生物化學：03 第3章 氨基酸和蛋白質(zhì)

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1、第3章 氨基酸和蛋白質(zhì) 一、教學大綱基本要求 氨基酸的結(jié)構(gòu)特點和構(gòu)型、物理和化學性質(zhì)以及氨基酸的分離和分析。肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及生物學功能。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次，一級結(jié)構(gòu)測定，一級結(jié)構(gòu)與生物功能。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，肽鏈的構(gòu)象，二級結(jié)構(gòu)的基本類型，超二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域和纖維狀蛋白質(zhì)。一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，維持三級結(jié)構(gòu)的作用力，球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)的功能，蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)與功能與功能，免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)兩性性質(zhì)及應(yīng)用，膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀，蛋白質(zhì)的變性，分離純化蛋白質(zhì)的主要方法。 二、本章知識要點 （一）氨基酸 1．蛋白質(zhì)的組成 蛋白質(zhì)是由20種基本氨基酸組成的。用酸、堿

2、或蛋白酶可以分別將蛋白質(zhì)水解，生成游離的氨基酸。 2．氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類 常見的蛋白質(zhì)氨基酸（基本氨基酸）有20種，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元。20種基本氨基酸中，有19種氨基酸是a－氨基酸，即與羧基相鄰的a－碳原子上都有一個氨基。脯氨酸是亞氨基酸。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的不同，根據(jù)R基團結(jié)構(gòu)的不同，可以將20種氨基酸分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族3類。按照R基團的極性性質(zhì)，又可以將20種氨基酸分為4類：非極性R基氨基酸，不帶電荷的極性R基氨基酸，帶正電荷的R基氨基酸，帶負電荷的R基氨基酸。氨基酸側(cè)鏈R基的性質(zhì)決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點、性質(zhì)和功能。 不常見的蛋白質(zhì)氨基酸有10多種，在蛋白質(zhì)中

3、由基本氨基酸經(jīng)過修飾生成的。 3．氨基酸的兩性性質(zhì) 在結(jié)晶狀態(tài)或在水溶液中，氨基酸主要以兩性離子形式存在。a－羧基pK1在2.0左右，當pH>3.5，a－羧基主要以－COO-形式存在。a－氨基pK2在9.4左右，當pH<8.0時，a－氨基主要以a－NH+3形式存在。氨基酸在pH3.5－8.0時，帶有相反電荷，是兩性離子。在溶液中，氨基酸帶有的電荷性質(zhì)和電荷量隨溶液pH值變化而變化。 甘氨酸溶點232℃，比相應(yīng)的乙酸（16.5℃）和乙胺（－80.5℃）都高，可推測氨基酸在晶體狀態(tài)是以兩性離子形式存在的。 溶液中的氨基酸所帶的凈電荷為零時，此時溶液的pH值稱氨基酸的等電點，用p

4、I表示。氨基酸等電點的計算：中性氨基酸pI＝（pKa－COOH + pKa－NH3）/2，酸性氨基酸pI＝（pKa－COOH + pKR）/2，堿性氨基酸pI＝（pKa－NH3 + pKR ）/2。 4．氨基酸側(cè)鏈R基的特性 （1）側(cè)鏈R為脂肪烴基的氨基酸（Gly、Ala、Val、Leu、Ile） R基是中性烷基（Gly是H），對整個氨基酸分子的酸堿性影響很小。這5種氨基酸幾乎有相同的等電點（6.0±0.03）。從甘氨酸到異亮氨酸，側(cè)鏈R基團的疏水性逐漸增加。 （2）側(cè)鏈R中含有羥基的氨基酸（Ser、Thr） 絲氨酸中的－OH基（pKa=15），在生理條件下不解離，是一個極

5、性基團，能與其它基團（羥基和氨基等）形成氫鍵，具有重要的生理意義。在許多酶的活性中心都有絲氨酸殘基存在。蘇氨酸中的基羥基是一個仲醇，具有親水性，但此羥基形成氫鍵的能力較弱。蘇氨酸在蛋白質(zhì)活性中心中很少出現(xiàn)。 （3）側(cè)鏈R中含硫的氨基酸（Cys、Met） 半胱氨酸的R側(cè)鏈中含巰基，兩個半胱氨酸的巰基氧化生成二硫鍵，利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。甲硫氨酸中含有甲硫基（－SCH3），在生物體內(nèi)是一種重要的甲基供體。 （4）側(cè)鏈R中含有酸性基團的氨基酸（Asp、Glu） 半胱氨酸側(cè)鏈羧基pKa（β－COOH）為3.86，谷氨酸側(cè)鏈羧基pKa（γ－COOH）為4.25，它們在生理條件下帶有負電荷。

6、 （5）側(cè)鏈R中含有酰胺基團的氨基酸（Asn、Gln） 天冬酰胺和谷氨酰胺易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)在生物合成和代謝過程中有重要意義。 （6）側(cè)鏈R中含堿性基團的氨基酸（Lys、Arg） 賴氨酸的R側(cè)鏈上含有一個氨基，側(cè)鏈氨基的pKa為10.53。生理條件下，賴氨酸側(cè)鏈帶有一個正電荷（－NH3+）。此外，賴氨酸的側(cè)鏈有4個C的直鏈，柔性較大，使側(cè)鏈氨基的反應(yīng)活性增大。例如，肽聚糖短肽間的連接。精氨酸是堿性最強的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強的有機堿，pKa值為12.48，生理條件下完全質(zhì)子化。 （7）側(cè)鏈R中含有芳香基團的氨基酸（Phe、Try） 苯丙氨酸和酪氨酸都具有共軛

7、π電子體系，容易與其它缺電子體系或π電子體系形成電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物(charge－transfer complex)或電子重疊復(fù)合物。在生物大分子的相互識別過程中具有重要作用。這2種氨基酸在紫外區(qū)有特征吸收峰，蛋白質(zhì)的紫外吸收部分來自這2種氨基酸。 （8）側(cè)鏈R為雜環(huán)的氨基酸（Trp、His、Pro） 色氨酸有復(fù)雜的π電子共軛休系，它比苯丙氨酸和酪氨酸更易形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。色氨酸的π共軛休系最大，在280nm處，色氨酸吸收最強，酪氨酸次之，苯丙氨酸最弱。組氨酸含咪唑環(huán)，咪唑環(huán)的pKa在游離氨基酸中和在多肽鏈中不同，前者pKa為6.00，后者為7.35，它是20種氨基酸中側(cè)鏈pKa值最接近生理

8、pH值的一種。在接近中性pH時，可離解平衡，具有緩沖能力。 脯氨酸是環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸，它的a－亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。在多肽鏈中，脯氨酸殘基所在的位置往往發(fā)生骨架方向的變化，它在形成球狀蛋白質(zhì)空間的結(jié)構(gòu)中具有重要作用。 5．氨基酸的兩性性質(zhì) 在結(jié)晶狀態(tài)或在水溶液中，氨基酸主要以兩性離子形式存在。a－羧基pK1在2.0左右，當pH>3.5，a－羧基主要以－COO-形式存在。a－氨基pK2在9.4左右，當pH<8.0時，a－氨基主要以a－NH+3形式存在。氨基酸在pH3.5－8.0時，帶有相反電荷，是兩性離子。在溶液中，氨基酸帶有的電荷性質(zhì)和電荷量隨溶液pH值

