細(xì)胞培養(yǎng)污染簡介

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1、,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣

2、式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10

3、/10,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,細(xì)胞培養(yǎng)中污染物的預(yù)防與清除,中科院上海生化細(xì)胞所,2016，Jan，22-24,2021/10/10,1,培訓(xùn)班目的：,提高各生物資源保藏庫在資源保藏、評價(jià)方面的科技創(chuàng)新與服務(wù)能力。,資源保藏、評價(jià),創(chuàng)新能力,服務(wù)能力,（科學(xué)院對我們的要求）,2021/10/10,2,十八大明確提出要“實(shí)施創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展戰(zhàn)略，強(qiáng)調(diào)科技創(chuàng)新是提高社會(huì)生產(chǎn)力和綜合國力的戰(zhàn)略支撐，必須擺在國家發(fā)展全局的核心位置”。,我國科技服務(wù)業(yè)已經(jīng)具備一定的發(fā)展基礎(chǔ)，但是與英、美等發(fā)達(dá)國家相比，我國的科技服務(wù)

4、業(yè)產(chǎn)值及其占,GDP,比重較低，,2011,年度實(shí)現(xiàn)科技服務(wù)增加值不足,7000,億元，占,GDP,比重約為,1.4%,。,2014,年,10,月，國務(wù)院印發(fā),關(guān)于加快科技服務(wù)業(yè)發(fā)展的若干意見,（國發(fā),201449,號），這是國務(wù)院,首次,對,科技服務(wù)業(yè),發(fā)展作出的全面部署。,用創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)科技服務(wù)業(yè)的發(fā)展,（國家對我們的要求）,2021/10/10,3,細(xì)胞資源為生物醫(yī)藥基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐和保障,細(xì)胞資源保藏和技術(shù)研發(fā),人類遺傳資源庫,基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)細(xì)胞庫,國家發(fā)展和安全戰(zhàn)略,2021/10/10,4,一，,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。細(xì)胞庫的功能包括資源,保藏,能力、資源,利用,能力和資源,

5、開發(fā),能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細(xì)胞保藏單位的關(guān)鍵抓手，也是推動(dòng)細(xì)胞庫向科技服務(wù)業(yè),轉(zhuǎn)移重心,的必經(jīng)之路。,二，,保證細(xì)胞株不受污染是細(xì)胞庫保藏能力的關(guān)鍵性標(biāo)志，也是其他能力提升的基礎(chǔ)。,2021/10/10,5,一，,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。由細(xì)胞庫（,Cell Bank,）負(fù)責(zé)保存細(xì)胞系。,細(xì)胞庫,技術(shù)咨詢,對外供應(yīng),鑒定檢測,文檔管理,細(xì)胞培養(yǎng),質(zhì)量控制,保藏、評價(jià),開放、共享,技術(shù)服務(wù),培訓(xùn)科普,2021/10/10,6,一，,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。負(fù)責(zé)保存細(xì)胞系的細(xì)胞庫應(yīng)當(dāng)開發(fā)、承擔(dān)更多的功能，提升服務(wù)科技、服務(wù)社會(huì)的能力，產(chǎn)生更高的服務(wù)業(yè)產(chǎn)值。,細(xì)胞庫,技術(shù)咨詢,對外供應(yīng),鑒

6、定檢測,文檔管理,細(xì)胞培養(yǎng),質(zhì)量控制,保藏、評價(jià),開放、共享,技術(shù)服務(wù),培訓(xùn)科普,拓寬收集渠道,提升保藏特色,瞄準(zhǔn)科技發(fā)展前沿提升利用開發(fā)水平,2021/10/10,7,一，,細(xì)胞系是重要的遺傳資源。保存細(xì)胞系的細(xì)胞庫其功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開發(fā)能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細(xì)胞保藏單位的關(guān)鍵抓手。,中科院細(xì)胞庫,堅(jiān)持國際接軌的細(xì)胞保藏技術(shù)水平，積極吸引國內(nèi)有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞系進(jìn)入細(xì)胞庫保藏，逐步形成自己的特色。,堅(jiān)持用戶至上的服務(wù)態(tài)度，全方位為用戶著想為用戶服務(wù)，積極推動(dòng)庫內(nèi)細(xì)胞資源的利用。,密切關(guān)注國際細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展前沿，主動(dòng)與醫(yī)院等單位合作，拓寬細(xì)胞資源的種類，為我國細(xì)胞

