布病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)培訓(xùn)PPT課件

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布病病原學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷,布魯氏菌病,布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬（Brucella）的細(xì)菌侵入機(jī)體，引起傳染－變態(tài)反應(yīng)性的人畜共患傳染病。 布魯氏菌病簡稱布病。 布魯氏菌簡稱為布氏菌。,,,,,布病病原學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),1,2,3,布氏菌的生物學(xué)特性,布氏菌的抗原及毒力,布病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),1.1 布氏菌的發(fā)現(xiàn),,,,1887年英國軍醫(yī)Bruce首先從死于“馬耳他熱”的英國士兵的脾臟中分離出羊種布氏菌。,,,1.1布魯氏菌的分類學(xué)位置,微生物分類學(xué)家將布氏菌歸為布魯氏菌屬（Brucella），下分6個(gè)種19個(gè)生物型。,分類,羊種布氏菌（Bvr.melitensis）1，2，3型； 牛種布氏菌（Br.abortus）1，2，3，4，5，6，7，9型； 豬種布氏菌（Br.suis）1，2，3，4，5型； 沙漠森林鼠種布氏菌（Br.neotemae）； 綿羊附睪種布氏菌（Br.ovis）； 犬種布氏菌（Br.canis）。,陜西省布魯氏菌病病原學(xué)調(diào)查分析,自1952年起，在人畜間共分離出3個(gè)種233株布魯氏菌，其中羊種菌227株，占總數(shù)的97.4%。牛種3株、犬種3株。1991年以前流行優(yōu)勢種型為羊1、2型，1996年后則為羊1、3型 。陜西省是以羊型菌為主、牛、犬種布魯氏菌病的混合疫區(qū)。流行優(yōu)勢種隨時(shí)間推移發(fā)生了變化。,1.2形態(tài)和培養(yǎng)特征,布氏菌屬的細(xì)菌是一組微小的球桿狀的革蘭氏染色陰性菌?？率先旧?，布氏菌染成紅色，其他菌染成綠色或藍(lán)色。 寬0.3～0.6μm，長0.6～1.5μm。無芽孢、無鞭毛、無質(zhì)粒、不形成莢膜。 一般說來，羊種菌最小，牛種菌次之，豬種菌最大。,1.2培養(yǎng)特性,營養(yǎng)條件高，生長緩慢，生長所需溫度為20-40℃，最適溫度為37 ℃.通常要經(jīng)過4-6天，有的甚至要經(jīng)過20-30天（雙相培養(yǎng)基）才能長出菌落。,1.3抵抗力,對物理因子的抵抗力 對化學(xué)因子的抵抗力 不同環(huán)境中的抵抗能力 對抗生素的敏感性,不 同 溫 度 對 布 魯 氏 菌 影響,對物理因子的抵抗力,布魯氏菌對消毒劑的抵抗能力,對化學(xué)因子的抵抗力,不同環(huán)境中的抵抗能力,,現(xiàn)已證明，布魯氏菌對四環(huán)素最敏感，其次是鏈霉素，而對枯草桿菌肽、多黏菌素B、多黏菌素M素等有很強(qiáng)的抵抗力。,對抗生素的敏感性,布氏菌的抗原、毒力,2,布氏菌的抗原成分十分復(fù)雜，存在A、M、G成分。A對牛種布氏菌有特異性，M對羊種布氏菌有特異性，G為兩種菌共有。還與多種細(xì)菌存在共同抗原，因而有血清交叉反應(yīng)。布氏菌不產(chǎn)生外毒素，只產(chǎn)生內(nèi)毒素，有致熱、致炎作用，可導(dǎo)致休克。,從種上來說，羊種毒力最強(qiáng)，豬種和牛種次之，犬種的毒力很弱，幾乎不引起人致病。,由于菌種毒力等因素的不同，患病后的臨床表現(xiàn)也不完全一樣。羊 種布魯氏菌的毒力最強(qiáng),患者中毒癥狀嚴(yán)重，多有典型的發(fā)燒、多汗、頭痛、虛弱、關(guān)節(jié)痛、肝脾及睪丸腫大等急性癥狀。 豬種、牛種次之。 犬種的毒力很弱，幾乎不引起人致病。,布氏菌實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),3,診斷布病的金標(biāo)準(zhǔn)。 3.1.1實(shí)驗(yàn)室要求布氏菌的分離培養(yǎng)要在生物安全二級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。 