蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)DNA相互作用研究方法加實例 醫(yī)學PPT
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蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用研究方法 蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究方法,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的研究方法,酵母雙雜交系統(tǒng)Yeast Two-Hybrid Systerm 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down 技術(shù) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移Fluorescent Resonant Energy Transfer (FRET) 雙分子熒光互補(Bimolecular Fluorescent Complement)BIFC 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 其它方法,酵母雙雜交系統(tǒng),1.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理 酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。他的產(chǎn)生是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究. 基因轉(zhuǎn)錄不僅需要有特定的DNA順式序列結(jié)構(gòu),而且也需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 轉(zhuǎn)錄激活因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD), 它們都是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的BD或AD都不能激活基因轉(zhuǎn)錄,但不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。,如果要研究兩個蛋白之間有無相互作用,可以把這兩 個蛋白分別與DB和AD形成的融合蛋白。 與DB 融合的蛋白稱為“誘餌”(bait), 與AD融合的蛋白稱為“獵物”(prey)。 如果這兩個蛋白能發(fā)生相互作用, 這兩個融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子, 從而激活 報告基因(reporter gene)的轉(zhuǎn)錄與表達。 通過檢測報告基因的表達產(chǎn)物, 可判別“誘餌”和“獵物” 這兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。,1.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理,同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母,這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4,又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE,因此,酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時,功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1,從而通過功能互補和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。,1.2 酵母雙雜交操作主要流程 1. 分別構(gòu)建BD和AD融合蛋白載體 2. 分別將重組載體轉(zhuǎn)化酵母菌細胞 3. 對酵母轉(zhuǎn)化子進行自激活檢測 4. 將重組載體共轉(zhuǎn)化酵母菌細胞 5. 檢測報告基因表達產(chǎn)物 6. 分析酵母雙雜交實驗結(jié)果,,,BD,AD,BD,AD,,,,,,,,,,,BD,AD,,,,,,,,,,,,x,Y,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,實例,Method: For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2-pGADT7 (transcript variant 2) FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2-pGBKT7 (transcript variant ),,These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302) plasmids.,Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640,Yeast two hybrid assay. Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.,酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在酵母細胞內(nèi)分析蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含Transcription-activating domain的載體。另外還需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。,1.3 應(yīng)用,它可用于: 檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用; 分析蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域; 發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)。,1.4 酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)點: 是一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),比體外的蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)更接近生物體內(nèi)的真實情況。 基于基因重組技術(shù)和分子遺傳學的原理,更便于觀察和檢測實驗結(jié)果。 酵母菌是一種低等真核微生物,能反映真核生物的基本生命現(xiàn)象和規(guī)律。 4. 酵母菌生長迅速、容易培養(yǎng),便于進行高通量、大規(guī)模的組學研究。,1.5 酵母雙雜交技術(shù)的弱點: 1. 假陽性:自激活、多因子參與…… 假陰性:毒性蛋白、膜蛋白、難表達的蛋白…… 低等真核細胞不能完全等同于高等真核生物的情況 酵母雙雜交實驗的結(jié)果必須經(jīng)過多方面的驗證,包括: 體外相互作用驗證 體外親和純化(GST pull-down)、體外免疫共沉淀…… 哺乳動物細胞內(nèi)驗證 亞細胞共定位、體內(nèi)免疫共沉淀……,優(yōu)點:生理條件下的結(jié)合 缺點:可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,二、免疫共沉淀,2.1 定義及原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation):是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 原理:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x,那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。,2.2 方法 1) 收獲培養(yǎng)的細胞(1×107-1×108)冷PBS洗滌2次 2)細胞裂解液裂解細胞,冰浴30min 3) 12000rpm 離心 30min 4)收集上清并加入適量抗體,4oC搖動1h~過夜 5)加入ProteinA/G-Sepharose(瓊脂糖凝膠)懸液, 4oC搖動1h 6)細胞裂解液洗滌ProteinA/G-Sepharose混合液 7)離心棄上清 8)沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5-10min 9)離心,上清液跑SDS-PAGE 膠 10)考馬氏亮蘭染色、銀染 Western Blot 質(zhì)譜分析,3.