7、生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展做好準(zhǔn)備。,我們的目標(biāo),2021/10/10,8,二，污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。保證細(xì)胞株不受污染是細(xì)胞庫保藏能力的關(guān)鍵性標(biāo)志，也是其他能力提升的基礎(chǔ),1,，細(xì)菌污染,2,，真菌污染,3,，支原體污染,4,，內(nèi)毒素污染,5,，細(xì)胞間交叉污染,2021/10/10,9,1,，細(xì)菌污染。,實(shí)驗(yàn)室中因操作不慎而引起的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了預(yù)防劑量的抗菌素也會(huì)產(chǎn)生。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，,pH,改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。

8、污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成實(shí)驗(yàn)失敗和細(xì)胞株,(,系,),丟失。,2021/10/10,10,2,，真菌污染,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中較為常見，尤其在南方霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易產(chǎn)生。最常見的真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色小點(diǎn)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。,2021/10/10,11,3,，支原體污染,3.1,，支原體污染是目前實(shí)驗(yàn)室中最為常見的污染細(xì)胞的原核生物。,

9、因支原體屬于直徑介于,0.2,左右的最小原核生物，形態(tài)易變，故極易通過濾膜而逃過培養(yǎng)液的過濾除菌步驟。在細(xì)胞培養(yǎng)液中，支原體可達(dá)到,10,7,-10,8,CFU/mL,（,CFU=Colony Forming Unit,，支原體濃度測量單位）而不使培養(yǎng)液混濁及影響細(xì)胞生長。多種支原體對細(xì)胞不產(chǎn)生任何病變效應(yīng)，使得細(xì)胞污染不易被察覺。據(jù)報(bào)道，目前世界上有,30-50%,的細(xì)胞株已受支原體污染。但是支原體對干細(xì)胞培養(yǎng)的影響甚大，胚胎干細(xì)胞受支原體污染形態(tài)、生長速度等均出現(xiàn)改變。,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時(shí)候，即應(yīng)懷疑支原體污染。,2021/1

10、0/10,12,由于多數(shù)細(xì)胞受支原體污染后無明顯變化或略有變化，若不及時(shí)處理，將產(chǎn)生交叉污染。另外，支原體會(huì)改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能等一系列特征，因此盡管很多受支原體污染的細(xì)胞其形態(tài)看不出變化，但對其進(jìn)行進(jìn)一步分子生物學(xué)分析時(shí)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)不準(zhǔn)確。為此建議各實(shí)驗(yàn)室定期對細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查。,可污染細(xì)胞的支原體種類較多，主要有,Mycoplasma orale,M.hyorhinis,M.arginini,和,Acholeplasma laidlawii,。目前已發(fā)現(xiàn)的支原體超過,100,種，這就是單一的檢測方法有時(shí)會(huì)失敗的原因之一。我們建議至少選擇,2,種方法來檢測支原體。,2021/10/1

11、0,13,3.2,，常用支原體檢測方法,3.2.1,，肉湯培養(yǎng)基檢測法。醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定使用。,3.2.2,，間接染色法檢測支原體,用待檢測的細(xì)胞培液培養(yǎng),Vero,細(xì)胞，然后用顯微鏡觀察是否有支原體感染。,Vero,細(xì)胞來源于正常的成年非洲綠猴腎組織，由,Y.Yasumura,和,Y.Kawakita,于,1962,年在日本,Chiba,大學(xué)分離得到。,Vero,細(xì)胞是非整倍體，可在培養(yǎng)液中無限生長，常用來生產(chǎn)疫苗，檢測支原體和細(xì)菌外毒素等。細(xì)胞培養(yǎng)液中的支原體可用,Hoechst33258,或,DAPI,染色后觀察到。由于支原體含有,DNA,，染色后在細(xì)胞表面，培養(yǎng)基中及培養(yǎng)皿表面呈現(xiàn)出熒光小

