紫外分光光度法測定氨茶堿的含量.ppt

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實驗四：紫外分光光度法測定氨茶堿的含量,紫外-可見分光光度法（藥典相關規(guī)定）,1.對溶劑的要求含雜原子的有機溶劑，通常具有末端吸收。因此，它們的適用范圍不能小于截止波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm。另外，當溶劑不純時，也可能增加干擾吸收。因此，在測定樣品前，應先檢查所用溶劑在樣品所用波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度在220-240nm范圍內不超過0.4，在241-250nm范圍內不得超過0.2，在251-300nm范圍內不得超過0.10，在300nm以上時不得超過0.05.,測定法,應以配制樣品溶液的同批溶劑為空白對照，吸收峰波長應在該品種項下規(guī)定的波長2nm以內，并以吸光度最大的波長為測定波長。,含量測定,（1）對照品比較法（2）吸收系數(shù)法,（3）計算分光光度法（4）比色法樣品本身在紫外-可見區(qū)沒有強吸收，或在紫外區(qū)雖有吸收但為避免干擾或提高靈敏度，可加入適當?shù)娘@色劑顯色后測定。,藥物其他分析定量方法,標準曲線法也稱外標法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法。與分光光度分析中的標準曲線法相似，首先用欲測組分的標準樣品繪制標準曲線。內標法,標準曲線法,標準曲線的橫坐標(X)表示可以精確測量的變量(如標準溶液的濃度)，稱為普通變量，縱坐標(Y)表示儀器的響應值(也稱測量值，如吸光度、電極電位等)，稱為隨機變量。當X取值為X1,X2,……Xn時，儀器測得的Y值分別為Y1,Y2,……Yn。將這些測量點Xi,Yi描繪在坐標系中，用直尺繪出一條表示X與Y之間的直線線性關系，這就是常用的標準曲線法。用作繪制標準曲線的標準物質，它的含量范圍應包括試祥中被測物質的含量，標準曲線不能任意延長。,標準曲線法的優(yōu)點是：繪制好標準工作曲線后測定工作就變得相當簡單，可直接從標準工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。標準曲線法的缺點是：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應性能，柱溫，流動相流速及組成，進樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品（或已知準確含量的樣品），而實際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測量帶來一定的誤差。,內標法,內標法internalstandardmethod是色譜分析中一種比較準確的定量方法，尤其在沒有標準物對照時，此方法更顯其優(yōu)越性。它尤其廣泛的應用于高效液相色譜中。這種方法可以抵消儀器和操作過程帶來的誤差。內標法是將一定重量的純物質作為內標物加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對含有內標物的樣品進行色譜分析，分別測定內標物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子，內標物在色譜圖上得到分離的峰。根據(jù)已知含量的內標物的峰面積和樣品的峰面積，計算組分的百分含量。,內標物的選擇要符合以下要求：（1）內標物的峰與組分峰能完全分離。（2）內標物峰在色譜圖上出現(xiàn)的位置，最好在欲定量組分峰的鄰近位置。如果樣品中有幾個組分需要定量，并且他們的k’值差別較大，這時就需要用幾個內標物來作定量測定。（3）內標物的性質和濃度盡量與預測定峰的接近。（4）內標物是樣品中不存在的，與樣品各組分、柱填料和移動相不發(fā)生化學反應。,內標法優(yōu)缺點,優(yōu)點：內標法能夠消除大部分的誤差，如儀器造成的。外標法無法消除，需要求儀器不產生誤差。缺點：操作復雜。,實驗目的,了解紫外分光光度法檢測藥物含量的原理；熟悉紫外分光光度計的基本構造和功能；掌握紫外分光光度法檢測藥物含量基本過程;掌握標準曲線的建立方法。,實驗原理,單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，即朗伯-比爾定律，這是吸收光譜法定量的理論依據(jù)，其關系式如下A=ECL式(3-1)式中A為吸收度；E為吸收系數(shù)，即單位濃度、單位液層厚度的吸收度數(shù)值；C為溶液濃度；L為液層厚度。紫外-可見分光光度法是根據(jù)物質分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立的光譜分析方法。其主要特點為：靈敏度高，可達10-4g/ml～10-7g/ml；準確度高，相對誤差為2％-5％。中藥中有紫外吸收的成分或本身有顏色的成分，在一定的濃度范圍內，其溶液的吸收度與濃度符合朗伯-比爾定律，均可用此法進行分析。,實驗儀器與材料,實驗儀器：紫外分光光度計、精密天平、石英比色皿、50ml燒杯、玻璃棒、稱量紙、10ml容量瓶、25ml容量瓶、洗瓶。實驗材料：氨茶堿原料、氨茶堿標準品、蒸餾水、氫氧化鈉。0.01MNaOH溶液的配制：稱取氫氧化鈉0.4g，用蒸餾水定容至1000ml，即得。,實驗方法,標準品溶液的制備：精密稱取氨茶堿對照品12.5mg置于25mL容量瓶中，先用少量0.01M的NaOH溶液振搖使溶解，再用該溶液定容至刻度，配成濃度為0.5mg/mL的標準儲備液；樣品溶液的制備：精密稱取氨茶堿原料藥12.5mg，置于25ml容量瓶中，用0.01MNaOH溶液溶解并定容至刻度，搖勻，再從中取出0.2ml定容至10ml，即得氨茶堿樣品溶液。,一、標準曲線的建立,精密吸取氨茶堿標準儲備液分別為100、150、200、250、300μl于10mL容量瓶中，然后用0.01M的NaOH溶液定容至刻度，搖勻，照紫外分光光度法在275nm波長處測定吸光度，并以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，進行線性回歸，并建立標準曲線。,二、氨茶堿樣品含量測定,取已配制好的氨茶堿樣品溶液適量，置于石英比色皿中，采用紫外分光光光度法在275nm波長處測定溶液中氨茶堿吸光度，最后通過標準曲線計算樣品中氨茶堿的含量。,實驗結果,1.標準曲線方程、相關系數(shù)及繪圖。2.氨茶堿樣品含量。,思考題：,1.標準曲線方程中對相關系數(shù)r值有何要求？2.標準曲線制備中，各點濃度取值范圍是根據(jù)什么確定的？3.實驗中為什么選擇用0.01M的NaOH溶液作為溶劑來溶解氨茶堿。,