紫外分光光度法的原理.ppt

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第七章紫外分光光度法的原理和應(yīng)用,一.比色分析的原理：光是一種電磁波，它的波長(zhǎng)用nm或?為單位，人的眼睛所能感覺(jué)到的光波長(zhǎng)約400～760nm，這之間的光波稱為可見(jiàn)光。短于400nm的叫紫外線，短于200nm的叫遠(yuǎn)紫外線，再短的就是X射線和γ射線了。長(zhǎng)于760nm的叫紅外線，紅外線可長(zhǎng)達(dá)5mm，再長(zhǎng)的就是無(wú)線電波了。普通的日光、白熾燈光稱為發(fā)射光，將這種日光或白熾光通過(guò)棱鏡可以分解為紅、橙、黃、,,綠、藍(lán)、青、紫等組成的光譜，稱為發(fā)射光譜。如果在白熾燈光與棱鏡之間放一個(gè)有色溶液的玻璃皿，則通過(guò)棱鏡后的光譜上會(huì)出現(xiàn)一處或幾處暗帶，這種帶有暗帶的光譜稱為該有色溶液的吸收光譜，吸收光譜顯示該溶液對(duì)光的選擇性吸收的特性。溶液所呈現(xiàn)的顏色是它的吸收光譜中透過(guò)最多、吸收最少的那部分波長(zhǎng)光線的顏色，而暗帶部分則是它透過(guò)最少、吸收最多的那部分波長(zhǎng)光線的顏色。不同分子的原子團(tuán)和原子，它的發(fā)射光譜和吸收光譜不同。因此可以根據(jù)其光譜的特征和,,強(qiáng)度研究化合物的結(jié)構(gòu)和測(cè)定其含量，稱為光譜分析法，這也是比色分析的原理。根據(jù)發(fā)射光譜分析的如火焰發(fā)射光譜法（又稱火焰光度法，分析鈉、鉀、鈣），熒光光度和熒光分光光度法（根據(jù)熒光的發(fā)射強(qiáng)度進(jìn)行分析）。根據(jù)吸收光譜分析的方法又稱吸光光度法，如應(yīng)用可見(jiàn)光的吸收光譜進(jìn)行分析的普通的分光光度計(jì)和分光光度法；用紫外光的吸收光譜進(jìn)行分析的叫紫外分光光度計(jì)和紫外分光光度法；用原子的吸收光譜進(jìn)行分析的方法叫原子吸收分光光度計(jì)和原子吸收分光光度法。,硒-鄰苯二胺絡(luò)合物的吸收光譜特征吸收峰332.5nm,氧化鈥的吸收光譜,,二.郎伯-比爾定律：當(dāng)一束單色入射光[I0]通過(guò)厚度為L(zhǎng)、濃度為C的有色溶液后，所透過(guò)光的強(qiáng)度[I1]與溶液厚度L及濃度C成負(fù)指數(shù)乘積的關(guān)系：I1=I010－KLC如果物質(zhì)在溶液中的濃度和顯色強(qiáng)度成正比，則可以應(yīng)用郎伯-比爾定律通過(guò)比色方法從顯色強(qiáng)度求濃度，這是比色分析的原理。,入射光強(qiáng)度I0透過(guò)光強(qiáng)度I1溶液厚度L（比色杯直徑）,,,,,I1=I010－KLC移項(xiàng)成：I1/I0=10－KLC式中K為常數(shù)，可因物質(zhì)的吸光特性和采用單色光的波長(zhǎng)不同而有所不同，與溶液的厚度和濃度無(wú)關(guān)。上式寫成以10為底的對(duì)數(shù)，Iog(I1/I0)=－KLC，再以透光度T=I1/I0時(shí)，則上式成為IogT=－KLC或者－IogT=KLC。I1/I0稱為透光度或透光率，表示透過(guò)光強(qiáng)度是入射光強(qiáng)度的百分之幾，其數(shù)值只能＜1，從0~100%。為了方便起見(jiàn)，經(jīng)常用透光度的負(fù)對(duì)數(shù)－IogT來(lái)表示溶液吸收光線的情況，并稱為吸光度(ABS)、消光度(E)、或光密度(OD或D)，這樣，ABS=KLC,,該式說(shuō)明溶液的吸光度和濃度C、厚度L之間皆成正比關(guān)系。當(dāng)厚度一定時(shí)，溶液的濃度增加，則吸光度成正比地增加，這就是比色分析的依據(jù)。實(shí)際使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚度，它是相對(duì)固定的，有0.5、1、2、4cm的比色杯，使用最多的是1cm的比色杯。比色分析中有時(shí)也用透光度做單位，根據(jù)透光度的負(fù)對(duì)數(shù)－IogT=吸光度，透光率為100%時(shí)，吸光度=－Iog1=0，而透光率為1%時(shí)，吸光度=－Iog0.01=2，二者間呈對(duì)數(shù)指數(shù)關(guān)系。當(dāng)然，只有溶液的濃度和吸光度之間成直線,,正比關(guān)系時(shí)才能進(jìn)行比色分析，如果溶液的吸光度與濃度不成正比（不符合郎伯-比爾定律），則不能使用比色分析。