布氏菌是高致病性病原微生物，從危害程度來說為第二類病原微生物。,3.1.2方法采樣（采血） 雙相培養(yǎng)基 菌株鑒定 （菌落形態(tài)觀察、涂片、染色、鏡檢布氏菌診斷血清玻片凝集試驗(yàn)） 種型鑒定（CO2需要與否、H2S的產(chǎn)生的測定、染料抑菌試驗(yàn)、單項(xiàng)因子血清凝集試驗(yàn)、噬菌體裂解試驗(yàn)等等）,,,,3.1.3 布氏菌培養(yǎng)特性 布氏菌是需氧或微需氧菌 生長緩慢，尤其初代分離 牛種部分型別、綿羊附睪種布氏菌需在5-10% CO2環(huán)境中培養(yǎng) 新長出的菌落無色透明，光滑圓形，突起，均質(zhì)，直徑1-2mm 液體培養(yǎng)均勻混濁，無菌膜 粗糙型菌落較大，生長快,布魯氏菌培養(yǎng)材料,3.1.4 布氏菌培養(yǎng)檢查材料人或動(dòng)物的全血、動(dòng)物流產(chǎn)胎兒（胎兒的肝臟、肺、胃內(nèi)容物）動(dòng)物臟器、動(dòng)物胎盤、關(guān)節(jié)液、陰道分泌物等新鮮乳汁,布魯氏菌的培養(yǎng),3.1.5 樣品的采集 血培養(yǎng)：急性期、體溫反應(yīng)明顯和血清滴度高的病人，血培養(yǎng)陽性率高 血培養(yǎng)陽性率與病期、體溫反應(yīng)、臨床表現(xiàn)以及血清滴度等有關(guān)系 骨髓培養(yǎng)：慢性期病人骨髓培養(yǎng)的陽性率比血液高 從胸腔積液、膿腫和關(guān)節(jié)液、痰、乳、陰道分泌物 流產(chǎn)胎盤中分離到布氏菌 新鮮乳汁,布氏菌特異的油滴樣菌落,布氏瓊脂布魯氏菌菌落,血平皿 布氏菌菌落,布氏菌革蘭染色,3.1.6布氏菌鑒定程序,分離培養(yǎng) 純分離傳代 玻片凝集初步鑒定，陽性血清、因子血清凝集 H2S產(chǎn)生試驗(yàn)，CO2培養(yǎng)依賴試驗(yàn) 噬菌體裂解試驗(yàn) 染料抑菌試驗(yàn) PCR檢測 其他方法檢測 生化測定 脂肪酸分析 PFGE等,布氏菌噬菌體,我國1981年起從國外引進(jìn)布氏菌分型噬菌體，對鑒定布氏菌有良好使用價(jià)值，可以將布氏菌鑒定到種目前使用的噬菌體有Tb Fi BK 2 Wb R R/O R/C,噬菌體對布氏菌的裂解,羊種布氏菌噬菌體裂解,分離培養(yǎng)基,商用培養(yǎng)基布氏瓊脂 布氏肉湯 制備培養(yǎng)基肝浸液瓊脂 血瓊脂培養(yǎng)基 胰蛋白眎瓊脂培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基添加劑（多種抗生素）商品添加劑多粘菌素B 桿菌肽 放線菌酮 制霉菌素注意：PH 7.2 ，瓊脂適量，適當(dāng)容器,布氏菌培養(yǎng)鑒定,新方法的應(yīng)用 細(xì)菌生化 鑒定系統(tǒng) PCR鑒定 OMP31AMOS-PCR,雙向血培養(yǎng)瓶,3.2.1 血清學(xué)診斷的意義 3.2.2 針對布病進(jìn)行的檢驗(yàn) 3.2.3 血清樣本的采集和保存,3.2.1 血清學(xué)診斷的意義,人的布病診斷方法：綜合性診斷 （1）流行病學(xué)接觸史：密切接觸家畜、野生動(dòng)物（觀賞動(dòng)物）、畜產(chǎn)品、布氏菌培養(yǎng)物等或生活在疫區(qū)內(nèi)的居民 （2）臨床癥狀和體征 （3）實(shí)驗(yàn)室檢查：病原菌分離、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、抗人球蛋白試驗(yàn) 具備（1）、（2）和（3）項(xiàng)中的任何一項(xiàng)檢查陽性即可確定為布病病人,3.2.2 針對布病進(jìn)行的檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)室檢查陽性判定標(biāo)準(zhǔn) （1）病原菌分離：檢出布魯氏菌 （2）試管凝集試驗(yàn)：1：100（++）及以上 （3）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：1：10（++）及以上 （4）抗人球蛋白試驗(yàn)：1：400（++）及以上 （5）虎紅、平板凝集試驗(yàn)：出現(xiàn)可見凝集 （6）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)：皮試后24、48小時(shí)分別各觀察一次,皮膚紅腫范圍有一次在2.０×2.０厘米及以上（或４.