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1、10/26/2021In-FusionIn-Fusion克隆技術(shù)介紹10/26/20212基因克隆背景簡(jiǎn)介基因克隆背景簡(jiǎn)介TA克隆克隆限制性酶切克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆平滑末端克隆缺點(diǎn)：連接效率低缺點(diǎn)：連接效率低 耗時(shí)較長(zhǎng)耗時(shí)較長(zhǎng) 需要特定限制性酶切位點(diǎn)需要特定限制性酶切位點(diǎn)10/26/20213In-Fusion克隆產(chǎn)品克隆產(chǎn)品Clontech專利專利In-Fusion HD Cloning System任意載體任意載體任意基因片段任意基因片段這是一款讓您這是一款讓您隨心所欲隨心所欲地實(shí)現(xiàn)基因定向克隆的產(chǎn)品！地實(shí)現(xiàn)基因定向克隆的產(chǎn)品！ In-FusionIn-Fusion 基因克隆特點(diǎn)
2、基因克隆特點(diǎn)4 10/26/20215主要內(nèi)容主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹系列產(chǎn)品介紹4常見問答常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理克隆技術(shù)的原理October 26, 20216 主要內(nèi)容主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹系列產(chǎn)品介紹4常見問答常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理克隆技術(shù)的原理In-FusionIn-Fusion 基因克隆技術(shù)原理示意圖基因克隆技術(shù)原理示意圖In-Fusion專利酶專利酶Clontech專利專利In-Fusion是一種是一種快速、簡(jiǎn)單、
3、高效快速、簡(jiǎn)單、高效的基因克隆技術(shù)！的基因克隆技術(shù)！50 ，15 min單管反應(yīng)單管反應(yīng)7 October 26, 20218 主要內(nèi)容主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹系列產(chǎn)品介紹4常見問答常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理克隆技術(shù)的原理10/26/20219In-FusionIn-Fusion 克隆技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)克隆技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)不附加任何多余序列不附加任何多余序列2不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制3可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段片段 41簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技
4、術(shù)10/26/202110簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù) 快速！快速！10/26/202111In-Fusion HD無論是克隆無論是克隆長(zhǎng)基因片段長(zhǎng)基因片段還是克還是克隆隆多個(gè)基因片段多個(gè)基因片段都能保持較高的克隆效率。都能保持較高的克隆效率。 高效！高效！簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)10/26/202112不附加任何多余序列不附加任何多余序列線性化載體線性化載體任意載體任意載體克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)目的目的DNA片段片段不需要的堿基序列不需要的堿基序列引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增與載體相同的與載體相同的15 個(gè)堿基個(gè)堿基 序列序列In-Fusion
5、連接反應(yīng)連接反應(yīng)15 min 不附加任何多余序列不附加任何多余序列的重組載體的重組載體無縫克隆：無縫克?。翰桓郊尤魏味嘤嘈蛄胁桓郊尤魏味嘤嘈蛄蠥BC10/26/202113不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制In-Fusion克隆不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制克隆不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制: 在在cDNA序列中插入序列中插入內(nèi)含子內(nèi)含子,熒光蛋白基因熒光蛋白基因 在在cDNA序列添加序列添加UTRs 轉(zhuǎn)換純化標(biāo)簽例如轉(zhuǎn)換純化標(biāo)簽例如Myc 轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)換為His 缺失缺失蛋白表達(dá)區(qū)域蛋白表達(dá)區(qū)域表達(dá)載體表達(dá)載體選擇插入位點(diǎn)選擇插入位點(diǎn)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增純化純化目的目的DNA