有時(shí)，溶液的濃度只在一定范圍內(nèi)和顯色成直線正比關(guān)系，而濃度超過(guò)一定限度時(shí)，失去正比關(guān)系，則不能一概地用比色結(jié)果換算，通常都要研究測(cè)定方法中什么濃度范圍內(nèi)二者成直線正比關(guān)系；或者繪制一系列濃度和吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)濃度增加到一定限度，標(biāo)準(zhǔn)曲線發(fā)生彎曲、變折，說(shuō)明超過(guò)該濃度時(shí)，要對(duì)溶液進(jìn)行稀釋才能用來(lái)比色分析。,,可見(jiàn)光、紫外、熒光分析都要求溶液必須透明，否則引起對(duì)光的吸收，影響分析的準(zhǔn)確度。對(duì)特殊的均勻的渾濁液也可以進(jìn)行比色分析,稱為比濁法，比如應(yīng)用于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)的比濁測(cè)定。光線通過(guò)透明的溶液時(shí)，還有少量的光線在玻璃、溶液的表面被反射或散射，影響到吸光度，所以要用一個(gè)空白管進(jìn)行校正，除去反射、光、散射光、試劑中雜質(zhì)、非反應(yīng)物的影響，即用空白試劑溶液進(jìn)行調(diào)零的原因。普通玻璃對(duì)紫外線也有吸收，所以在普通分光光度計(jì)上,,使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度計(jì)上必須用對(duì)紫外線無(wú)吸收的石英玻璃比色杯。三.可見(jiàn)—紫外分光光度計(jì)的應(yīng)用（一）光譜分析：有時(shí)候需要研究某物質(zhì)在某溶劑中的光譜特性，如Vc的乙酸溶液在252.0nm和237.5nm處有吸收波峰。大多數(shù)情況下，比色分析都提供了使用光的波長(zhǎng)（一般是最大吸收峰波長(zhǎng)）。如果沒(méi)有提供使用波長(zhǎng)的話，可以用紫外分光光度計(jì)從200～1000nm范圍內(nèi)掃描吸收光譜，搜索到吸收峰，再用吸收峰波長(zhǎng)來(lái)比色分析。,咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標(biāo)準(zhǔn)品；下：樣品,,（二）吸光系數(shù)：郎伯-比爾定律中的K稱為吸光系數(shù)。因比色杯的直徑用cm為單位，因此K的單位決定于濃度c用什么單位，如c以mol/L為單位時(shí)K稱為摩爾吸光系數(shù)，用Emol或εmol表示；如果物質(zhì)的分子量未知，濃度可用%為單位，K稱為百分吸光系數(shù)，用E%表示。E的定義是：某波長(zhǎng)光通過(guò)1cm杯、1mol/L或1%濃度的某溶液時(shí)，該溶液對(duì)該波長(zhǎng)光的吸光度。E在特定波長(zhǎng)、1mol/L或1%濃度、特定溶劑條件下是該物質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù)，反映該物質(zhì)的吸光能力，資料和測(cè)定時(shí)都要標(biāo)明其特征,,波長(zhǎng)或最大吸收波長(zhǎng)，表示為Emol~nm,max,1cm或E%~nm，max，1cm。許多物質(zhì)的吸光系數(shù)在書或資料中可以查到，如藥典規(guī)定VB12應(yīng)該有2781nm、3611nm、5502nm3個(gè)吸收峰，其E1%361nm，1cm=207。實(shí)際工作中，1mol/L的濃度太高，可以配成1mmol/L或1μmol/L的濃度，相應(yīng)地寫成Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根據(jù)吸光系數(shù)的特性，它有3項(xiàng)用途：1.可作為物質(zhì)定性的參考：被測(cè)物質(zhì)的光譜特性和標(biāo)準(zhǔn)物如果一致，可粗略定性。如檢查VB12注射液是否變質(zhì)，測(cè)定其光譜，結(jié)果為279,,0、361.50、550.70.3nm3個(gè)吸收峰，完全一致，可以判定該物質(zhì)為VB12（未變質(zhì)）。一些苯衍生物的紫外光譜特征如下：化合物溶劑吸收峰吸收峰吸收峰Emolmax，1cm苯碳?xì)浠衔?54nm2502048800甲苯碳?xì)浠衔?622602087900六甲基苯碳?xì)浠衔?7123022110000氯苯碳?xì)浠衔?672002107400苯酚碳?xì)浠衔?7112602136200.,,2.檢查純度：紫外光譜法檢查純度是一種簡(jiǎn)便有效的方法，用于許多化合物檢測(cè)。如阿司匹林在空氣中容易吸收水分產(chǎn)生水楊酸，阿司匹林在280nm處有強(qiáng)吸收峰，而水楊酸的吸收峰遷移到312nm，只要檢測(cè)在312nm處是否有吸收峰，即可判斷有無(wú)水楊酸。