,(1)IC,50,測定時,在底物代謝率允許的情況下,盡量使底物的濃度低于其,K,m 值,使IC,50,與其,K,i 值更具相關性;,(2)肝微粒體蛋白濃度通常 1 gL,-1,;,(3)緩沖液的性質(zhì)、pH對Vmax和,K,m 的影響顯著,盡可能采用標準化的分析條件;,(4)反應系統(tǒng)中最好控制底物或抑制劑的消耗不超過10%30%,但是對于,K,m 值很低的藥物來

11、說,控制反應體系底物消耗10%很困難;,(5)建議建立時間-產(chǎn)物形成量的線性關系;,(6)建議建立酶量-產(chǎn)物形成量的線性關系;,(7)因為某些有機溶劑具有酶誘導或抑制作用,溶劑的濃度都要 1%(v/v),最好 0.1%,實驗應包括無溶劑對照和溶劑對照;,(8)實驗應該有一個已知抑制劑的陽性對照。,相互作用程度的模擬：,R=1+I/,K,i,（I代表作用部位抑制劑的濃度,K,i 是抑制常數(shù)）,指南推薦體內(nèi)相互作用的可能性通過,I/,K,i,來推斷,I代表服用臨床最大用藥量后平均穩(wěn)態(tài)的藥物濃度(游離或結(jié)合的全部藥物),比值升高,產(chǎn)生相互作用的可能性增大。,盡管通過體外數(shù)據(jù)定量預測體內(nèi)相互作用發(fā)生的

12、可能性存在困難,但可以通過,同一個藥物,對不同CYP 酶(CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19、CYP2D6和CYP3A)的,K,i 值進行篩選排序,體內(nèi)實驗從,I/,K,i,最大者,(或者,K,i,最小者)的CYP酶開始,如果實驗顯示體內(nèi),不存在,藥物相互作用,其他的,I/,K,i,相對較小的CYP酶的體內(nèi)實驗就可以,不做,。,6.CYP酶誘導作用的體外評價,實驗設計中應包括一個公認的酶誘導劑作為陽性對照,來減小不同供體酶催化活性差異引起的誤差。,表7:誘導劑選擇列表,實驗中應注意：,(1)受試藥物的濃度應該參考臨床治療劑量的血藥濃度,至少包括3個涵蓋治療窗的篩選濃度,其

13、中至少1個濃度要超過平均預期治療濃度1個數(shù)量級;,(2)與肝細胞共孵育23 d后,通過CYP特異的探針藥物(參考指南推薦)測定酶活性;,(3)使用新鮮分離的或者凍存的肝細胞進行實驗時,應該至少選擇3份不同的供體以減少誘導實驗中存在的個體差異。,評價,藥物酶誘導,作用時,指南建議:,(1)藥物體外實驗引起的酶活性的改變,40%陽性對照結(jié)果時,可以認為藥物具有酶誘導作用,需要進一步的體內(nèi)研究;,(2)EC,50,可以用來比較不同誘導劑誘導能 力的強弱;,(3)指南認為,根據(jù)目前了解的CYP酶誘導的細胞學機制,如果一個誘導實驗顯示對,CYP3A4,酶沒有誘導作用,可以推斷此藥物對CYP2C8,CYP

14、2C9和CYP2C19也,沒有,誘導作用。,7.P-gp底物和抑制劑的體外實驗研究,考察藥物是否是P-gp的底物或抑制劑,最常見的方法有哪些？,雙向轉(zhuǎn)運測定法,由于更直接,因此被作為標準的方法。,ATP酶活性測定法和攝取/外排法,可以用于快速篩選,但是不能區(qū)分是底物還是抑制劑。如果藥物透過性(膜擴散能力)低,ATP酶法和熒光定量法常常無法識別是否是P-gp的底物。,對高通透性化合物,雙向轉(zhuǎn)運測定法,也不適用。,這些底物作為陽性對照，保證實驗用細胞能夠表達功能性的P-gp.,7,.,1,雙向轉(zhuǎn)運實驗確定藥物是否是P-gp的底物,選擇好細胞系和P-gp底物陽性對照后,遵循下列步驟完成實驗:,(1)

15、設計幾個不同的藥物濃度(如1,10,100molL-1)考察P-gp 對藥物的外排作用;,(2)實驗開始前,將極性細胞組成的膜兩側(cè)的介質(zhì)去掉,加入新的介質(zhì)并孵育30 min;,(3)進行雙向膜轉(zhuǎn)運通透性研究:在極性膜的A側(cè)(apical側(cè),腔側(cè),頂區(qū)側(cè),轉(zhuǎn)運方向是A B)或B 側(cè)(basolateral側(cè),基底側(cè),轉(zhuǎn)運方向是B A)加入適量體積的含有已知P-gp底物或受試藥物的緩沖液;,(4)在37C孵育,在預定的時間(通常是1,2,3,4 h)收集受側(cè)的介質(zhì)測定藥物濃度,同時迅速補充緩沖液;,(5)已知P-gp底物作為陽性對照進行同樣的實驗;,(6)當采用LLC2PK1-MDR1 MDCK-

16、MDR1 作為實驗細胞系時,相應的野生型細胞系LLC-PK1和MDCK作為陰性對照;,(7)每個實驗至少在不同日期重復3次,考察日間和日內(nèi)變異情況;,(8)理想的實驗還應該測定底物的回收率,來消藥物代謝和非特異性結(jié)合帶來的誤差,由于Caco-2、野生型的LLC-PK1和MDCK也能表達其他外排轉(zhuǎn)運蛋白,因此在評價藥物是否是P-gp底物時要謹慎,為增加實驗的可信性,建議增加P-gp抑制劑(表10)存在下的底物驗證實驗,如果藥物的外排可被P-gp抑制劑明顯抑制,則說明藥物的外排與P-gp有關。,指南還建議,可以通過實驗對比MDR1過度表達細胞(轉(zhuǎn)染型細胞)和它們的野生型細胞對藥物外排活性的差異,確定P-gp在藥物外排中的貢獻大小。,利用下列公式描述藥物跨膜表觀通透性:,P,app=(,V,r/,c,0,)(1/,S,)(d,c,/d,t,),其中,V,r是極性膜受側(cè)介質(zhì)體積,c,0,是指膜供側(cè)實驗藥物的濃度,S,是指極性細胞形成的膜的面積,d,c,/d,t,是受側(cè)介質(zhì)藥物濃度與時間曲線的斜率。準確計算,P,app必須要求受側(cè)藥物濃度與時間是直線關系。,藥物經(jīng)P-gp外排速率,R,E可以通過