6、片段片段混合混合In-FusionIn-Fusion引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 重組載體重組載體10/26/202114可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNADNA片段片段Step 2: 目的目的DNA片段擴(kuò)增片段擴(kuò)增Step 3: 一次一次In-Fusion連接反應(yīng)連接反應(yīng)Step 1: 制備線性化載體制備線性化載體片段片段1片段片段2片段片段3線性化載體線性化載體重組載體重組載體10/26/202115克服傳統(tǒng)克隆技術(shù)的限制克服傳統(tǒng)克隆技術(shù)的限制克服其它克隆技術(shù)的限制其它克隆技術(shù)的限制In-Fusion解決方案載體的限制 不同克隆試劑盒都需要與之匹配的載體必須使用提供的載體只要
7、載體末端和插入片段末端具有15個(gè)同源堿基， In-Fusion就可以將任意PCR片段插入任意線性化載體中。必須進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切和連接需要獨(dú)一無二、兼容的酶切位點(diǎn)極少的合適酶切位點(diǎn)In-Fusion不受限制性酶切位點(diǎn)的限制，因此在目的片段及使用的載體中是否存在合適的酶切位點(diǎn)并不妨礙克隆。亞克隆繁瑣多片段不能同時(shí)克隆In-Fusion能夠在一次反應(yīng)中同時(shí)克隆多個(gè)片段，無需進(jìn)行亞克隆。對(duì)于大片段克隆效率較低對(duì)于插入片段有限制In-Fusion系統(tǒng)能夠高效克隆0.05-15 kb DNA片段。非定向克隆需要篩選目的片段插入方向 正確的克隆In-Fusion是基因定向克隆技術(shù)，因此無需進(jìn)行目的基因片
8、段正確插入的克隆的篩選。會(huì)附加多余堿基序列In-Fusion是無縫克?。翰桓郊尤魏味嘤鄩A基序列。不適合中型和大規(guī)模克隆工程In-Fusion技術(shù)已經(jīng)成功用于多項(xiàng)高通量克隆工程。10/26/202116In-FusionIn-Fusion 克隆技術(shù)的應(yīng)用克隆技術(shù)的應(yīng)用多片段克隆多片段克隆構(gòu)建載體模型構(gòu)建載體模型插入突變位點(diǎn)插入突變位點(diǎn)高通量克隆高通量克隆10/26/202117應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例實(shí)例：多個(gè)實(shí)例：多個(gè)DNA片段（片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同時(shí)克隆同時(shí)克隆【方法方法】使用使用TaKaRa高品質(zhì)高品質(zhì)PCR酶分別擴(kuò)增酶分別擴(kuò)增1 kb、2 kb、3 kb的目的的目的DNA片
9、段片段 和和2.7 kb的載體，并將擴(kuò)增產(chǎn)物混合，使用的載體，并將擴(kuò)增產(chǎn)物混合，使用In-Fusion HD試劑盒完成試劑盒完成 克隆。利用高效率的感受態(tài)細(xì)胞克隆。利用高效率的感受態(tài)細(xì)胞StellarTM Competent Cells（產(chǎn)品編（產(chǎn)品編 號(hào)：號(hào)：636763）轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)）轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選。白斑篩選。10/26/202118引物設(shè)計(jì)及目的基因片段擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)及目的基因片段擴(kuò)增引物的引物的5末端必須包含與末端必須包含與載體末端相同載體末端相同的的15個(gè)堿基序列個(gè)堿基序列引物的引物的3末端必須包含與末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列的特異堿基序列
10、10/26/202119載體線性化載體線性化PCR擴(kuò)增擴(kuò)增酶切處理酶切處理10/26/202120In-FusionIn-Fusion連接反應(yīng)連接反應(yīng)In-Fusion專利酶專利酶線性化載體線性化載體目的基因片段目的基因片段反應(yīng)液反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化直接轉(zhuǎn)化In-Fusion連接反應(yīng)連接反應(yīng)50 15 min 【結(jié)果結(jié)果】Cloning Enhancer處理，處理，37 15 min， 80 15 min 引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則引物的引物的5末端必須包含與末端必須包含與載體末端相同載體末端相同的的15個(gè)堿基序列個(gè)堿基序列引物的引物的3末端必須包含與末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)目的基因片段相互補(bǔ)