再如無(wú)水乙醇精制過(guò)程中要用苯，測(cè)定無(wú)水乙醇中是否殘留苯，測(cè)定其吸收光譜，乙醇在210~600nm之間無(wú)吸收峰，而苯在250、254nm有吸收峰，以純無(wú)水乙醇為參比，對(duì)樣品進(jìn)行光譜分析，如果在250、254nm處出現(xiàn)吸收峰，則說(shuō)明有苯殘留。,,3.檢查含量（純度）:如藥典規(guī)定VB12的E1%max，361nm，1cm=207，上述VB12注射液原標(biāo)示濃度為0.05%，求實(shí)際濃度，方法：藥液用重蒸水精確稀釋20倍，水做參比，用361nm測(cè)定的吸光度為0.512，其含量為：1%∶207=x%∶0.512，x%=0.00247%，濃度=0.00247%20=0.049%4.應(yīng)用摩爾吸光系數(shù)測(cè)定濃度:一般的比色分析中都有標(biāo)準(zhǔn)品，未知樣品都是通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比分析含量。某些情況下，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，可以用摩爾吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)進(jìn)行測(cè)定，直接測(cè)定溶液的吸光度，通過(guò)和該純物質(zhì)的吸,,光系數(shù)比較，可以計(jì)算出濃度。這樣的分析需要經(jīng)過(guò)精確校正了波長(zhǎng)的分光光度計(jì)，紫外分光光度計(jì)的波長(zhǎng)一般精確到2nm，可以承擔(dān)這樣的分析。如果知道分子量的話，百分吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)之間可以互相換算，換算公式是：百分吸光系數(shù)=10摩爾吸光系數(shù)物質(zhì)的分子量。比如血紅蛋白是4個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)，單個(gè)亞基的平均分子量是16114.5。每個(gè)亞基都在高鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]和氰化鉀[KCN]溶液中形成單體氰化高鐵血紅蛋白（HiCN），它的特征,,（最大）吸收峰在540nm處，摩爾吸光系數(shù)是11000，表示為Emolmax,540nm,HiCN=11000。測(cè)定樣品在同樣條件下的吸光度，就可以計(jì)算出含量。如：將血液0.02ml加入到5.0ml氰化高鐵試劑中，用540nm測(cè)定的吸光度為0.35，求血液中Hb的含量(g/L)。第一步，計(jì)算血液稀釋倍數(shù)：5.020.02=251（倍）；第二步，計(jì)算：1mol∶11000=xmol∶0.35，x=0.3511000mol/L，乘以分子量和稀釋倍數(shù)變?yōu)間，x=0.351100016114.5251=128.7（g/L）。如果有些物質(zhì)不知分子量，用它的1%溶液在同,,樣條件下測(cè)定，用百分吸光系數(shù)同樣可以換算。5.紫外吸收光譜在某種程度上反映了化合物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，所以可以用于有機(jī)化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析。利用標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜可以對(duì)未知化合物進(jìn)行鑒定，即控制相同的測(cè)量條件，將未知化合物的吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)照，如果兩者吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、位置、最大吸收波長(zhǎng)及吸光強(qiáng)度完全一致，則可說(shuō)明它們分子結(jié)構(gòu)中存在相同的生色基團(tuán)，初步確定它們是同一種物質(zhì)，如咖啡因的定性。,,由于大多數(shù)有機(jī)化合物的紫外光譜比較簡(jiǎn)單，缺乏精細(xì)的結(jié)構(gòu)特征，而且很多生色團(tuán)的吸收峰幾乎不受分子中其它非吸收基團(tuán)的影響，因此，僅根據(jù)紫外光譜鑒定有機(jī)化合物有很大局限，一般必須與紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜等相配合，才能進(jìn)行精確的鑒定。6.溶劑對(duì)紫外光譜的影響：在測(cè)定有機(jī)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜時(shí)，在溶解度容許范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇非極性溶劑或極性較小的溶劑（烷、烯烴，如正己烷、正庚烷），以獲得吸收光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)。