注意事項 1)細胞裂解 采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經(jīng)驗確定。 不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種蛋白酶酶抑制劑,如商品化的cocktailer。 2)使用明確的抗體,有的抗體不適宜做免疫共沉淀。 3) 對照實驗的設(shè)計。,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,實例,,(A) Using the anti-CHD8 (abcam, ab84527) or the anti-CHD7 (abcam, ab31824) antibody for precipitation, we detected with the anti-HA antibody (Roche) an approximately 51 kDa band corresponding to the estimated size of FAM124B transcript variant 1. Lane 1: co-transfected Co-IP, lane 2: untransfected HeLa cells as negative control.,三、GST pull—down技術(shù),3.1 定義及原理 —定義:該技術(shù)是通過以適當標簽 和目的基因進行融合表達作為誘餌.從細胞提取物中釣出與目的蛋白相互作用的蛋白。多組分蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離主要利用固定在瓊脂糖樹脂的反標簽系統(tǒng)完成。 —原理:將誘餌蛋白質(zhì)和用谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-transferase,GST)標簽融合表達,一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液進行孵育.利用谷胱甘肽瓊脂糖球珠將GST-融合蛋白-目的蛋白復(fù)合物沉淀下來,然后進行聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS—PAGE) 鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì),兩種應(yīng)用: 1)確定融合(或探針)蛋白與未知(或靶)蛋白間的新的相互作用 2)證實探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用,3.2 方法: 1) GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育(a, 單一明確的重組蛋白;b,細胞裂解蛋白混合液;c, 體外翻譯cDNA表達得到的未知蛋白) 2)混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4oC 2h 3)離心棄上清 4)沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸,離心 5)取上清進行SDS-PAGE電泳, 6)考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶,進一步做質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白;電泳后的膠也可以做Western Blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意:該實驗設(shè)立GST對照,反應(yīng)均在4oC進行,,右邊為GST對照,3.3 GST 融合蛋白沉降實驗結(jié)果,CK2α′,GST-TP1,GST,Fig 10 GST pull down assay M: protein molecular weight standard Lane 1: GST Lane 2: GST-TP1+ CK2α′ Lane 3: CK2α',3.4 GST pull-down技術(shù)優(yōu)缺點,優(yōu)點: 融合蛋白親具有高通量性、高選擇性的特點,由于融合蛋白的多樣性以及表達系統(tǒng)的多樣性(如細菌、果蠅、哺乳動物),該方法能夠研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的相互作用。 缺點: 該方法的成功應(yīng)用取決于是否能夠得到足夠多,并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白,以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白的干擾。,四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) Fluorescence resonance energy transfer,4.1 熒光信號的產(chǎn)生 熒光基團在某波長的激發(fā)光刺激下,產(chǎn)生一個更長波長的發(fā)射光。,4.2 什么是FRET? 熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊,并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時,就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移,即FRET現(xiàn)象,使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多(熒光猝滅),而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(敏化熒光)實際相當于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽。,4.3 綠色熒光蛋白 60年代,Shimomura等首先從水母(Aequoria Victoria )中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren),該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母中提取的顆粒都呈綠色,后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明,在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后,水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光,GFP在藍光的激發(fā)下,產(chǎn)生綠色熒光 。,人們在GFP基因的基礎(chǔ)上已經(jīng)制造出藍色熒光蛋白,黃色熒光蛋白,青色熒光蛋白,又發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白。,其中蘭色熒光蛋白和綠色熒光蛋白, 青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,,Tsien & Miyawaki采用FRET技術(shù)檢測細胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。他們將CFP和YFP分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達于同一個細胞內(nèi)。當細胞內(nèi)具有高的Ca2+濃度時,鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽結(jié)合,可誘發(fā)FRET,使受體蛋白YFP發(fā)出黃色熒光,因此細胞呈黃色。當細胞內(nèi)Ca2+濃度低時,F(xiàn)RET幾乎不發(fā)生,因此檢測時CFP被激發(fā),發(fā)出綠色熒光,細胞呈綠色。,4.4 應(yīng)用,在生命科學領(lǐng)域,F(xiàn)RET技術(shù)是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具,可用于檢測某一細胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。