9、變化而變化。 甘氨酸溶點232℃，比相應(yīng)的乙酸（16.5℃）和乙胺（－80.5℃）都高，可推測氨基酸在晶體狀態(tài)是以兩性離子形式存在的。 6．氨基酸的化學反應(yīng) DNS－CL（丹磺酰氯）反應(yīng)：在弱堿性溶液中，氨基酸的氨基可以與丹磺酰氯（5－二甲基氨基萘－1－磺酰氯）發(fā)生?；磻?yīng)，生成DNS－氨基酸。此反應(yīng)可以標記多肽鏈N末端氨基酸，用于測定多肽和蛋白質(zhì)的N末端氨基酸。 Sanger反應(yīng)：在弱堿性溶液中，氨基酸的氨基與2，4－二硝基氟苯(DNFB或FDNB)發(fā)生親核芳香取代反應(yīng)，生成二硝基苯基氨基酸。此反應(yīng)可以用來分析多肽的N末端氨基酸。 Edman反應(yīng)：在弱堿性條件下，a－氨基酸與苯異

10、硫氰酸酯（PITC）反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC－氨基酸）。PTC－氨基酸可以環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH－氨基酸），用層析法可以分離鑒定PTH－氨基酸。用此方法可以分析多肽鏈N末端的氨基酸序列。 茚三酮反應(yīng)：在弱酸性條件下，a－氨基酸與茚三酮共熱，發(fā)生氨基氧化脫氨和脫羧反應(yīng)，生成紫色化合物，最大吸收波長λmax是570nm。脯氨酸與茚三酮反應(yīng)，生成亮黃色化合物，最大吸收波長λmax是440nm。 此反應(yīng)可以用于氨基酸含量的分析。 氨基與?；噭┓磻?yīng) ?；噭┯衅S氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、對－甲苯磺酰氯，以及5－二甲基氨基萘－1－磺酰氯（丹磺酰氯DNS-Cl）。

11、 氨基與烷基化試劑反應(yīng) α－羧基中的氮是一個親核中心，能發(fā)生親核取代反應(yīng)。 生成西佛堿的反應(yīng)（Schiff） 氨基酸的α－氨基與醛類反應(yīng)，生成西佛堿，西佛堿是很多酶促反應(yīng)中的中間產(chǎn)物，例如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物。 含硫氨基酸的烷基化反應(yīng) 硫原子也是親核中心，可發(fā)生親核取代反應(yīng)。生物體內(nèi)，重要的甲基化劑是S－腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met與ATP作用得到的S－烷基化產(chǎn)物。在酶催化下，SAM可以使多種生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰膽堿的生物合成。 α－羧基參加的反應(yīng) 羧基與堿反應(yīng)生成鹽，與醇反應(yīng)生成酯。羧基與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)生成酰氯，使羧基活化，可以用于多肽的人工合

12、成。 7．氨基酸的光學性質(zhì) 氨基酸的a碳是一個不對稱碳（甘氨除外）原子，氨基酸有D型和L型兩種構(gòu)型。蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L型，有些抗生素或微生物的細胞壁中有D型氨基酸。 外消旋作用：混合等摩爾的D型和L型氨基酸，可以得到無旋光性的DL－消旋物。內(nèi)消旋作用：一個D型半胱氨酸和一個L型半胱氨酸，氧化生成內(nèi)消旋胱氨酸。 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可以吸收紫外光。蛋白質(zhì)分子在280nm有最大紫外光吸收，是因為蛋白質(zhì)分子中含有這3種氨基酸殘基。 8．氨基酸的分離和分析 用紙層析、薄層層析、電泳、陽離子交換層析等方法可以分離氨基酸混合物。陽離子交換層析法：用含Na＋的緩沖液將陽離子交換樹脂處理成

13、鈉鹽，且pH值在2左右。將游離氨基酸的混合溶液（pH2－3）加入柱中，此時氨基酸都以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子交換，被固定在樹脂上。逐步提高洗脫液的pH值，減小氨基酸帶有的正電荷量；同時逐步提高洗脫液的鹽濃度，減小氨基酸與樹脂的作用力，可以將固定在樹脂上的氨基酸以不同的速度洗脫下來。被分離的氨基酸與茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)衍生物對光吸收的強弱，可以定量分析各種氨基酸。 氨基酸與離子交換樹脂的作用力主要有：靜電吸引力和氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)(聚苯乙烯)的疏水作用力。靜電吸引力的大小直接與氨基酸的等電點有關(guān)，靜電吸引力的大小順序是：堿性氨基酸﹥中性氨基酸﹥酸性氨基酸。在等電點比較接近的氨基酸

14、中，R側(cè)鏈殘基的疏水性越高，與樹脂基質(zhì)作用力越大，在層析柱中的停留時間（保留時間）越長。 （二）肽 1．肽和肽鍵的結(jié)構(gòu) 肽是由一個氨基酸的a－羧基與另一個氨基酸的a－氨基脫水縮合而成的化合物，氨基酸間脫水后生成的共價鍵稱肽鍵（酰氨鍵），其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。由兩個氨基酸縮合而成的肽稱為2肽，少于10個氨基酸殘基的肽稱為寡肽，多于10個氨基酸殘基的肽稱為多肽。肽鏈上的各個側(cè)鏈由不同的氨基酸Ｒ側(cè)鏈構(gòu)成。 肽鍵的結(jié)構(gòu)特點：酰胺氮上的孤對電子與相鄰羰基之間的共振作用，穩(wěn)定性高。肽鍵亞氨基在pH0－14內(nèi)不解離，６個原子幾乎處在同一平面內(nèi)。 2．肽的化學性質(zhì) 肽的α－羧基、α－

15、氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。 含有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。肽與雙縮脲反應(yīng)生成紫色或藍紫色化合物，這是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無此反應(yīng)。 3.生物活性肽 生物體內(nèi)有很多具有生物活性的多肽和寡肽，稱活性肽?；钚噪脑谏锏纳L、發(fā)育、細胞分化、大腦功能、免疫、生殖、衰老、病變等過程中起重要作用?；钚噪氖羌毎麅?nèi)部、細胞間、器官間信息傳遞的主要化學信使，很多激素、抗生素都屬于肽類或肽衍生物。 （三）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu) 1．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次 一級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序（含二硫鍵）。二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈中各個

16、肽段借助氫鍵形成有規(guī)則的構(gòu)象。主要有α－螺旋、β－折疊和β－轉(zhuǎn)角。超二級結(jié)構(gòu)：由兩個或兩個以上二級結(jié)構(gòu)單元相互聚集，形成的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)的組合體。例如αα、βαβ、βββ等結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域：多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)。結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的獨立折疊單位，一般由100－200個氨基酸殘基構(gòu)成。三級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種非共價鍵的作用力，通過彎曲、折疊，形成具有一定走向的緊密球狀構(gòu)象。球狀構(gòu)象的比表面積最低，使蛋白質(zhì)與周圍環(huán)境的相互作用力最小。四級結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系和結(jié)合方式。 2．蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定 蛋白質(zhì)測序的基本策略：用兩種以上不同的裂解方