與標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比,,時(shí)，必須用相同的溶劑。所選擇的溶劑在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)應(yīng)該沒(méi)有明顯的吸收；并且不含有其它干擾物質(zhì)；與溶質(zhì)沒(méi)有相互作用。否則會(huì)使光譜線產(chǎn)生移動(dòng)，低于此波長(zhǎng)時(shí)，溶劑的吸收不可忽略。,,常用溶劑的波長(zhǎng)范圍如下：.溶劑使用波長(zhǎng)范圍溶劑使用波長(zhǎng)范圍甲醇>210二氯甲烷>235.乙醇>215氯仿>245.水>210乙酸乙酯>260.96%硫酸>210苯>280.乙醚>215甲苯>285.,,（三）作為光度計(jì)使用：有色的反應(yīng)液可以用普通的分光光度計(jì)（721、722、濃度計(jì)），也可以用紫外分光光度計(jì)比色。某些溶液、反應(yīng)液無(wú)色，在200～400nm之間有特征性光吸收,就只能用紫外分光光度計(jì)。1.單一物質(zhì)測(cè)定：先測(cè)定溶質(zhì)的吸收光譜，一般用最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行比色。常用方法有2種。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用標(biāo)準(zhǔn)液制作一系列標(biāo)準(zhǔn)管的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測(cè)定結(jié)果查標(biāo)準(zhǔn)曲線求知。（2）對(duì)照管法：制作標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管和樣品測(cè)定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰）處測(cè)定吸,,吸光度進(jìn)行比較，可直接求出樣品含量。如VB12含量測(cè)定：精確吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀釋n倍，使每含的標(biāo)示量為30μg/ml，另外配VB12標(biāo)準(zhǔn)液濃度為30μg/ml，蒸餾水調(diào)零，用361nm測(cè)定吸光度A，計(jì)算：測(cè)定液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）30；注射液中VB12含量（μg/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）30n（稀釋倍數(shù)）V（取樣量,ml）2.混合物中兩物質(zhì)同時(shí)測(cè)定（兩物質(zhì)的最大吸收峰有部分重合）例四環(huán)素和金霉素混合物的測(cè)定：四環(huán)素在0.25,,NNaOH中最大吸收峰為380nm，E1%1cm，λmax=372.0；在0.1NHCl中最大吸收峰為355nm，E1%1cm，λmax=303.2；兩吸收峰都可以做為四環(huán)素的測(cè)定波長(zhǎng)。但與金霉素共存時(shí)，因?yàn)榻鹈顾卦?55nm處有吸收（金霉素在0.1NHCl中E1%1cm，λmax=182.6），只能用380nm測(cè)定四環(huán)素?；旌蠘悠吩?55nm處測(cè)定二者的總吸光度,在380nm處測(cè)得四環(huán)素的吸光度，則兩者的濃度都可以求出。測(cè)定方法：(1)測(cè)定1%混合物在0.1NHCl溶液的吸光度A335(2)測(cè)定1%混合物在0.25NNaOH溶液的吸光度,,A380，計(jì)算：四環(huán)素濃度C1（g%）=[AC1380/E1%（C1）1cm，380]=AC1380/372.0金霉素濃度C2（g%）=[AC1+C2335－（E1%（C1）1cm，355C1）]E1%（C2）1cm，355=[AC1+C2335－（303.2AC1380372.0）]182.6,,四.紫外分光光度法的應(yīng)用：紫外光度法廣泛應(yīng)用在化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測(cè)、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)分析方面。凡在200-1000nm范圍內(nèi)有特征性吸收，或與試劑反應(yīng)后形成特征性吸收,符合郎伯—比爾定律的，都可以分析，如：1.