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1、基于Aβ25—35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型研究定志小丸治療阿爾茲海默病的作用機制及配伍機制
摘要利用β-淀粉樣蛋白片段Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型，從細胞凋亡及氧化應(yīng)激兩個通路研究定志小丸對Aβ25-35引起的PC12神經(jīng)細胞損傷的保護作用，并將定志小丸拆方為單味藥及三味藥，用以說明定志小丸治療阿爾茲海默病的作用機制、配伍機制以及主要活性藥味。通過MTT和乳酸脫氫酶含量測定評估定志小丸及各味藥對PC12細胞活力的影響，其中人參、茯苓效果最好，與模型組相比，可使細胞活力提高約30%。通過細胞凋亡、線粒體膜電位〔MMP〕、丙二醛〔MDA〕及復(fù)原型谷胱甘肽〔GSH〕含量測定，進一步
2、從細胞凋亡及氧化應(yīng)激兩個通路研究定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞保護作用，研究結(jié)果說明，人參、茯苓效果最優(yōu)，不僅可以顯著抑制細胞凋亡，還可降低丙二醛〔MDA〕含量，減少膜脂過氧化；遠志、石菖蒲可以通過提高細胞內(nèi)復(fù)原型谷胱甘肽〔GSH〕含量進而抑制氧化應(yīng)激損傷，且與人參、茯苓配伍后，可促進主要成分發(fā)揮藥效，顯著提高人參、茯苓的藥效。人參、茯苓是定志小丸中的主要活性藥味，遠志、石菖蒲起輔助增強藥效的作用。關(guān)鍵詞定志小丸；拆方；配伍作用；Aβ25-35；PC12細胞；細胞凋亡；氧化應(yīng)激1引言阿爾茨海默病〔AD〕是一種以認知能力喪失為特征的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、認知
3、功能障礙、人格改變以及語言障礙。由于缺乏有效的治療藥物，使得AD對患者及其家人都是一種消滅性的疾病【1】。目前，AD的發(fā)病機制仍不十清楚確，β-淀粉樣蛋白〔Aβ〕沉積形成老年斑后，誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷甚至死亡，進而導(dǎo)致認知功能進行性退化，是目前公認的主要發(fā)病機制之一[2，3]。因此，大量研究致力于篩選抗氧化劑和抗凋亡藥物作為潛在的AD治療藥物[4～9]。中藥復(fù)方雖然成分復(fù)雜，但可以通過多成分作用于疾病相關(guān)的多個靶點而發(fā)揮協(xié)同治療作用，效果好且副作用較少，這與現(xiàn)代藥物集中單一靶點治療疾病不同。越來越多的學(xué)者致力于研究中藥對于AD的預(yù)防以及治療作用[4，10～15]。定志小丸〔DZX
4、W〕，源于唐代孫思邈的?備急千金要方?，由人參〔GR〕、茯苓〔P〕、遠志〔PR〕和石菖蒲〔ATR〕四味藥按照質(zhì)量比3∶3∶2∶2的比例組成，人參為“君藥〞，茯苓為“臣藥〞，遠志和石菖蒲為“佐藥〞，已在臨床上應(yīng)用多年，主要用于治療抑郁癥、焦慮癥、神經(jīng)衰弱、阿爾茨海默病及帕金森病等病癥[16～18]。之前的研究已經(jīng)確定了定志小丸中的64種主要活性成分，包括人參皂苷、三萜類化合物、遠志皂苷、寡糖酯、蔗糖酯、山酮糖苷等[19]。在藥理學(xué)研究方面，目前大局部研究都集中于人參、遠志單味藥或某一種有效成分對于AD的治療作用[20～23]，定志小丸的作用機制及配伍機制尚不明確[24]。為了評價藥物對AD的潛在
5、治療效果，目前已建立了多種細胞模型用以研究藥物對神經(jīng)細胞的保護作用，常用細胞模型有研究腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子作用所使用的轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞系[10，25～27]，以及研究Aβ蛋白沉積導(dǎo)致細胞毒性和神經(jīng)元損傷所使用的Aβ誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型[3，15，20，21，28，29]，其中Aβ誘導(dǎo)的PC12損傷模型是目前應(yīng)用最為廣泛的AD治療藥物體外活性評價模型。Aβ聚集后可以通過氧化應(yīng)激、細胞凋亡等多種機制造成AD患者神經(jīng)元大量喪失和突觸損傷[30]，在AD的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。大量研究通過考察PC12細胞在Aβ蛋白介導(dǎo)下的氧化應(yīng)激及細胞凋亡通路的變化考察藥物對AD的治療效果，如通過參加花青素