０平方厘米及以上）,虎紅、平板凝集試驗(yàn)和皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)供初篩試驗(yàn)用 對已確診的慢性病人和接種過菌苗的人，應(yīng)以臨床癥狀為主要依據(jù)，血清學(xué)試驗(yàn)效價(jià)高低，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)弱供參考,布氏菌的血清學(xué)診斷方法,試管凝集試驗(yàn) (SAT) 虎紅玻片凝集試驗(yàn) (RBPT) 含巰基化物處理血清后的凝集試驗(yàn)（2ME 試驗(yàn)） 抗球蛋白試驗(yàn) (Coomb`s試驗(yàn)) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) (CFT) 乳環(huán)凝集試驗(yàn) (MRT) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 金標(biāo)法 熒光偏振方法 （FPA）,3.2.2.1、虎紅玻片凝集實(shí)驗(yàn),原理：利用酸性帶色的抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性，主要檢查血清中的IgG類抗體。 評(píng)價(jià)：簡便快速、容易操作，適用于基層大面積檢疫，容易出現(xiàn)假陽性，結(jié)果僅供參考，不能作為確診依據(jù)。,布病虎紅玻片凝集試劑,試劑與器材,虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫脂玻片、微量移液器、槍頭。 方法：在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，5min之內(nèi)觀察結(jié)果。 結(jié)果判定：出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)就判為陽性；否則就為陰性。 評(píng)價(jià)：簡便快速、容易操作，漏檢率極低，適用于基層大面積檢疫；容易出現(xiàn)假陽性，臨床上需要借助SAT來確認(rèn)。,注意事項(xiàng),血清靜止的溫度和時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響，在一定的時(shí)間和溫度范圍內(nèi)，防治時(shí)間越長，溫度越高，假陽性率越低； 患者空腹血清出現(xiàn)假陽性少； 凡是試驗(yàn)中凝集顆粒不規(guī)則，大小不勻，片狀或絮狀，凝集不清澈者，一般為假陽性，否則凝集顆粒規(guī)則，大小均勻，凝集清澈者，一般與SAT結(jié)果相符，為陽性。,原理：布氏菌侵入機(jī)體后，就會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，這種抗體可與相應(yīng)的布氏菌抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，就會(huì)形成肉眼可見的凝集反應(yīng)，也就是用已知抗原查未知抗體。,3.2.2.2、 試管凝集試驗(yàn),3.2.2.2、 試管凝集試驗(yàn),試管凝集試驗(yàn) 陰性,布氏菌試管凝集 陽性,布氏菌試管凝集抗原,器材與試劑,實(shí)驗(yàn)?zāi)乖?、被檢血清、生理鹽水 移液器、吸管、凝集管、試管架、稀釋抗原用的玻璃杯、37度溫箱。 方法：每份血清取9支小試管，放于試管架上。 血清稀釋稀釋抗原后；加入抗原溫育18-22小時(shí)室溫放置2小時(shí)后觀察結(jié)果 比濁管配置,0.2ml血清,2.3ml鹽水,0.5ml抗原,05ml棄去,1:1600,結(jié)果判定：根據(jù)各管中上層液體的清亮度記錄凝集反應(yīng)程度（滴度），特別是50%清亮度（++）對判定結(jié)果關(guān)系較大，一定要與比濁管對比判定。 ++++ 液體完全透明，菌體成傘狀沉淀或塊狀顆粒狀沉淀，呈100%凝集。 +++ 液體近于完全透明，菌體成傘狀沉淀，呈75%凝集。 ++ 液體略微透明，菌體呈較薄傘狀沉淀，呈50%凝集。 + 液體不透明，管底有很不明顯的傘狀沉淀，呈25%凝集。 — 液體不透明，無傘狀沉淀。 效價(jià)以產(chǎn)生50%凝集的血清最高稀釋倍數(shù)為受檢血清的效價(jià)。 血清對照為清亮透明無沉淀，抗原對照為均勻渾濁，兩種對照管成立，才可判定試驗(yàn)管，否則重做。