測(cè)定蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸對(duì)280nm的紫外線有最大吸收，吸收值與其濃度成正比，樣品不必反應(yīng)，稀釋后直接測(cè)定。2.肌紅蛋白：在576nm附近有吸收峰，不需要標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)摩爾吸光系數(shù)法，可直接測(cè)定。3.還原性谷胱甘肽：與四氧嘧啶反應(yīng)，生成物,,在305nm處有最大吸收峰。4.過(guò)氧化氫酶：有可見(jiàn)光測(cè)定法，也有紫外法。5.抗生素：大部分可用紫外法測(cè)定，如青霉素、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、金霉素、新生霉素。6.VA用乙醚提取，溶在異丙醇中用328nm測(cè)定。VB1用246nm分析。VB2用267和444nm分析。VB6用291nm分析。VB11用254nm分析。VB12用278、361、550nm分析。VD用乙醚提取，純化后溶在乙醇中用265nm測(cè)定。Vc在乙酸介質(zhì)中與I2反應(yīng)：C6H8O6+I2乙酸溶液C6H6O6（脫氫Vc）+2HI；樣品中加入Vc后與I2反應(yīng)，,,,減少了I2，也減少了I3－生成，在一定范圍內(nèi)Vc與I3－成反比，用350nm測(cè)定I3－的顯色減弱，間接測(cè)定Vc濃度。7.許多藥物要用紫外光譜測(cè)定，如咖啡因用272.6nm；巴比妥類（安眠藥）用220～240nm測(cè)定；5種氯丙嗪類藥（鎮(zhèn)定藥）全用249～307nm測(cè)定；安眠酮用235和503nm分析；安定（鎮(zhèn)靜藥）用240和285nm分析。8.食品中硒與鄰苯二胺反應(yīng)，將絡(luò)合物提取到甲苯中，反應(yīng)物在335nm左右有吸收峰，用紫外比色測(cè)定。,,第八章原子吸收分光光度法的原理由原子結(jié)構(gòu)理論可知，一個(gè)原子可具有多種能態(tài)，其中最低的能態(tài)稱為基態(tài)，其它較高的能態(tài)稱為激發(fā)態(tài)。處于基態(tài)的原子稱為基態(tài)原子。原子吸收分光光度法的原理是：使樣品中化合態(tài)的元素吸收熱能，化合物解離后讓元素變?yōu)榛鶓B(tài)原子?；鶓B(tài)原子的能量最低，最穩(wěn)定，如果基態(tài)原子受外界能量激發(fā)，其最外層電子可能躍遷到不同的能級(jí)，達(dá)到不同的激發(fā)態(tài)。電子從基態(tài)躍遷到能量最低的激發(fā)態(tài)（第一激發(fā)態(tài)）時(shí)要吸收一定波長(zhǎng)的譜線，這一譜線稱為“共振吸收線”。,,E6.E5.E4.E3.E2.E1.最低激發(fā)態(tài)能級(jí)（第一激發(fā)態(tài)）EE0.基態(tài)原子能量的吸收和發(fā)射,較高激發(fā)態(tài)能級(jí),,,,而當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)再躍遷回基態(tài)時(shí)，則輻射出相同波長(zhǎng)的譜線，這一譜線稱為“共振發(fā)射線”，兩線均稱為共振線，波長(zhǎng)是相同的。由于各種元素原子結(jié)構(gòu)和核外電子排列不同，因此從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)態(tài)（或由第一激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)）時(shí)吸收或輻射的能量不同，因而各元素有不同波長(zhǎng)的共振線，所以元素的共振線又稱為元素的特征譜線。因?yàn)閺幕鶓B(tài)到第一激發(fā)態(tài)的躍遷最容易發(fā)生，所以對(duì)大多數(shù)元素來(lái)講，共振吸收線是元素所有譜線中最靈敏的譜線，原子吸收分光光度法就是利用基態(tài)原,,子躍遷到第一激發(fā)態(tài)時(shí)吸收從光源燈（元素?zé)簦┌l(fā)出的同一元素的共振吸收譜線（又叫分析線，相當(dāng)于吸收峰）。但原子的吸收譜線并不是幾何學(xué)上的線條，而是有一定寬度的波長(zhǎng)范圍，通常稱為譜線輪廓。KoIvKo/2半寬度———Vo——————Vo———透射光強(qiáng)度Iv與波長(zhǎng)Vo的關(guān)系吸收線輪廓與半寬度,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,若將吸收系數(shù)Kv隨入射光波長(zhǎng)變化的關(guān)系做圖，則稱吸收線輪廓，吸收線輪廓的特征值是吸收線中心波長(zhǎng)（或頻率）為Vo，在Vo處，吸收系數(shù)Ko最大，在Vo兩側(cè)一定距離后Kv減為零。