6、可以顯著提高PC12細胞抗氧化應(yīng)激能力【7】，參加淫羊藿素后可以抑制細胞凋亡、減少LDH泄露及線粒體膜電位的降低[31]。本研究使用Aβ蛋白誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型研究定志小丸對神經(jīng)細胞損傷的保護作用，選擇Aβ蛋白中毒性最強的Aβ25-35活性片段[32]?？疾炝硕ㄖ拘⊥柙诩毎蛲龊脱趸瘧?yīng)激兩種機制下對PC12細胞的保護作用，其中細胞凋亡通路主要通過MTT實驗、LDH漏出量測定、流式細胞儀檢測細胞凋亡〔ANNEXINV-FITC/PI雙染色法及線粒體膜電位〕等方面進行檢測；氧化應(yīng)激通路主要檢測與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的抗氧化劑復(fù)原型谷胱甘肽〔GSH〕及膜脂過氧化的重要產(chǎn)物丙二醛〔MDA〕的含量
7、變化。為了說明定志小丸的作用機制、配伍機制及主要活性藥味，除定志小丸外，還將其拆方成單味藥GR、P、PR、ATR及三味藥GR+P+PR、GR+P+ATR、GR+PR+ATR、P+PR+ATR，通過比較在細胞凋亡及氧化應(yīng)激通路上對PC12細胞的保護作用的差異，說明方法參考文獻[33]，取50g的定志小丸用75%乙醇回流提取2次，每次提取時間為2h，提取液為生藥量的8倍。合并兩次提取液，過濾、減壓濃縮至50mL，得到定志小丸質(zhì)量濃度即生藥量為1g/mL的提取液。拆方后的單藥和三味藥的提取方法與定志小丸提取方法相同。2.3Aβ25-35老化處理參照文獻[34]的方法，將Aβ25-35用高壓滅菌PBS
8、〔KH2PO4-NaHPO4，10mmol/L，pH=7.2〕緩沖鹽溶液配制成濃度為1mmol/L的溶液，37℃孵育72h，使用時用高壓滅菌PBS緩沖鹽溶液稀釋為20μmol/L[35]。2.4PC12細胞培養(yǎng)及MTT檢測細胞活力PC12細胞培養(yǎng)于含10%〔V/V〕胎牛血清〔FBS〕的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并參加1%青霉素-鏈霉素溶液。在含有5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，2～3天傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。使用MTT法檢測細胞活力，實驗分4組：空白組、對照組、Aβ25-35模型組及Aβ25-35和中藥提取液共同作用組。將PC12細胞以4103/孔的密度種于96孔板
9、上，培養(yǎng)24h后，共同作用組將培養(yǎng)基替換為100μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基溶解的不同濃度的中藥提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，其它3組更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。隨后參加Aβ25-35誘導(dǎo)損傷24h，其中對照組只更換培養(yǎng)液，不參加Aβ25-35。棄去培養(yǎng)液，參加100μL1mg/mLMTT孵育4h后，去除MTT溶液，并參加150μLDMSO振蕩10min。使用酶標儀檢測570nm波長下的吸光度值，計算細胞存活率〔Survivalrate，SR〕。2.5ANNEXINV-FITC/PI檢測細胞凋亡PC12細胞接種于6孔板，使用藥物及Aβ25-35干預(yù)后，收集各組細胞，使用冰PBS清洗兩次。
10、使用試劑盒內(nèi)緩沖鹽懸浮細胞，300g離心10min，再用緩沖鹽重懸細胞，將細胞稀釋至1106個/mL。每管參加100μL細胞及5μLAnnexinV-FITC，室溫下避光混勻10min后，再參加5μLPI室溫避光孵育5min。參加PBS至500μL，輕輕搖勻，孔徑75μm〔200目〕尼龍網(wǎng)過濾，使用流式細胞儀檢測：FITC：激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm；PI：激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長615nm。2.6線粒體膜電位〔MMP〕檢測將PC12細胞接種于6孔板，使用藥物及Aβ25-35干預(yù)后，收集各組細胞〔約1106個/mL〕，使用預(yù)熱的PBS緩沖液洗滌兩次，將羅丹明123參加至細胞懸液