正如前述,當供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團分子的吸收光譜重疊,并且兩個探針的距離在10nm范圍以內(nèi)時,就會產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。而在生物體內(nèi),如果兩個蛋白質(zhì)分子的距離在10nm之內(nèi),一般認為這兩個蛋白質(zhì)分子存在直接相互作用。,五、雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC) (Bimolecular Fluorescence Complementation),基本原理:方法利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)及其突變體的特性作為報告基因,將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段,再分別與目標蛋白連接.如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近,就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近,重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下,就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用,并且在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時間、位置、強弱等情況。,,將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段,分別與目標蛋白連接. 如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近,就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近,重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光,Identification of the SIRTUIN1 (SIRT1)-binding domain of BMAL1.,Binding of SIRT1 to BMAL1 deletion mutants was analyzed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). COS7 cells were transfected with plasmids encoding SIRT1-N-terminal of Venus (VN) and BMAL1-C-terminal of Venus (VC) wildtype (WT) or its various mutants (Δnuclear localization sequence [NLS], BMAL1 without a functional nuclear localization signal; Δbasic-helix-loop-helix [bHLH], encoding BMAL1 Δ71 to 140; ΔPer-Arnt-Sim [PAS]-A, BMAL1 Δ210 to 320; ΔPAS-B, BMAL1 Δ350 to 480; Δtranscriptional activation domain [TAD], BMAL1 Δ553 to 625). The images were captured by fluorescence imaging microscopy using specific filter sets for yellow fluorescent protein and red fluorescent protein.,六、蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育,洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后,可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點 。,Gong W. et al. (2008) Molecular Plant 1: 27-41.,其它蛋白互作技術(shù),串聯(lián)親和純化(TAP) 表面等離子共振(SPR) 噬菌體展示技術(shù)(phage display approach) 融合蛋白親和色譜法(protein fusion affinity chromatography) 原子作用力顯微技術(shù)(atomic force microscopy, AFM ),蛋白質(zhì)與DNA相互作用 (一)酵母單雜交系統(tǒng)(Yeast one-hybrid system) 該技術(shù)是上世紀90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù),在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用,并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。,基本原理:將順式作用元件與最基本啟動子(minimal promoter,Pmin)相連并將報告基因連到Pmin下游,將待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain, AD)融合表達載體導入酵母細胞,該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合,就激活Pmin啟動子,報告基因表達。,從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。,(二)噬菌體展示技術(shù),基本原理:將已知的啟動子DNA片段與固相支持物結(jié)合; 以改構(gòu)的噬菌體為載體,把待選基因片段(編碼啟動子DNA結(jié)合蛋白的cDNA)定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū),形成的融合蛋白表達在噬菌的表面,不影響噬菌體的生活周期及天然構(gòu)型。外源蛋白或多肽表達于噬菌體的表面,與固定或固相支持物結(jié)合,通過適當?shù)奶韵?,洗去非特異性結(jié)合的噬菌體(即親和富集法),選出目的噬菌體,而編碼基因作為病毒基因組的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序得知.,(三)DNAase I 足跡實驗,足跡試驗不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標蛋白,而且能告知目標蛋白結(jié)合在哪些堿基部位,足跡試驗的方法較多,常用的有DNase Ⅰ足跡試驗、硫酸二甲酯足跡試驗(dimethylsulfate,DMS),二者原理基本相同.,DNase Ⅰ足跡試驗的基本原理為: 蛋白結(jié)合在DNA片段上,保護結(jié)合部位不被DNase破壞,這樣,蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”,在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上,相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒有放射性標記條帶。,技術(shù)流程為: (1)待檢雙鏈DNA分子用P32作末端標記,通常只標記一端; (2)蛋白質(zhì)與DNA混合,等二者結(jié)合后,加入適量的DNase Ⅰ,消化DNA分子,控制酶的用量,使之達到每個DNA 分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂,同時設(shè)未加蛋白質(zhì)的 對照; (3)從DNA上除去蛋白質(zhì),將變性的DNA加樣在測序凝膠中 作電泳和放射性自顯影,與對照組相比后解讀出足跡部 位的核苷酸序列.,(四)CHIP (Chromatin Immunoprecipitation),染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù), 一種可用來確定與某一特定蛋白結(jié)合或蛋白定位所在的特異性DNA序列的技術(shù),(五)EMSA (電泳遷移率實驗),- 1.請仔細閱讀文檔,確保文檔完整性,對于不預(yù)覽、不比對內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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