17、法裂解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生兩套切點不同的肽段。分離、純化每一個肽段，分別測定每一個肽段的氨基酸序列，用重疊法拼接出一條完整的肽鏈。 主要步驟： A.根據(jù)蛋白質(zhì)末端分析結(jié)果和相對分子質(zhì)量，確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 B.如果蛋白質(zhì)是寡聚蛋白，用變性劑（如8.0mol/L尿素）拆分蛋白質(zhì)亞基。 C.斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵。 D.分析每一條多肽鏈的氨基酸組成，計算多肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)目。 E.分析N－末端和C－末端氨基酸，確定氨基酸測序的兩個端點。 F.選用兩種不同的裂解方法將一條多肽鏈裂解成兩套重疊的肽段，分離純化每一個肽段，分別用Edman降解法測定每一個肽段的氨基酸序列。 G.用

18、片斷重疊法拼接出一條完整的肽鏈。 H.確定二硫鍵的位置。 I.確定肽鏈中的天冬酰胺和谷氨酰胺 3．同源蛋白質(zhì) 在不同生物體內(nèi)具有相同或相似功能的蛋白質(zhì)。例如，血紅蛋白在不同的脊椎動物中都具有輸送氧氣的功能。 同源蛋白質(zhì)的特點： （1）多肽鏈長度相近，氨基酸序列相似。 （2）同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基。不變殘基高度保守，是必需的。如果不變殘基發(fā)生變化，會影響蛋白質(zhì)的功能。 （3）除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基?？勺儦埢?，個別氨基酸的變化不一定影響蛋白質(zhì)的功能。 （四）蛋白質(zhì)的二級機構(gòu)和纖

19、維狀蛋白質(zhì) 1．多肽主鏈的折疊 ⑴多肽鏈的共價主鏈上所有的α－碳原子都參與形成單鍵，因此一個多肽主鏈可能有無限多種構(gòu)象。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的多肽鏈只有一種或很少幾種構(gòu)象，這種構(gòu)象稱蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)具有生物活性，且相當穩(wěn)定。在生物體內(nèi)天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)主鏈上的單鍵不能自由旋轉(zhuǎn)。⑵肽鏈的二面角，肽鏈的所有可能構(gòu)象都能用Φ和Ψ這兩個構(gòu)象角來描述，稱二面角。⑶多肽鏈折疊的空間限制，Φ和Ψ同時為0的構(gòu)象實際不存在，因為兩個相鄰平面上的酰胺基氫原子和羰基氧原子的接觸距離比其范德華半經(jīng)之和小，空間位阻。二面角（Φ、Ψ）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無阻礙

20、。 2．拉氏構(gòu)象圖 ⑴實線封閉區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的，且構(gòu)象穩(wěn)定。⑵虛線封閉區(qū)域是最大允許區(qū)，立體化學允許，但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。⑶虛線外區(qū)域是不允許區(qū)，該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象，都是不允許的，此構(gòu)象中非鍵合原子間距離小于最小允許距離，排斥力很大，構(gòu)象極不穩(wěn)定。 3．蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要動力有:a.暴露在溶劑中的疏水基團降低至最少程度。B.保持處于伸展狀態(tài)的多肽鏈和周圍水分子間形成的氫鍵相互作用的有利能量狀態(tài)。 ⑴α－螺旋 α－螺旋是蛋白質(zhì)中常見的一種二級結(jié)構(gòu)，肽鏈主鏈繞中心軸盤繞成螺旋狀，相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵。在3.613螺旋中，二面角Φ=

21、－57°，Ψ=－48°，肽鍵上N－H氫與它后面（N端）第四個殘基上的C=O氧間形成氫鍵，螺距是0.54nm，每一圈含有3.6個氨基酸殘基，每個殘基沿著螺旋的長軸上升0.15nm，氨基酸殘基的側(cè)鏈向外伸展。α－螺旋的種類有2.27螺旋（n=1），310 螺旋（n=2），3.613螺旋（n=3）和4.316螺旋（n=4）。 氨基酸側(cè)鏈對α－螺旋穩(wěn)定性的影響①如果多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷的氨基酸殘基，（例如Lys，或Asp，或Glu），則由于靜電排斥，不能形成鏈內(nèi)氫鍵，從而不能形成穩(wěn)定的α－螺旋。例如多聚賴氨酸和多聚谷氨酸。而當這些殘基分散存在時，不影響α－螺旋穩(wěn)定。②甘

22、氨酸的Φ角和Ψ角可取范圍較大，在肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)時，使形成α－螺旋所需的二面角的可能性很小，不易形成α－螺旋。絲心蛋白含50%Gly，不形成α－螺旋。③肽鏈中的R基較大（如Ile）時，不易形成α－螺旋。脯氨酸和羥脯氨酸終止α－螺旋。④R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于a-螺旋的形成。蛋白質(zhì)中的α－螺旋幾乎都是右手螺旋，但也有例外，在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手α－螺旋，由Asp－Asn－Gly－Gly（226－229）組成，二面角是φ+64°和Ψ+42°。 ⑵.β－折疊 兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈側(cè)向聚集在一起，相鄰肽鏈主鏈上的N－H氫和C=O氧之間形成氫鍵，這樣的

23、多肽構(gòu)象就是β－折疊。β－折疊中所有的肽鏈都參與鏈間氫鍵的形成，側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。β－折疊有平行式和反平行式2種。平行式：所有參與β－折疊的肽鏈的N末端在同一方向，二面角φ=－119°，Ψ=+113°。反平行式：肽鏈的極性－順－倒，N末端間隔相同，二面角φ=－139°，Ψ=+135°。在纖維狀蛋白質(zhì)中β－折疊主要是反平行式，而在球狀蛋白質(zhì)中反平行和平行兩種方式都存在。 在纖維狀蛋白質(zhì)的β－折疊中，氫鍵主要是在肽鏈之間形式；而在球狀蛋白質(zhì)中，β－折疊既可在不同肽鏈間形成，也可在同一肽鏈的不同肽段間形成。從能量角度看，反平行β－折疊比平行

24、的更穩(wěn)定，前者的氫鍵NH---O幾乎在一條直線上，氫鍵最強。 ⑶.β－轉(zhuǎn)角 β－轉(zhuǎn)角是指蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的180°回折，有時稱之為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。由第一個氨基酸殘基的C=O與第四個氨基酸殘基的N－H間形成氫鍵。目前發(fā)現(xiàn)的β－轉(zhuǎn)角多數(shù)在球狀蛋白質(zhì)分子表面，β－轉(zhuǎn)角在球狀蛋白質(zhì)中含量十分豐富，約占全部殘基的1/4。 β－轉(zhuǎn)角的特征：①由多肽鏈上4個連續(xù)的氨基酸殘基組成。②主鏈骨架以180°返回折疊。③第一個氨基酸殘基的C=O與第四個氨基酸殘基的N－H形成氫鍵。④C1與C4之間距離小于0.7nm。⑤多數(shù)由親水氨基酸殘基組成。 ⑷.無規(guī)卷曲 沒有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)象。二