吸收譜線在Vo兩側(cè)有一定寬度，通常以吸收系數(shù)等于極大值的一半（Ko/2）處吸收線兩點(diǎn)間的輪廓（頻率范圍）表示吸收線的寬度，稱為吸收線的半寬度，以△V表示，其范圍為0.001～0.01nm。同樣發(fā)射譜線也有寬度，不過(guò)實(shí)際使用中都是用吸收譜線中心的最大吸收值Ko來(lái)測(cè)定元素含量，稱為峰值吸收。,,入射光強(qiáng)度Iov透過(guò)光強(qiáng)度Iv研究證明，原子蒸氣對(duì)共振發(fā)射譜線的吸收程度和蒸氣中基態(tài)原子數(shù)成正比，也即同原子濃度成正比。當(dāng)一束強(qiáng)度為Iov、頻率為v的入射光（譜線）通過(guò)原子蒸氣后，有一部分被吸收，其透過(guò)光的強(qiáng)度Iv與原子蒸氣厚度（即火焰的寬度）L、原子蒸氣濃度C的關(guān)系同有色溶液吸收光的情況完全類似，服從郎伯-比爾定律，即Iv=Iove－KvCL，式中e是自然對(duì)數(shù)的底，Kv是原子蒸氣對(duì)頻率為V的入射光的吸收系數(shù)。,火焰寬度L,,,,當(dāng)原子蒸氣厚度L一定時(shí)，設(shè)－KvL=－K，Iv=Iove－KC，Iov/Iv=e－KC，將透光度Iv/Iov的的倒數(shù)取對(duì)數(shù)稱為吸光度A，則上式簡(jiǎn)化為A=－Ig（Iv/Iov）=KC，即吸光度A與濃度成線性正比關(guān)系。在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，原子蒸氣中的原子濃度與樣品中的元素實(shí)際濃度成正比，這就是原子吸收分光光度法測(cè)定元素的原理。實(shí)際測(cè)定中還有許多注意事項(xiàng)：1.元素測(cè)定都要先制備工作曲線，每個(gè)工作曲線至少要6～7個(gè)點(diǎn)，而且最好從低濃度—高濃度，范圍盡可能大，而且要符合線性關(guān)系。,,2.處理樣品同時(shí)要制備它的空白對(duì)照管，測(cè)定管吸光度減去空白管吸光度，再通過(guò)工作曲線計(jì)算元素濃度。3.原子吸收分析的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，絕對(duì)檢出線可達(dá)10－9～10－10g，相對(duì)誤差一般0.1～0.5%,測(cè)定范圍廣，從10－6～10－9g。選擇性好，分析速度快，溶液中多種離子不需要分離直接測(cè)定。但也有缺點(diǎn)，主要是元素在火焰中燃燒過(guò)程中有許多干擾因素。4.原子吸收分析，樣品溶液的最適濃度在靈敏度的15～100倍范圍內(nèi)。,,一些元素的分析譜線鎂：285.2nm；鈣：422.7nm；鐵：248.3nm；銅：324.8nm；錳：279.5nm；鋅：213.9nm；鉻：357.9nm；鎳：232.0nm；鈷：240.7nm鉬：313.3nm鉛：283.3nm；鎘：228.8nm；錫：224.6nm銻：217.6nm；鋁：309.3nm；砷：139.8nm；汞：253.7nm；,,第九章火焰光度法某些原子或分子的電子受到熱能或電能的激發(fā)后躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)這些電子再由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，以光的形式釋放出所吸收的能量，形成發(fā)射光譜。每個(gè)原子或分子的的能量狀態(tài)是一定的，所以它們的發(fā)射光譜線也是特異的；激發(fā)的能量越大，被激發(fā)的電子的能量也越高，呈現(xiàn)的譜線也越多。用火焰作為激發(fā)能量，使某些金屬元素（離子）產(chǎn)生發(fā)射光譜進(jìn)行分析的方法稱為火焰光度分析法。一般火焰屬于熱能，能量不及電弧,,火花高，因此產(chǎn)生的光譜比較簡(jiǎn)單，有時(shí)僅二、三條譜線。普通煤氣-空氣火焰的溫度不太高，所以能激發(fā)的元素也僅限于堿金屬和堿土金屬，目前用該法測(cè)定的元素為鈉、鉀、鈣。一.火焰光度計(jì)的測(cè)定原理：金屬元素（離子）經(jīng)過(guò)燃燒的火焰激發(fā)出特異的發(fā)射光譜，如鈉的發(fā)射光譜為黃色，鉀的發(fā)射光譜為淡紅色。發(fā)射光譜的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，據(jù)此可以測(cè)定含量。將樣品制成溶液，借壓縮空氣吸入到火焰光度計(jì)的霧化器，并在火焰中噴為很細(xì)的微粒。,,溶液中含有各種不同的離子，激發(fā)出各自不同的光譜，但通過(guò)特異的濾光鏡可選擇需要的元素的譜線，譜線投射到光電池（管）上，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)放大后用電流計(jì)檢測(cè)。二.