11、的特異堿基序列的特異堿基序列October 26, 202121 引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則October 26, 202122 10/26/202123引物設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)工具引物設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)工具h(yuǎn)ttp:/ 26, 202124 主要內(nèi)容主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹系列產(chǎn)品介紹4常見問答常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理克隆技術(shù)的原理10/26/202125產(chǎn)品列表產(chǎn)品列表10/26/202126基礎(chǔ)款相關(guān)產(chǎn)品基礎(chǔ)款相關(guān)產(chǎn)品5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linea
12、rized (50 ng / l)2 kb Control Insert (40 ng / l) In-Fusion HD Cloning Kit（ 639648/49/50)組分組分10/26/202127附帶附帶Cloning Enhancer的相關(guān)產(chǎn)品的相關(guān)產(chǎn)品Cloning Enhancer的作用的作用：消除消除PCR反應(yīng)液中的引物二聚體和反應(yīng)液中的引物二聚體和dNTP等的影響等的影響無需對(duì)無需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠純化產(chǎn)物進(jìn)行膠純化操作簡(jiǎn)單操作簡(jiǎn)單In-Fusion HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)10/26/202128
13、Up to 5X Higher Efficiency未經(jīng)處理未經(jīng)處理Cloning Enhancer處理處理Cloning Enhancer的實(shí)用例的實(shí)用例October 26, 202129 主要內(nèi)容主要內(nèi)容2In-Fusion優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion系列產(chǎn)品介紹系列產(chǎn)品介紹4常見問答常見問答1In-Fusion克隆技術(shù)的原理克隆技術(shù)的原理10/26/202130In-Fusion Kit In-Fusion Kit 常見問答常見問答Q1.如何選擇如何選擇PCR酶？酶？A1.可以可以使用任何使用任何PCR酶。由于科研人員進(jìn)行克隆表達(dá)的實(shí)驗(yàn)較多，我酶。由于科研人員進(jìn)行克
14、隆表達(dá)的實(shí)驗(yàn)較多，我們推薦使用高保真的們推薦使用高保真的PCR酶。酶。Q2.載體和插入的載體和插入的DNA片段末端結(jié)構(gòu)有限制嗎？片段末端結(jié)構(gòu)有限制嗎？A2.沒有特別的限制。無論是平滑末端、粘性末端或者末端有無沒有特別的限制。無論是平滑末端、粘性末端或者末端有無A尾均可尾均可 進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。 Q3.載體和插入的載體和插入的DNA片段的長(zhǎng)度有限制嗎？片段的長(zhǎng)度有限制嗎？A3.沒有特別的限制。載體和插入的沒有特別的限制。載體和插入的DNA片段即使超過片段即使超過10 kb也可以進(jìn)也可以進(jìn) 行連接反應(yīng)，只是連接效率會(huì)有所降低。插入的行連接反應(yīng)，只是連接效率會(huì)有所降低。插入的D
15、NA片段只要不少片段只要不少 于于50 bp就可進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。就可進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。Q4.線性化載體末端是否需要進(jìn)行去磷酸化處理？線性化載體末端是否需要進(jìn)行去磷酸化處理？A4.線性化載體末端磷酸基團(tuán)的存在與否不會(huì)影響線性化載體末端磷酸基團(tuán)的存在與否不會(huì)影響In-Fusion連接效率。連接效率。 因此，不需要對(duì)線性化載體進(jìn)行去磷酸化處理。因此，不需要對(duì)線性化載體進(jìn)行去磷酸化處理。 10/26/202131技術(shù)支持技術(shù)支持：800-810-6261；010-80720985 / 86： ： 我們將竭誠(chéng)為您服務(wù)！我們將竭誠(chéng)為您服務(wù)！Thank You Thank You ！October 26, 202132
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