25、面角φ、Ψ存在于拉氏圖上所有允許區(qū)域，它在球狀蛋白中含量較高，對外界物理、化學因素敏感，與蛋白質(zhì)的生物活性有關(guān)。 α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角和β－折疊的二面角φ、Ψ在拉氏構(gòu)象圖上有固定區(qū)域，而無規(guī)卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允許區(qū)域內(nèi)。 ⑸.超二級結(jié)構(gòu) 兩個或兩個以上二級結(jié)構(gòu)單元相互聚集，形成的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)的組合體。超二級結(jié)構(gòu)有aa、βaβ和βββ三種基本的組合形式。 ⑹.結(jié)構(gòu)域和功能域 多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)。結(jié)構(gòu)域是獨立的緊密球狀實體，是蛋白質(zhì)的獨立折疊單位，一般由100－200個氨基酸殘基構(gòu)成。 功能域是蛋白質(zhì)分子中能獨立存在的功能單位。功

26、能域可以是一個結(jié)構(gòu)域，也可以由兩個或兩個以上結(jié)構(gòu)域組成。 4.纖維狀蛋白質(zhì) 纖維狀蛋白質(zhì)是動物體的基本支架和外保護成分，占脊椎動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的一半以上。分子是有規(guī)則的線形結(jié)構(gòu)，外形是纖維狀或棒狀。纖維狀蛋白質(zhì)分為不溶性和可溶性兩類，不溶性的主要有角蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白，可溶性的有肌球蛋白和血纖維蛋白。 （五）蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)與功能 1．蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu) ⑴蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 在二級結(jié)構(gòu)（a－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）的基礎(chǔ)上，多肽鏈借助各種非共價鍵的作用，通過彎曲、折疊，形成具有一定走向的緊密球狀構(gòu)象。球狀構(gòu)象的比表面積最小，使得蛋白質(zhì)與周圍環(huán)境的相互作

27、用力最小。 ⑵．球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)特征 球狀蛋白質(zhì)都有各自獨特的三維結(jié)構(gòu)，但是它們都具有以下共同的結(jié)構(gòu)特征。球狀蛋白質(zhì)含有二種或二種以上二級結(jié)構(gòu)單元（a－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲），具有明顯的折疊層次，是緊密的球狀或橢球狀實體，疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子表面，分子表面有一個裂隙，通常是底物或效應(yīng)物的結(jié)合部位。 ⑶.膜蛋白的結(jié)構(gòu) 膜蛋白可以分為膜周邊蛋白和膜內(nèi)在蛋白。膜周邊蛋白是可溶性球狀蛋白質(zhì)，分布在膜表面，通過非共價鍵與膜結(jié)合。膜內(nèi)在蛋白通過疏水肽段錨定在膜上，膜內(nèi)在蛋白主要有三種：單個跨膜肽段的膜蛋白、7個跨膜肽段的膜蛋白和β桶型膜蛋白。還有一些蛋白質(zhì)能與

28、膜上的脂質(zhì)形成共價鍵，錨定在膜上，形成膜蛋白。 ⑷.蛋白質(zhì)的折疊 蛋白質(zhì)折疊時，通過積累選擇形成自由能最低的構(gòu)象。球狀蛋白質(zhì)的折疊步驟：先快速形成局部二級結(jié)構(gòu)（a－螺旋和β－折疊）；再形成初始的結(jié)構(gòu)域，并由結(jié)構(gòu)域形成熔球態(tài)；最后調(diào)整結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，形成完整的三級結(jié)構(gòu)。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的折疊需要分子伴侶的參與。 ⑸.蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的作用力主要是非共價鍵作用力，其中包括氫鍵、范德華力、疏水作用和鹽鍵，此外還有二硫鍵。 ⑹.蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)涉及亞基的種類和數(shù)目，以及各個亞基在整個蛋白質(zhì)分子中的空間排布，亞基間的接觸位點（結(jié)構(gòu)互補）和作

29、用力（非共價作用力）。四級結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)和功能上的優(yōu)點：① 可以增強蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。② 可以提高遺傳經(jīng)濟性和效率。③ 使得酶分子的不同催化亞基聚積在一起，提高催化效率。④ 使得蛋白質(zhì)具有協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)。 2. 球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 ⑴．肌紅蛋白在哺乳動物細胞中存儲和分配的氧 肌紅蛋白由一條多肽鏈組成，分子中多肽主鏈由8段直的a－螺旋組成，最長的a－螺旋有23個氨基酸殘基，最短的a－螺旋有7個氨基酸殘基，75%的氨基酸殘基處在a－螺旋區(qū)內(nèi)。肌紅蛋白多肽鏈繞曲成球狀分子，疏水氨基酸殘基幾乎全部在分子內(nèi)部，例如Val、Leu、Met、Phe等，親水氨基酸殘基幾乎全部在球狀分子的外表面

30、。4個Pro殘基各自處在1個拐彎處，Ser、Thr、Asn和Ile分別處在另外4拐彎處。血紅素中，卟啉環(huán)中心的Fe2+有六個配位鍵，其中4個與平面卟啉分子的N結(jié)合，另外兩個與卟啉平面垂直，1個與93位His(F8)的咪唑基的N結(jié)合，另一個處于開放狀態(tài)，可以結(jié)合O2。肌紅蛋白為血紅素提供了一個疏水環(huán)境，避免Fe2+被氧化而失去氧結(jié)合能力。 ⑵．血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 血紅蛋白在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運氧。血紅蛋白分子接近于球體，4個亞基分別在四面體的四個角上，每個亞基上有一個血紅素輔基。HbA是成人體內(nèi)主要的血紅蛋白，具有a2 b2的亞基結(jié)構(gòu)。血紅蛋白與氧結(jié)合具有別構(gòu)效應(yīng)，氧合曲線是S形曲線。氧與第

31、一個血紅素的結(jié)合后，有助于后續(xù)的氧與血紅蛋白分子中其余的三個血紅素結(jié)合。在肌肉組織中，H+和CO2促進血紅蛋白釋放O2；在肺泡毛細管中，O2促進血紅蛋白釋放H+和CO2。2、3－二磷酸甘油酸（BPG）是血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)物，它能與去氧血紅蛋白結(jié)合，降低血紅蛋白對氧的親和力。 ⑶．鐮刀狀細胞貧血的分子機理 鐮刀狀細胞貧血是由于基因突變，引起血紅蛋白分子中氨基酸殘基被替換所造成的。人的血紅蛋白分子的四條肽鏈中，只有兩個Glu分子變化成Va1分子，就能發(fā)生鐮刀狀細胞貧血病。正常人血紅蛋白，β6是Glu，鐮刀狀細胞貧血的患者的血紅蛋白β6是Val。在生理條件下，Va1不帶電荷，疏水，Glu帶負電

32、荷，親水。 3．免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)特點和功能 ⑴．抗原與抗體 抗原是指進入異體機體后，能致敏淋巴細胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特異結(jié)合的物質(zhì)，主要有蛋白質(zhì)、核酸以及其它高分子化合物。抗體是在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合并產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球狀蛋白質(zhì)，稱免疫球蛋白。抗體具有高度特異性和多樣性，人類能夠產(chǎn)生超過108種的抗體。 ⑵. 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)特點 IgG分子由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成，四條肽鏈間有二硫鍵連接。重鏈的分子量為53000左右，輕鏈的分子量為22000左右。重鏈和輕鏈各分兩個區(qū)域，重鏈N-端1/4為可變區(qū)，C-