12、點(diǎn)。,2021/10/10,14,Vero,細(xì)胞,DAPI,染色熒光照片,(400),。,A,，感染支原體的,Vero,細(xì)胞。藍(lán)色卵圓形熒光物質(zhì)為,Vero,細(xì)胞核，其周圍藍(lán)色熒光小點(diǎn)為支原體,(,箭頭,),；,B,，未感染支原體的陰性對照,Vero,細(xì)胞；,C,，加入待檢培養(yǎng)液的,Vero,細(xì)胞,(,未感染支原體,),。,A,B,C,間接染色法檢測支原體,2021/10/10,15,3.2.2,，,PCR,法檢測支原體,許多支原體檢測方法不僅用時(shí)長而且復(fù)雜，有的方法僅限于檢測有限種類的支原體。,PCR,檢測法靈敏度高，特異性強(qiáng)，只用一天時(shí)間即可快速檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的支原體，是一種檢測支原體的

13、有效手段。中科院干細(xì)胞庫選擇支原體,16S rDNA,序列為靶序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)做對照組實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)以避免假陽性或假陰性結(jié)果，取得了很好的效果。,2021/10/10,16,PCR,法支原體檢測電泳圖。,+,：陽性對照；,-,：陰性對照；,1,：送檢樣品,1,（感染支原體）；,2,：送檢樣品,2,（未感染支原體）；,3,：樣品,1,的干擾實(shí)驗(yàn)；,4,：樣品,2,的干擾實(shí)驗(yàn)。若在,270bp,處有條帶，檢測結(jié)果為陽性。陽性對照及干擾實(shí)驗(yàn),PCR,產(chǎn)物在,270bp,處有一條帶，陰性對照無條帶，證明本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。,600bp,400bp,500bp,200bp,300bp,100bp,Mar

14、ker +-1 2 3 4,PCR,法檢測支原體,2021/10/10,17,預(yù)防：,1.,支原體噴霧（品牌：,Biochrom),：噴于操作臺(tái)和培養(yǎng)箱,2.Plasmocin prophylactic,（品牌：,InvivoGen,）：作用濃度為,5g/ml,作用于常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基（,500 x,稀釋）,去除：,Plasmocin treatment,（品牌：,InvivoGen,）：作用濃度為,25g/ml,，作用于感染的培養(yǎng)細(xì)胞基兩周（,1000 x,稀釋）。,3.3,，支原體污染的預(yù)防和去除,2021/10/10,18,4.1,，細(xì)菌內(nèi)毒素對培養(yǎng)物的危害：,實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)菌內(nèi)毒素對培養(yǎng)細(xì)

15、胞（尤其是,ES,細(xì)胞）的生長及活性具有明顯的抑制作用,且該作用具有一定的時(shí)間、劑量依賴性。,4.2,，細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源：,細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要天然成份,-,牛血清包括胎牛血清和新生牛血清是內(nèi)毒素的潛在來源。我國,2000,年版,中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),中對牛血清提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查等等。對于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)，,LIF,和,bFGF,是細(xì)菌內(nèi)毒素的另一個(gè)潛在來源。,4,，內(nèi)毒素污染,2021/10/10,19,4.3,，細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的監(jiān)控：,為排除血清、,LIF,和,bFGF,中內(nèi)毒素的污

16、染，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測是非常重要的。中國科學(xué)院干細(xì)胞庫只使用細(xì)菌內(nèi)毒素小于,1EU/ml,的血清、,LIF,和,bFGF,等各種生長因子。,4.4,，內(nèi)毒素監(jiān)控是細(xì)胞用于臨床治療所必須的。,目前各類臨床級干細(xì)胞尚無統(tǒng)一的國際、國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，這是胚胎干細(xì)胞進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段的最大障礙之一，也是細(xì)胞庫水平的一個(gè)重要標(biāo)志。但是在制藥工業(yè)中內(nèi)毒素是必須去除的。因此，中國科學(xué)院干細(xì)胞庫強(qiáng)調(diào)高標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)要求，把內(nèi)毒素監(jiān)控作為細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。,2021/10/10,20,鱟試劑凝膠半定量法檢測（參考,2010,年版,中國藥典,）,4.5,，內(nèi)毒素檢測方法,鱟試劑：鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素激活的凝固酶原（,Proclotting enzyme,）和凝固蛋白原（,Coagulogen,）。在適宜的條件下（溫度，,pH,值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。凝膠法鱟試劑是根據(jù)反應(yīng)所形成凝膠的程度來檢測樣品內(nèi)內(nèi)毒素的含量。,2021/10/10,21,5,，細(xì)胞間交叉污染,Hela,細(xì)胞是第一株源細(xì)胞系。,1952,年建系以