高中生物選1血紅蛋白的提取和分離

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1、人 教 版 選 修 1 專 題 5 DNA和 蛋 白 質(zhì) 技 術(shù)課 題 3 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 分 離 一 、 基 礎(chǔ) 知 識 ：（ 一 ） 蛋 白 質(zhì) 提 取 和 分 離 原 理 （ 二 ） 蛋 白 質(zhì) 提 取 和 分 離 的 方 法 1、 凝 膠 色 譜 法 ： 又 稱 分 配 色 譜 法 2、 電 泳 法（ 三 ） 緩 沖 溶 液 二 、 實 驗 操 作 實 驗 步 驟 血 液 組 成 成 分 1.洗 滌 紅 細 胞 2.釋 放 血 紅 蛋 白 3.分 離 血 紅 蛋 白 4.透 析 血 紅 蛋 白樣 品 處 理和 粗 分 離純 化純 度 鑒 定 蛋 白 質(zhì) 提 取 與 分

2、離 的 依 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 的 物 理 化 學(xué) 性 質(zhì) 差 異 ： 1.分 子 的 形 狀 、 大 小 2.電 荷 性 質(zhì) 和 多 少 3.溶 解 度 4.吸 附 性 質(zhì) 5.對 其 他 分 子 親 和 力 1.凝 膠 色 譜 法 1） 原 理 ：2） 材 料 ： 凝 膠大 分 子 通 過 多 孔 凝 膠 顆 粒 的 間 隙 ， 路 程 短 ， 流 動 快 ；小 分 子 穿 過 多 孔 凝 膠 顆 粒 的 內(nèi) 部 ， 路 程 長 ， 流 動 慢 。凝 膠 是 微 小 的 多 孔 性 球 體 ， 如 葡 聚 糖 或 瓊 脂 糖 。內(nèi) 部 有 許 多 貫 穿 的 通 道 .根 據(jù) 相 對 分 子

3、質(zhì) 量 的 大 小 分 離 蛋 白 質(zhì) 的 方 法概 念 ： 洗 脫 ： 從 色 譜 柱 上 端 不 斷 注 入 緩 沖 液 ， 促 使 蛋 白 質(zhì) 分 子 的 差 速 流 動 ?；?合 物上 柱 洗脫 大 分 子 流 動 快小 分 子 流 動 慢 收 集大 分 子 收 集小 分 子 2 凝 膠 電 泳 法 ：1） 原 理 ：不 同 蛋 白 質(zhì) 的 帶 電 性 質(zhì) （ 正 電 荷 或 負 電 荷 ） 、 電 量 、形 狀 和 大 小 不 同 ， 在 電 場 中 受 到 的 作 用 力 大 小 、 方 向 、阻 力 不 同 ， 導(dǎo) 致 不 同 蛋 白 質(zhì) 在 電 場 中 的 運 動 方 向 和

4、運動 速 度 不 同 。2） 影 響 蛋 白 質(zhì) 分 子 運 動 速 度 的 因 素電 泳 ： 帶 電 粒 子 在 電 場 的 作 用 下 發(fā) 生 遷 移 的 過 程思 考 ： 蛋 白 質(zhì) 為 什 么 帶 有 電 荷 ？在 一 定 的 PH下 ， 蛋 白 質(zhì) 可 解 離 的 基 團 會 帶 上 電 荷 影 響 蛋 白 質(zhì) 分 子 運 動 速 度 的 因 素 決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電 荷 性 質(zhì)電 荷 量分 子 形 狀分 子 大 小 3） 常 用 電 泳 方 法 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 加 入

5、 帶 負 電 荷 多 的 SDS， 形 成 “ 蛋 白 質(zhì) SDS復(fù) 合 物 ” ， 使 蛋 白 質(zhì) 遷 移 速 率 僅取 決 于 分 子 大 小 。 由 弱 酸 和 相 應(yīng) 的 強 堿 弱 酸 鹽 溶 解 于 水 中 。如 H 2CO3/NaH CO3， NaH 2PO4/Na2H PO4等緩 沖 溶 液 洗 脫 劑1） 作 用 ： 2） 配 制 ：調(diào) 節(jié) 酸 和 鹽 的 用 量 ， 可 配 制 不 同 pH 的 緩 沖 液 。抵 制 外 界 酸 堿 對 溶 液 pH 的 干 擾 而 保 持 pH 穩(wěn) 定 ,從 而維 持 蛋 白 質(zhì) 空 間 結(jié) 構(gòu) 。 思 考 ： 如 何 配 制 不 同 P

6、H值 不 同 的 緩 沖 液 ？ 血 液 組 成 成 分閱 讀 思 考 ：1. 血 液 由 _和 _兩 部 分 組 成 。2. 血 細 胞 中 _細 胞 數(shù) 量 最 多 ， 細 胞 的 含 量 最高 的 有 機 化 合 物 是 _。3. 該 化 合 物 是 由 _和 _構(gòu)成 的 ， 其 中 每 個 亞 基 中 都 含 有 一 個 能 與 O2和CO2結(jié) 合 的 _基 團 。血 漿 血 細 胞紅 細 胞 血 紅 蛋 白2條 -肽 鏈 2條 -肽 鏈 亞 鐵 血 紅 素 1.洗 滌 紅 細 胞閱 讀 思 考 ： 洗 滌 的 目 的 是 什 么 ？ 洗 滌 的 方 法 是 什 么 ？洗 滌 干 凈