33、端3/4為恒定區(qū)，輕鏈N-端1/2為可變區(qū)，C-端1/2為恒定區(qū)。重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)共同組成一個抗原結(jié)合部位。 ⑶. 抗體－抗原反應(yīng) 以IgG為例，一個IgG分子含有2個抗原結(jié)合部位，它們位于Y形結(jié)構(gòu)的2個臂的頂端。如果抗原分子含有2個抗原決定簇，抗體可以形成抗原－抗體的交聯(lián)晶格，產(chǎn)生沉淀反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的條件：抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補，抗原與抗體有對應(yīng)的化學基團，通過作用力（離子鍵、氫鍵）使二者結(jié)合?？乖贵w反應(yīng)可以廣泛用于生物化學分析，例如免疫擴散，免疫電泳，酶聯(lián)免疫分析和Western印跡。 （六）蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其應(yīng)用 1．蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子中，側(cè)

34、鏈上各種可解離基團以及末端的a－氨基和a－羧基的解離性質(zhì)，決定了蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量。在溶液中，當某種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零時，對應(yīng)的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)的等電點和它所含的酸性氨基酸的殘基數(shù)與堿性氨基酸的殘基數(shù)之比有關(guān)系。酸性氨基酸殘基的含量越高，等電點越低；堿性氨基酸殘基的含量越高，等電點越高。在等電點條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度、粘度均為最小值。 2．蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 某些物理或化學因素（高溫、高壓、紫外線和表面張力、強酸、強堿、有機溶劑、脲和胍）能破壞蛋白質(zhì)分子的次級鍵，使得蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象解體，但一級結(jié)構(gòu)不變。蛋白質(zhì)變性的后果是生物活性喪失，側(cè)鏈基團外露，物理

35、、化學性質(zhì)改變，生物化學性質(zhì)改變。蛋白質(zhì)的復(fù)性是指當變性因素除去以后，變性的蛋白質(zhì)又可以重新回復(fù)到原來的天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)的復(fù)性實驗證明，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。 3．凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)相對分子量的原理 不同大小的蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，被排阻在顆粒之外，通過顆粒之間的間隙快速流出層析柱。比凝膠孔徑小的分子能不同程度地進入凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，因此不同大小的蛋白質(zhì)分子在層析柱中移動的路徑不同，分子量大的蛋白質(zhì)先流出柱子，分子量小的蛋白質(zhì)后流出柱子。 4．SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量的原理 SDS是強變性劑，

36、能破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用力，巰基乙醇能打開二硫鍵。在有SDS和巰基乙醇存在下，單體蛋白或亞基的多肽鏈展開。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合，使得多肽鏈帶上大量的相同密度的負電荷，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差異，使得不同蛋白質(zhì)的電荷/質(zhì)量比相同。此外在SDS的作用下，SDS－蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中呈棒狀，直徑約為1.8nm，長度與蛋白質(zhì)的相對分子量成正比。分子量小的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移速度快，分子量大的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移速度慢。 5．蛋白質(zhì)的分離純化方法 蛋白質(zhì)的分離純化主要涉及兩個方面：①蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)化合物的分離。②不同種類蛋白質(zhì)之間分離?？梢岳玫鞍踪|(zhì)與非蛋白質(zhì)之間物理、化學性質(zhì)的差異，

37、以及蛋白質(zhì)之間物理、化學性質(zhì)的差異來分離蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)溶解度的差異：不同的蛋白質(zhì)在同一種溶劑中溶解度不同，同一種蛋白質(zhì)在不同的溶劑中溶解度不同。主要有PEG沉淀法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法和熱變性法。 蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)的差異：不同蛋白質(zhì)中含有的酸性氨基酸殘基與堿性氨基酸殘基的比例不同，它們的等電點不同，在一定的pH環(huán)境中帶有的電荷性質(zhì)和電荷量不同。因此可以用離子交換層析法和電泳法分離純化蛋白質(zhì)。電泳法主要有聚丙烯酰氨凝膠電泳、毛細管電泳、等電聚焦電泳和層析聚膠電泳。 分子大小的差異：可以根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同，選用凝膠過濾法、超濾法、透析法和離心法來分離純化蛋白質(zhì)。 與配體親和力

38、的差異：根據(jù)不同的蛋白質(zhì)能分別與相應(yīng)的特異性配體非共價結(jié)合，利用親和層析法可以分離純化蛋白質(zhì)。 6．蛋白質(zhì)含量的測定 測定總蛋白質(zhì)含量的方法有：凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin－酚法和紫外吸收法。測定某一種特定蛋白質(zhì)的含量，可以用生物學的方法。對于酶或激素蛋白，可以利用它們的酶活性或激素活性來測定。對于不具備酶活性或激素活性的蛋白質(zhì)，可以利用抗體－抗原反應(yīng)來測定。 7．蛋白質(zhì)純度的鑒定 鑒定蛋白質(zhì)純度的方法主要有電泳法、高效液相層析（HPLC）法、溶解度分析法、沉降法和N末端氨基酸分析法。電泳法主要有等電聚焦電泳，毛細管電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。如果是純的均

39、一的蛋白質(zhì)，電泳法、高效液相層析法分析圖譜上只出現(xiàn)一個條帶或一個峰。 三、重點、難點 重點：氨基酸的結(jié)構(gòu)，氨基酸側(cè)鏈的物理、化學性質(zhì)與多肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。氨基酸的兩性性質(zhì)，氨基酸的化學性質(zhì)與應(yīng)用。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定，肽的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性，蛋白質(zhì)的折疊。纖維蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征與功能，球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征與功能。肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點和氧合曲線。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。蛋白質(zhì)的分離純化方法及純度鑒定。 難點：氨基酸的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，氨基酸滴定曲線，氨

40、基酸的化學反應(yīng)及其應(yīng)用，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，寡聚蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，肌紅蛋白與血紅蛋白的氧合曲線，蛋白質(zhì)的分離純化方法。 四、典型例題解析 例題3-1：對蛋白質(zhì)中自然發(fā)生的氨基酸替換的研究結(jié)果如下，請解釋下列現(xiàn)象。 （1）絲氨酸的替換最不容易引起蛋白質(zhì)功能的改變。 （2）色氨酸的替換最容易引起蛋白質(zhì)功能的改變。 （3）Lys→Arg和Ile→Leu這樣的替換一般對蛋白質(zhì)的功能基本沒有影響。 解:蛋白質(zhì)分子中，氨基酸殘基側(cè)鏈基團的大小、電荷性質(zhì)和極性的改變都可能引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能。 （1）Ser具有一個中等大小的

41、側(cè)鏈，側(cè)鏈是極性的，不帶電荷。極性不帶電荷的殘基（Asn、Gln或Thr）或者極性帶電荷的殘基（Arg、Asp、Glu或Lys）有可能取代Ser，不會顯著破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象。 （2）Trp側(cè)鏈的的疏水性最強，往往出現(xiàn)在球狀分子的內(nèi)部。在蛋白質(zhì)疏水核內(nèi)，Phe苯環(huán)形成的范德華力的能力比Trp吲哚環(huán)的要小，會引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，影響蛋白質(zhì)的功能。 （3）Lys和Arg的側(cè)鏈都帶正電荷，且長度相近。Ile和Leu大小相似，且都疏水。這兩種替代幾乎不影響蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象，因此不會影響蛋白質(zhì)的功能。 例題3-2：（a）Tris是一個弱酸（Ka=8.3×10-9mol/L，它