11、。37℃下孵育30min，粒徑75μm〔200目〕尼龍網(wǎng)過濾后，使用流式細胞儀分析，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。2.7乳酸脫氫酶〔LDH〕含量測定使用LDH測定試劑盒，通過受損細胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH定量測定PC12細胞的損傷。經(jīng)藥物和Aβ25-35處理后，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒測定方法處理樣品，使用酶標儀測定450nm吸光度值，使用RIPA細胞裂解液裂解細胞，高速離心后，使用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度。2.8復(fù)原型谷胱甘肽〔GSH〕含量測定將細胞接種于96孔板，使用藥物及Aβ25-35干預(yù)后，用冰PBS清洗2次，使用RIPA細胞裂解液裂解細胞，高速離心后，
12、使用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，GSH含量用試劑盒測定。2.9丙二醛〔MDA〕含量測定將PC12細胞接種于6孔板，干預(yù)結(jié)束后使用冰PBS清洗2次，使用RIPA裂解細胞，離心取上清液，先進行蛋白定量分析，使用MDA試劑盒測定MDA含量。2.10統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)〔x〕標準差異。3結(jié)果與討論3.1定志小丸、拆方后單藥、三味藥及Aβ25-35對PC12的細胞毒性由表1可知，生藥量為1mg/mL的9種中藥提取物作用于PC12細胞48h后，細胞活力與對照組并沒有顯著性差異，在此濃度下，藥物對于細胞并無毒性，因此選取1mg/mL生藥量作為后續(xù)實驗
13、的加藥濃度。3.2定志小丸及拆方后單藥、三味藥對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞毒性的抑制作用圖1所示，與對照組相比，模型組Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞的活力明顯下降，說明20μmol/LAβ25-35對PC12細胞有明顯的毒性，參加1mg/mL的不同中藥提取物后，PC12細胞活力顯著增加，其中人參、茯苓效果最為明顯。3.3定志小丸及拆方后的各味藥對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響AnnexinV-FITC可與磷脂酰絲氨酸〔Phasphatidylserine，PS〕特異性結(jié)合。在細胞凋亡早期，細胞膜失去對稱性，PS暴露于細胞膜外，可被AnnexinV-FITC結(jié)合，從而成為識別
14、細胞凋亡的標志。但是壞死細胞的PS同樣外路露于細胞膜外，因此參加碘化吡啶〔PI〕以區(qū)分壞死細胞。凋亡早期細胞膜仍保持完整性，PI不能進入細胞內(nèi)，而處于凋亡晚期和壞死的細胞可同時被AnnexinV-FITC/PI著色，可以準確反映凋亡過程。流式細胞儀AnnexinV-FITC雙染法檢測結(jié)果顯示，PC12細胞在培養(yǎng)或處理過程中有自發(fā)凋亡的現(xiàn)象，但凋亡率較低〔圖2A〕，經(jīng)20μmol/LAβ25-35處理24h后，凋亡細胞顯著增加，凋亡率到達71.4%〔圖2B〕。經(jīng)單味藥人參、茯苓〔圖2C、D〕處理后，細胞凋亡率顯著降低，說明觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化采用ANNEXINV-FITC/PI雙染色法研究細
15、胞凋亡變化和細胞損傷。該方法可將早、中、晚期及死細胞區(qū)分開來。正常的活細胞，ANNEXINV-FITC和PI均為低染，不著色；細胞凋亡早期，ANNEXINV-FITC高染，細胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，PI低染，細胞核不著色；細胞凋亡中、晚期，ANNEXINV-FITC和PI均高染，細胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，細胞核呈現(xiàn)紅色熒光[36]。如圖3所示，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，對照組〔圖3A〕所選區(qū)域無明顯細胞異常且無凋亡細胞，模型組〔圖3B〕中PC12細胞顯示出核聚集，細胞突起回縮，PI染色發(fā)出紅色熒光。經(jīng)定志小丸提取物處理后的細胞〔圖3C-3K〕其細胞凋亡發(fā)生了顯著的改善。其中，經(jīng)人參、茯苓和定志小丸處理過的