7、的 標(biāo) 志 是 什 么 ？血 液100mL3g檸 檬 酸 鈉 低 速 離 心2 min 紅 細 胞血 漿吸 出 血 漿 紅 細 胞5倍 體 積 生 理 鹽 水?dāng)?拌 10min重 復(fù) 洗 滌 3次 ， 直 至 上 清 液 沒 有 黃 色 其 他 血 細 胞 2.釋 放 血 紅 蛋 白閱 讀 思 考 ：1. 釋 放 血 紅 蛋 白 過 程 中 ， 在 洗 滌 好 的 紅 細 胞 加 入 了哪 些 物 質(zhì) ？2. 為 了 加 速 釋 放 過 程 ， 采 取 了 什 么 措 施 ？目 的 分 析 ：1. 蒸 餾 水 的 作 用 是 _。2. 加 入 甲 苯 的 作 用 是 _。3. 充 分 攪 拌

8、的 目 的 是 _。使 紅 細 胞 大 量 吸 水 脹 裂溶 解 紅 細 胞 的 細 胞 膜加 速 紅 細 胞 的 破 裂為 什 么 加 入 甲 苯 而 不 是 其 他 的 無 機 溶 劑 ？ 濾 紙過 濾脂 類 物 質(zhì)3.分 離 血 紅 蛋 白分 離 過 程紅 細 胞混 合 液高 速 離 心10min 離 心管 燒 杯 有 機 溶 劑血 紅 蛋 白 20mmol/L磷 酸 緩 沖 液4、 透 析 血 紅 蛋 白透 析 的 目 的 是 什 么 ？1mL 1mL去 除 血 紅 蛋白 中 的 小 分子 雜 質(zhì) 純 化 方 法 本 實 驗 采 用 凝 膠 色 譜 法1.凝 膠 色 譜 柱 的 制 作

9、 ：2.凝 膠 色 譜 柱 的 裝 填 ：3.樣 品 的 加 入 和 洗 脫 步 驟 操 作 要 求 立 刻 用 磷 酸 緩 沖 液 洗 滌 平 衡 12h洗 滌 平 衡 一 次 性 緩 慢 倒 入 ； 輕 輕 敲 打裝 填 懸 浮 液 凝 膠 顆 粒 蒸 餾 水 充 分 溶 脹根 據(jù) 色 譜 柱 體 積 計 算 凝 膠 用 量色 譜 柱 垂 直 固 定 在 支 架 上配 制 懸 浮 液計 算 稱 量 凝 膠固 定 色 譜 柱材 料 ： 交 聯(lián) 葡 聚 糖 凝 膠 G-75 20mmol/L磷 酸 緩 沖 液“ G” 表 示 什 么 ？ 75代 表 什 么 ？2、 凝 膠 色 譜 柱 的 裝

10、填 3、 樣 品 的 加 入 和 洗 脫 1.調(diào) 液 面 2.加 樣 3.再 調(diào) 液 面 4.洗 脫 5.收 集緩 沖 液凝 膠 注意事項 注 意 事 項1、 紅 細 胞 的 洗 滌 ： 洗 滌 次 數(shù) 不 能 過 少 ； 低 速 、 短 時 離 心 。2、 色 譜 柱 的 裝 填 ：裝 完 后 ， 立 即 用 緩 沖 液 洗 滌 、 平 衡 凝 膠 使 裝 填 盡 量 緊 密 ， 降低 顆 粒 間 隙 ； 無 氣 泡 ； 洗 脫 液 不 能 斷 流 。3、 凝 膠 的 預(yù) 處 理 ： 沸 水 浴 時 間 短 ， 還 能 除 去 微 生 物 和 氣 泡4、 色 譜 柱 成 功 標(biāo) 志 ： 紅

11、色 區(qū) 帶 均 勻 一 致 地 移 動 。 否 則 容 易 使 白 細 胞 、血 小 板 、 淋 巴 細 胞 等 其他 血 細 胞 同 紅 細 胞 一 塊兒 沉 淀 ， 而 無 法 將 紅 細胞 分 離 ！ 純 度 鑒 定 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 判 斷 純 化 的 蛋 白 質(zhì) 是 否 達 到 要 求 ， 需 進 行 蛋白 質(zhì) 純 度 鑒 定 ， 使 用 最 多 的 是 SDS-聚 丙 烯 酰 胺凝 膠 電 泳 知 識 總 結(jié)血紅蛋白的提取和分離 蛋 白 質(zhì) 分 子 的 差 異 性凝 膠 色 譜 法 原 理 分 離 過 程凝 膠 電 泳 法緩 沖 溶 液 組 成 作 用蛋 白 質(zhì) 的提 取 分 離 樣 品 處 理 粗 分 離純 化純 度 鑒 定