42、是生化實驗中常用的緩沖劑。問在pH8.00時，Tris有其共軛酸（Tris-H+）的比值是多少？（b）若上述溶液中Tris的總濃度為100mmol/L，在加入5mmol/L(H+)后，溶液pH值是多少？若Tris的總濃度減少到20mmol/L，pH變化又是多少？ 解：（a）因為pH=pKa+1g（[Tris]/[Tris-H+]） pKa=-1gKa=8.08 所以8.00=8.08+1g（[Tris]/[Tris-H+]） [Tris]/[Tris-H+]=0.83 (b)若[Tris]+[Tris-H+]=1

43、00mmol/L 則根據(jù)（a）中結(jié)果可得： [Tris]=45mmol/L [Tris-H+]=55mmol/L 當加入5mmol/LH+后，則[Tris]減少5mmol/L，而[Tris-H+]增加5mmol/L，即： [Tris]=4 0mmol/L [Tris-H+]=60mmol/L 因此 pH=pKa+1g（[Tris]/[Tris-H+]） 8.08+1g（40/60）=7.9 即加入5mmol/LH+可使pH降低0.1單位。 若Tris的總濃度為20mmol/L，則

44、 [Tris]+[Tris-H+]=20mmol/L [Tris]/[Tris-H+]=0.83 所以 [Tris]=9mmol/L [Tris-H+]=11mmol/L 加入5mmol/LH+后，則[Tris]減少到4mmol/L，而[Tris-H+]增加到16mmol/L， pH=pKa+1g（[Tris]/[Tris-H+]） 8.08+1g4/16）=7.48 即此時加入5 mmol/L可使pH降低0.52個單位。 例題3-3：用陽離子交換層析分離下列每一對氨基酸，用pH7的緩沖溶液洗

45、脫，哪一種氨基酸先從離子交換柱上流出，為什么？A. Lys與Met。B. Lys與Asp。C. Glu與Met。D. Gly與Leu。E. Ser與Ala。 解：影響氨基酸流出順序的主要因素是： （1）pH7時氨基酸的電荷性質(zhì)和電荷量，通常等電點低的氨基酸帶有負電荷，不與陽離子交換樹脂結(jié)合，因此會先流出，反之，帶正電荷，后流出。 （2）電荷量相同或相近時，側(cè)鏈R基團疏水性強的氨基酸與樹脂基質(zhì)作用力大，因此會后流出。 A. Met先流出。Lys的等電點pI=9.74，Met的等電點pI=5.75，在pH7時Lys帶有一個的正電荷，與陽離子交換樹脂結(jié)合牢固。而Met帶負電荷，不能與陽離子交

46、換樹脂結(jié)合，因此Met先流出。B. Asp先流出（Asp的pI=2.97）。 C. Glu先流出（Glu的pI=3.22）。D. Gly先流出（Gly的pI=5.97，Leu的pI=5.98）。這兩種氨基酸的等電點幾乎相同，這時要考慮它們的側(cè)鏈基團的疏水性。Gly的側(cè)鏈基團的疏水性比Leu的小，與樹脂基質(zhì)作用力小，因此Gly先流出。E. Ser先流出。Ser的等電點是pI=5.68，Ala的等電點是pI=6.02，而且Ala側(cè)鏈的疏水性比Ser的大。 例題3-4：結(jié)合肌紅蛋白和血紅蛋白的氧合曲線，簡述動物體內(nèi)的氧從肺中轉(zhuǎn)運到肌肉中的過程。肺泡中的p（O2）為100torr，肌肉的毛細管中p（

47、O2）為20 torr，P50=26torr。血紅蛋白在肺泡中的Y值是0.97，在肌肉的毛細管中的Y值是0.25。肌紅蛋白的P50=2torr。 解：肌紅蛋白是單亞基的氧結(jié)合蛋白，它的氧合曲線是雙曲線。血紅蛋白是含有4個亞基的氧結(jié)合蛋白，亞基間存在協(xié)同效應(yīng)，它的氧合曲線是S形曲線。血紅蛋白在肺泡中的氧分數(shù)飽和度Y是0.97，因此肺泡中的血紅蛋白能大量地結(jié)合氧，并且將氧運到肌肉組織中。在肌肉毛細血管中，血紅蛋白的氧分數(shù)飽和度Y是0.25，大量釋放氧，氧的釋放量△Y是0.72。肌肉毛細血管中的肌紅蛋白的P50=2 torr，可以高度結(jié)合血紅蛋白釋放的氧。 例題3-5：分離純化蛋白質(zhì)的一般原則是

48、什么? 解：在分離純化某一個特定蛋白質(zhì)時，通常要求在盡量保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和活性的同時，提高蛋白質(zhì)的純度、均一性和回收率，一般可以分為以下幾步。 （1）前處理 用各種方法將細胞破碎，使蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放到提取液中，用過濾或離心法除去細胞碎片。動物組織和細胞可以用電動搗碎機、勻漿器或超聲波破碎機處理。植物組織和細胞可以用石英砂與提取液一起研磨，或用纖維素酶處理。細菌細的胞壁可以用超聲波破碎機處理，與石英砂研磨或用溶菌酶處理。 （2）粗分級分離 前處理得到的蛋白質(zhì)溶液中含有大量的雜蛋白以及少量的核酸和多糖，可以選用適當?shù)姆椒?，去除雜蛋白。一般可以采用鹽析、等電點沉淀或有機溶液

49、沉淀等方法。 （3）細分級分離 粗分級分離步驟已經(jīng)將大部分雜蛋白除掉，細分級分離可以將樣品進一步純化。一般用凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等方法。又是還可以采用各種電泳方法。 （4）結(jié)晶 這是分離純化的最后一步，結(jié)晶和重結(jié)晶可以進一步純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度標志，還表明蛋白質(zhì)處于天然狀態(tài)，沒有發(fā)生變性。 例題3-6：凝膠過濾層析與凝膠電泳中的分子篩效應(yīng)有什么不同？為什么？ 解：這兩種分離方法的原理不同。在凝膠過濾層析中，分子量大的蛋白質(zhì)不能進入凝膠孔隙內(nèi)部，只能穿過凝膠顆粒之間的間隙，很快流出層析柱。因此，分子量大的蛋白質(zhì)，移動的路徑短，移動速度較快；分子量小的蛋白

50、質(zhì)，移動的路徑長，移動速度較慢。而在凝膠電泳中，整個凝膠是一個完整的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子量大的蛋白質(zhì)與分子量小的蛋白質(zhì)都必須穿過凝膠，移動的路徑是相同的。分子量大的蛋白質(zhì)在膠孔中的摩擦力較大，移動速度較慢，分子量小的蛋白質(zhì)在膠孔中的摩擦力較小，移動速度較快。 例題3-7：什么是蛋白質(zhì)的變性作用？引起蛋白質(zhì)變性的因素有哪些? 解：蛋白質(zhì)的變性作用，是指蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象解體，多肽鏈由有序狀態(tài)成為伸展松散的無規(guī)則狀態(tài)。變性作用一般不涉及肽鍵的斷裂，而主要是次級鍵斷裂。變性后的蛋白質(zhì)，溶解度降低，粘度增加，失去生物活性，失去結(jié)晶能力，易被蛋白酶水解。 引起蛋白質(zhì)變性的因素有兩