測(cè)定方法：（一）直接測(cè)定法：1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液在火焰光度計(jì)上測(cè)定，讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同法稀釋樣品后測(cè)定，查標(biāo)準(zhǔn)曲線求含量。2.比較法：用2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液，一個(gè)高濃度，一個(gè)低濃度，使樣品液的濃度介于兩者之間。通常,,,,,,,,第十章熒光分光光度法分析的原理一.熒光的發(fā)生：有些物質(zhì)吸收紫外光照射后會(huì)發(fā)射出波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)還長(zhǎng)的光，稱為熒光和磷光。熒光和磷光有區(qū)別，分子的能量從激發(fā)態(tài)直接降落到基態(tài)發(fā)出的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光稱為熒光。分子的能量從激發(fā)態(tài)并不直接降落到基態(tài)，而是通過(guò)一個(gè)中間的亞穩(wěn)定狀態(tài)，稍停留后，再放出能量，下降到基態(tài)，發(fā)出的光稱為磷光。,熒光和磷光,第二電子激發(fā)態(tài)吸光無(wú)輻射躍遷第一電子激發(fā)態(tài)吸光熒光亞穩(wěn)態(tài)磷光基態(tài),,,,,,,,,,,,磷光的能量比熒光小，波長(zhǎng)較熒光長(zhǎng)。從激發(fā)到發(fā)光，熒光所需的時(shí)間較短，在激發(fā)光照射后10－8～10－14秒之間，磷光所需的時(shí)間較長(zhǎng)，在激發(fā)光照射后10－4～10秒以上。本章主要介紹熒光光度分析法。照射物質(zhì)的紫外光稱為激發(fā)光，物質(zhì)產(chǎn)生的熒光稱為發(fā)射光。同一分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)，用同一波長(zhǎng)的激發(fā)光照射，可以產(chǎn)生相同的熒光；同一物質(zhì)濃度高時(shí)，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度也強(qiáng)，利用這個(gè)性質(zhì)可以進(jìn)行定量測(cè)定，稱為熒光光度分析法。熒光分析不是測(cè)定激發(fā)光的強(qiáng)弱，而是,,測(cè)定發(fā)射光的強(qiáng)弱，所以屬于發(fā)射光譜分析法。二.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜（熒光光譜）：如果將激發(fā)光源用單色器分光，讓它發(fā)出一系列波長(zhǎng)連續(xù)變化的光譜（像在紫外光譜分析中，從200～400nm連續(xù)掃描），測(cè)定物質(zhì)吸收每一波長(zhǎng)的激發(fā)光后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，得到的光譜圖稱為激發(fā)光譜（excitationspectrum，簡(jiǎn)寫Ex），激發(fā)光譜實(shí)際是熒光物質(zhì)的吸收光譜。激發(fā)光譜中吸收最高的波長(zhǎng)能使熒光物質(zhì)發(fā)出最強(qiáng)的熒光，故稱為最大激發(fā)波長(zhǎng)，用λex表示，一般要用它激發(fā)熒光。,,再使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度不變，一直照射在熒光物質(zhì)上，把產(chǎn)生的熒光通過(guò)單色器色散，變成連續(xù)變化波長(zhǎng)的熒光，照射在光電接受管上，在一定范圍內(nèi)記錄其熒光強(qiáng)度的變化，以波長(zhǎng)變化和相應(yīng)的熒光強(qiáng)度作圖，稱為熒光發(fā)射光譜或簡(jiǎn)稱發(fā)射光譜（fluorescencespectrum簡(jiǎn)寫：Em）。再以最大激發(fā)波長(zhǎng)照射，測(cè)定熒光發(fā)射光譜，產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度的波長(zhǎng)又稱為最大發(fā)射波長(zhǎng)，用λem表示。一般分子熒光的發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)。下圖是硫酸奎寧在硫酸中的激發(fā)光譜和熒光光譜。,硫酸奎寧的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,,三.