16、細胞變化尤為明顯，無凋亡晚期細胞，且細胞形態(tài)與健康細胞并無明顯差異。3.5定志小丸及各味藥抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞線粒體膜電位的下降線粒體膜電位〔MMP〕在啟動線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中起關(guān)鍵作用。MMP降低是細胞凋亡早期的重要特征之一[37]。如圖4A所示，與對照組相比，參加Aβ25-35作用24h后，MMP顯著降低，PC12細胞經(jīng)中藥提取物處理后再參加20μmol/LAβ25-35作用24h，MMP均有顯著升高。說明定志小丸及拆方后的各味藥均能抑制Aβ25-35帶來的MMP降低，其中人參、茯苓單味藥效果最為顯著。3.6定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞中LDH釋放的
17、影響當(dāng)PC12細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時，細胞處于易損狀態(tài)，LDH漏出率會明顯增加[38]。LDH水平越高，說明其細胞損傷越嚴重。如圖4B所示，模型組LDH漏出率高出對照組70%，經(jīng)定志小丸及拆方后各味藥保護后，均可以顯著抑制LDH漏出，其中人參、茯苓單味藥效果最好，抑制漏出率可達40%以上。3.7定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞內(nèi)MDA含量的影響MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，其含量上下可以作為考察細胞受損程度的指標之一，MDA的主要危害是導(dǎo)致膜脂過氧化，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，使得細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進行[39]。如圖4C所示，模
18、型組與對照組相比，MDA含量顯著升高，說明Aβ25-35可以造成細胞膜脂質(zhì)過氧化，經(jīng)定志小丸及拆方后各味藥保護后，MDA含量有不同程度降低，其中人參、茯苓單味藥效果最好。3.8定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞GSH含量的影響GSH是細胞內(nèi)主要的非蛋白巰基化合物，是細胞中含量很高的一種抗氧化劑，其含量的微小變化就可以影響細胞的氧化復(fù)原平衡，因此在保護細胞抵抗氧化應(yīng)激方面具有重要的作用[40，41]。經(jīng)定志小丸提取物作用后的PC12細胞中GSH含量均顯著性增加，其中遠志、石菖蒲單藥作用效果最好〔圖4D〕。4結(jié)論本研究構(gòu)建了Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型，從細胞凋亡和氧化
19、應(yīng)激兩個角度對定志小丸治療AD的作用機制及配伍機制進行了研究。通過比較定志小丸及其對應(yīng)的單味藥及三味藥在細胞凋亡及氧化應(yīng)激通路上對PC12細胞保護作用的差異，說明了定志小丸配伍的科學(xué)合理性：人參、茯苓在維持細胞活力方面發(fā)揮主要作用，同時可以顯著降低MDA含量，減少氧化應(yīng)激損傷，是定志小丸中的主要活性藥味；遠志、石菖蒲可促進GSH增加，主要通過中藥配伍后的協(xié)同作用促進人參與茯苓兩味藥的治療效果。本研究結(jié)果說明，Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型，是一種簡單、穩(wěn)定、實驗周期短的細胞模型，不僅可以用于評價藥物治療AD的療效和研究其作用機制，并且還可以用于闡釋復(fù)方中藥的配伍機制。Referenc
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基于Aβ25—35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型研究定志小丸治療阿爾茲海默病的作用機制及配伍機制