51、大類：物理因素：高溫、高壓、紫外線、超聲波。化學因素：強酸、強堿、重金屬、變性劑。 例題3-8：蛋白質(zhì)化學研究中常用的試劑有：溴化氰，尿素，b巰基乙醇，胰蛋白酶，過甲酸，丹磺酰氯，6 mol/L鹽酸，茚三酮，異硫氰酸苯酯，和胰凝乳蛋白酶。為完成下列各項實驗，請選擇最合適的試劑。 A.一個小肽的氨基酸序列測定 B.多肽的N末端氨基酸測定 C.一個不含二硫鍵的蛋白質(zhì)的可逆變性 D.芳香族氨基酸殘基的羧一側(cè)肽鍵的水解 E.甲硫氨酸的羧基一側(cè)肽鍵的裂解 F.通過氧化途徑將二硫鍵打開 解：A. 小肽的氨基酸序列測定用異硫氰酸苯酯 B. 多肽的N末端氨基酸測定用丹磺酰氯 C. 不含二硫

52、鍵的蛋白質(zhì)的可逆變性用尿素 D. 芳香族氨基酸殘基的羧一側(cè)肽鍵的水解用胰凝乳蛋白酶 E. 甲硫氨酸的羧基一側(cè)肽鍵的裂解用溴化氰 F. 通過氧化途徑將二硫鍵打開用過甲酸 例題3-9：多聚谷氨酸在pH3.0以下的水溶液中形成α－螺旋，而在pH5.0以上的水溶液中卻為伸展狀態(tài)，試解釋這個現(xiàn)象。在什么pH條件下，多聚賴氨酸會形成α－螺旋？ 解：氨基酸側(cè)鏈基團的解離性質(zhì)對α－螺旋的形成有很大的影響。由單一一種氨基酸構(gòu)成的聚合物，只有當側(cè)鏈基團不帶電荷時才能形成α－螺旋。因為相鄰殘基的側(cè)鏈上帶有同種電荷會產(chǎn)生靜電排斥力，阻止α－螺旋的形成。谷氨酸側(cè)鏈的pKa為4.1，在pH3.0以下的水

53、溶液中多聚谷氨酸側(cè)鏈幾乎不帶電荷，能夠形成α－螺旋。在pH5.0以上的水溶液中，多聚谷氨酸側(cè)鏈幾乎全部帶負電荷，不能形成α－螺旋，呈現(xiàn)伸展狀態(tài)。 賴氨酸側(cè)鏈的pKa為10.5，當pH遠高于10.5時，多聚賴氨酸的側(cè)鏈不帶電荷，可以形成α－螺旋。當pH遠低于10.5時，多聚賴氨酸的側(cè)鏈帶正電荷，呈現(xiàn)伸展狀態(tài)。 例題3-10：試解釋下列現(xiàn)象。用熱水洗滌羊毛衫時，羊毛衫會變長，但是在電熱干燥器內(nèi)干燥時，羊毛衫又會收縮。而絲綢制品經(jīng)過同樣的處理卻不收縮。 解：羊毛纖維的多肽鏈的基本結(jié)構(gòu)單位是α－螺旋，每個氨基酸殘基沿α－螺旋的軸向長度是0.15nm。在加熱條件下，纖維中的部分α－螺旋轉(zhuǎn)化為β－折

54、疊構(gòu)象。β－折疊中每個氨基酸殘基的軸向長度是0.65－0.7nm，所以羊毛纖維伸展變長。當干燥以后，多肽鏈又由β－折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)棣粒菪龢?gòu)象，羊毛纖維收縮。 絲綢纖維中主要是絲心蛋白，多肽鏈由β－折疊構(gòu)象組成，在加熱條件下不會發(fā)生α－螺旋構(gòu)象與β－折疊構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)化，因此絲綢纖維在熱水洗滌和干燥時基本不會出現(xiàn)伸展和收縮現(xiàn)象。 例題3-11：有一蛋白質(zhì)，在某組織內(nèi)含量較低，很難分離提純，現(xiàn)已知其分子量，并從其它實驗室要來該蛋白質(zhì)的抗體，問用哪些實驗方法可以初步證實組織內(nèi)的確含有該蛋白質(zhì)? 解：先用根據(jù)這種蛋白質(zhì)的分子量，選用一定濃度的聚丙烯酰胺作用分離膠，用SDS-PAGE分離從該組織中

55、所提取得到的蛋白質(zhì)。然后，用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，轉(zhuǎn)移到特定類型的薄膜上，最后用酶聯(lián)抗體進行檢測，觀察一種分子量的蛋白質(zhì)條帶是否呈陽性反應(yīng)。如果呈陽性反應(yīng)，則初步證實組織內(nèi)的確含有該蛋白質(zhì)。 例題3-12：假定蛋白質(zhì)是在pH7.0低離子強度的溶液中,下述蛋白質(zhì)的哪些氨基酸殘基能形成:(1)α螺旋；(2)β折疊；(3)無規(guī)則卷曲；(4)二硫鍵。 Ile-Cys-Pro-Val-G1n-His-Tyr-Thr-A1a-Phe- Cys-Trp-Leu-Met-Pro-C1y-G1y-Hypro-Phe- Gly- 5 10

56、 15 20 Ala-Gly-Ala-G1y-Ser-Gly-Ala-Gly-Ile-Glu- Asn-Glu-Gln-Asn-Met-Ala-His-Phe-Trp- Tyr- 25 30 35 40 LYs-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Cys-Glu-Ile-Gly- Ser-G1y-Ser-Gly-Ala-G1y-Ser-G1y-Arg- Arg- 45 50

57、 55 60 Lys-Gly-Arg-Gly-Arg-Pto-Hypro 65 解：(1)α螺旋：4～14，29～40 (2)β折疊：20-28和58-50形成反平行的β折疊。 (3)無規(guī)卷曲：15～19，41～49(帶電荷的殘基)，59～65。 (4)二硫鍵：2位或11位的Cys可以和47位Cys形成二硫鍵。 例題3-13：根據(jù)以下實驗結(jié)果推斷一多肽鏈的氨基酸序列。 (1)酸水解和氨基酸組成為Ala2，Arg，Lys2，Met，Phe，Ser2。 (2)

58、羧肽酶A水解得一氨基酸為Ala。 (3)胰蛋白酶水解得四個肽段，其氨基酸組成如下： ①Ala，Arg ②Lys，Phe，Ser ③Lys ④Ala，Met，Ser。 (4)溴化氰水解得兩個肽段，其氨基酸組成如下： ①Ala，Arg，Lys2，Met，Phe，Ser②Ala，Ser。 (5)嗜熱菌蛋白酶水解得兩個肽段，其氨基酸組成如下： ①Ala, Arg, Ser ②Ala,Lys2,Met, Phe, Ser。 解：從(1)可知該肽為九肽。 從(2)可知其C端為Ala。 從(2)(3)和胰蛋白