熒光定量分析的原理：熒光強(qiáng)度（If）和激發(fā)光的強(qiáng)度（I0）、物質(zhì)的熒光效率（φf(shuō)）成正比：If=I0φf(shuō)---------------------①對(duì)待測(cè)溶液，設(shè)I0為入射光（激發(fā)光）強(qiáng)度，It為透射光強(qiáng)度，Ia為吸光強(qiáng)度，If為熒光強(qiáng)度，C為熒光物質(zhì)濃度，L為溶液厚度(比色杯直徑）E為吸光系數(shù)。溶液被入射光激發(fā)以后，可以向各個(gè)方I0It向發(fā)出熒光強(qiáng)度而且激發(fā)光的一部分能量可以透過(guò)溶液If，因此從透射光的方向,,,,,,記錄熒光強(qiáng)度是錯(cuò)誤的，一般是從激發(fā)光源垂直的方向記錄熒光強(qiáng)度。根據(jù)比爾定律，Ia=I0－It=I0(1－10－ECL)=I0(1－e－2.3ECL)--------②溶液的熒光強(qiáng)度If與吸收的光能Ia成正比，則If=φf(shuō)Ia=φf(shuō)I0(1－e－2.3ECL)，φf(shuō)為常數(shù)，而e－2.3ECL=1－2.3ECL+(－2.3ECL)2/2！若濃度C很小，L為1cm，ECL的值也很小，當(dāng)ECL≤0.05時(shí)，③式中第二項(xiàng)以后可忽略，所以If=φf(shuō)I0(1－e-2.3ECL)=φf(shuō)I0[1－(1－2.3ECL)]=φf(shuō)I02.3ECL，當(dāng)I0和L一定時(shí)，φf(shuō)和E也是常數(shù)，以K表示，則If=KC,,上式說(shuō)明熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成線性關(guān)系,而且增大入射光強(qiáng)度，可以增大熒光強(qiáng)度。對(duì)于較濃的溶液，由于熒光熄滅等原因，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度不成線性關(guān)系。四.熒光分析的方法：1.根據(jù)上述特點(diǎn)，熒光分析必須在很小濃度下進(jìn)行，其靈敏度可達(dá)0.1～1ng/ml。2.發(fā)射光譜圖形狀和激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，但熒光強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)有關(guān)，所以在熒光分析中一般都是固定一個(gè)熒光的發(fā)射波長(zhǎng)，然后在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描物質(zhì)的激發(fā)光譜，再選擇λex做激,,發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行定量分析。3.熒光分析一般采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定樣品時(shí)都要將空白液的熒光強(qiáng)度調(diào)到零，再測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)管和樣品的熒光強(qiáng)度。4.有些熒光物質(zhì)的稀溶液在激發(fā)光照射下很容易分解而使熒光強(qiáng)度不斷降低，所以不能用激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間照射溶液。熒光強(qiáng)度還受溫度、pH值、溶劑的很大影響，熒光光譜受水、乙醇、環(huán)己烷的干擾較大，而氯仿的干擾較小。5.熒光物質(zhì)的濃度大于1mg/ml時(shí)，常常發(fā)生熒光自滅現(xiàn)象。,,產(chǎn)生熒光的有機(jī)物絕大多數(shù)是環(huán)狀化合物，如芳香環(huán)、苯類、菲類，還有不飽和雜環(huán)如喹啉、吲哚、長(zhǎng)鏈共軛多烯烴，如VA、VB2等。許多有機(jī)物不產(chǎn)生熒光或熒光效率不高，可以把它們轉(zhuǎn)化為能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)或設(shè)法增強(qiáng)它們的熒光，如甾族化合物不發(fā)生熒光，用硫酸處理后可以轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)；有些無(wú)機(jī)物不產(chǎn)生熒光，可以和有機(jī)試劑結(jié)合生成產(chǎn)生熒光的絡(luò)合物進(jìn)行分析。許多藥物中的胺類、甾體類、抗生素類、維生素類、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶都可以用熒光法分析。,