59、酶的專一性可知如下肽段： (A)Ala-Arg (B)(Phe，Ser)-Lys (C)Lys (D)(Met，Set)-Ala 從(4)和(2)可知：(E)…Met-Ser-Ala 從(5)和嗜熱菌蛋白酶的專一性可知：(F)…Phe-(Ala，Lys2，Met，Ser) 從(E)和(F)可知：(G)…Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala 從(A)(B)(G)可知該肽的氨基酸序列為Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala 例題3-14：有三種未知的蛋白質(zhì)A、B、C。一種蛋白

60、質(zhì)主要是α螺旋構(gòu)象。另一種主要是β折疊構(gòu)象。還有一種是三股螺旋的膠原蛋白。用氨基酸分析儀測定了每種蛋白質(zhì)的氨基酸組成。結(jié)果如表3—1所示，你能指出哪種蛋白質(zhì)相應(yīng)于哪種構(gòu)象嗎?為什么? 表3-1 三種蛋白質(zhì)的氨基酸組成（摩爾百分數(shù)） 蛋白質(zhì) A B C 蛋白質(zhì) A B C Ala 29.4 5.0 10.7 Leu 0.5 6.9 2.4 Arg 0.5 7.2 5.0 Lys 0.3 2.3 3.4 Asp 1.3 6.0 4.5 Met - 0.5 0.8 Cys - 11.2 - Phe 0.5 2.5

61、1.2 Glu 1.0 12.1 7.1 Pro 0.3 7.5 12.2 Gly 44.6 8.1 33.0 Ser 12.2 10.2 4.3 His 0.2 0.7 0.4 Trp 0.2 1.2 - Hypro - - 9.4 Tyr 5.2 4.5 0.4 Ile 0.7 2.8 0.9 Val 2.2 5.1 2.3 解：蛋白質(zhì)A中含小側(cè)鏈的氨基酸多，Gly、Ala和Ser共占86.2％，所以蛋白質(zhì)A是絲蛋白，是β折疊構(gòu)象。蛋白質(zhì)B中半胱氨酸的含量高，占11.2％，所以蛋白質(zhì)B是羊毛纖維，是Q螺旋

62、構(gòu)象。蛋白質(zhì)C中，Gly占33％，Pro占12.2％，Hypro占9.4％，所以蛋白質(zhì)C是三股螺旋的膠原蛋白。 例題3-15：什么是別構(gòu)效應(yīng)(變構(gòu)效應(yīng))? 解： 別構(gòu)效應(yīng)是指生物體內(nèi)具有多個亞基的蛋白質(zhì)與變構(gòu)效應(yīng)劑結(jié)合后而引起其構(gòu)象的改變，從而蛋白質(zhì)分子改變生物活性大小的現(xiàn)象稱為別構(gòu)效應(yīng)。別構(gòu)效應(yīng)是生物體代謝調(diào)節(jié)的重要方式之一。 例如：血紅蛋白分子是由四個亞基(α2β2)組成的蛋白質(zhì)。脫氧血紅蛋白分子由于分子內(nèi)形成了八對鹽鍵，使分子的構(gòu)象受到約束，構(gòu)象穩(wěn)定，和氧的親和力較弱。當一個α-亞基與O2結(jié)合后，部分鹽鍵被破壞，某些氨基酸殘基發(fā)生位移，這時與氧的結(jié)合位點隨即暴露出來

63、，使第二個α-亞基構(gòu)象改變，對氧的親和力增加而與氧結(jié)合。這樣又可以使兩個β-亞基依次發(fā)生構(gòu)象改變而以更高的親和力與氧結(jié)合。這時八對鹽鍵已經(jīng)全部斷裂，α1β2和α2β1之間的位移也達到7埃。血紅蛋白分子的變構(gòu)作用使得整個分子以很快的速度與全部四個氧分子完全結(jié)合，從而提高血紅蛋白分子的攜氧的功能。 例題3-16：在體外，用下列方法處理對血紅蛋白與氧的親和力有什么影響? (1)pH從7.0增加到7.4。 (2)CO2分壓從10torr增加到40torr。 (3)O2分壓從60torr下降到20torr。 (4)2.3-二磷酸甘油酸的濃度從8×10-4mol/L

64、下降到2×10-4mol/L。 (5)α2β2解聚成單個亞基。 解：(1)pH增加，血紅蛋白與氧的親和力增加。 (2)CO2分壓增加，血紅蛋白與氧的親和力下降。 (3)O2分壓下降，血紅蛋白與氧的親和力下降。 (4)2，3—DPG濃度下降，血紅蛋白與氧的親和力增加。 (5)α2β2解聚成單個亞基，血紅蛋白與氧的親和力增加。 五、單元自測題 （一） 名詞解釋或概念比較 1．氨基酸，2．肽鍵與肽，3．結(jié)構(gòu)域，4．單體蛋白和寡聚蛋白，5．蛋白質(zhì)的構(gòu)象與構(gòu)型，6．肽鍵，7．蛋白質(zhì)的化學修飾，8．疏水效應(yīng)，9．分子伴侶，10．Western印跡，11．同促效應(yīng)與異促效

65、應(yīng)，12．Bohr效應(yīng)，13．抗原決定簇，14．半抗原，15．親和層析，16．必須氨基酸與非必須氨基酸，7．透析，18．雙向電泳，19．Edman降解法，20．等電點，21．多克隆抗體與單克隆抗體，22．單純蛋白質(zhì)與綴合蛋白質(zhì)，23．同寡聚蛋白與雜寡聚蛋白，24．等電聚焦。 （二） 填空題 1．氨基酸在晶體狀態(tài)或在水溶液中主要以 形式存在。 2．天冬氨酸的pK1（a－COOH）值是2.09，pK2（β－COOH）值是3.86，pK3（a－NH3+）值是9.82，它的等電點是 。組氨酸的pK1（a－COOH）值是1.82，pK2（咪唑基）值是6.00

66、，pK3（a－NH3+）值是9.17，它的等電點是 。 3．在近紫外區(qū)能吸收紫外光的氨基酸有 ， 和 。其中 的摩爾吸光系數(shù)最大。 4．在氨基酸的含量分析中，可以先用 法分離氨基酸，再用 顯色法進行定量分析。 5．在進行蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列分析中，主要利用 反應(yīng)。 6．根據(jù)蛋白質(zhì)的形狀和溶解度的差異，可以將它們分為 ， 和 。 7．球狀蛋白質(zhì)中，大部分的 氨基酸殘基在分子的表面，而大部分的 氨基酸殘基在分子的內(nèi)核。 8．生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)在折疊過程中通常有 和 參與。 9．目前研究蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的方法主要是 。 10．血紅蛋白（Hb）與氧結(jié)合時呈現(xiàn) 效應(yīng)，是通過血紅蛋白的 現(xiàn)象實現(xiàn)的。肌肉組織中CO2和H+促進O2的釋放，這種現(xiàn)象稱為 效應(yīng)。 11．用溴化氰水解蛋白質(zhì)時，肽鍵在 殘基的右端裂解。 12．用胰凝乳蛋白酶水解蛋白質(zhì)時，肽鍵在 和