人的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1:100++為陽性，1:50++為可疑。,試管凝集實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)之一 滴度1︰100及以上或病程一年以上者滴度為1︰50及以上為陽性 特異好，實(shí)用性、敏感性強(qiáng) 主要檢查血清中的IgG和IgM，適合于急性期病人的診斷。 缺點(diǎn)：有前帶現(xiàn)象，有時(shí)出現(xiàn)假陰性結(jié)果；長生一定的交叉反應(yīng)；出結(jié)果慢，需要兩天,注意事項(xiàng),受檢血清應(yīng)新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能超過10℃，采血后應(yīng)于3-4日內(nèi)進(jìn)行檢查，因放置時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致血清效價(jià)降低。 每份血清和抗原要有對照。 個(gè)別血清會(huì)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，建議多做幾個(gè)管，多采用幾個(gè)稀釋度。,3.2.2.3、抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)（Coomb’s）,原理：機(jī)體受布氏菌抗原刺激后可產(chǎn)生“完全抗體”和“不完全抗體”。不完全抗體可與相應(yīng)抗原結(jié)合，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。若將預(yù)測不完全抗體的人血清球蛋白作為抗原，注射于另一種動(dòng)物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗IgG、IgA、IgM）的抗體，再將此球蛋白抗體加入到抗原與不完全抗體復(fù)合體中，即可出現(xiàn)可見反應(yīng)。分為兩個(gè)階段: ①不完全抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合為不可見階段 ②抗原抗體復(fù)合物有抗球蛋白抗體凝集而形成可見反應(yīng) 評(píng)價(jià)：所查抗體主要是IgG、IgA；可以作為早期和追溯診斷；適用于亞急性和慢性病人；操作復(fù)雜，耗時(shí)長，一般不作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。,器材及試劑,試劑：試管凝集抗原、被檢血清、抗被檢對象的血清球蛋白抗體、生理鹽水 器材：普通離心機(jī)、溫箱、1ml及10ml吸管。 方法：試管凝集試驗(yàn)階段抗球蛋白反應(yīng)階段 吸取上項(xiàng)試驗(yàn)的可疑管和全部陰性管，4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，反復(fù)洗滌3次。向各管中加入生理鹽水0.5ml，混勻，再向各管中加0.5ml一定稀釋度的抗球蛋白血清，將反應(yīng)管置37℃溫箱中20-22小時(shí)，取出室溫放置2小時(shí)后判定結(jié)果。 判定標(biāo)準(zhǔn)同試管凝集試驗(yàn),對照,被檢血清對照（被檢血清+鹽水） 試管凝集抗原對照（試管抗原+鹽水） 抗球蛋白血清加生理鹽水對照 抗球蛋白血清加試管凝集抗原對照 抗球蛋白血清加被檢血清對照 對照全部為陰性時(shí)，實(shí)驗(yàn)才有意義 我國試行的用于診斷人布病標(biāo)準(zhǔn)1:400及以上滴度。,注意事項(xiàng),在進(jìn)行Coomb’s試驗(yàn)時(shí)，洗滌抗原很重要，如不認(rèn)真洗滌，在抗原表面上吸附血清中的某些其他蛋白物質(zhì)，會(huì)干擾下一步加入抗球蛋白血清的反應(yīng)，掩蓋真正結(jié)果。 一般采用加入抗球蛋白血清1:20-1:50之間的稀釋度。,評(píng)價(jià),（1）布氏菌感染后，約在15天出現(xiàn)不完全抗體，3個(gè)月左右達(dá)到高峰?？沙掷m(xù)一年左右。該實(shí)驗(yàn)可作為早期和追溯診斷。 （2）該試驗(yàn)特異性較強(qiáng)，尤其適用于診斷亞急性和慢性病人，所查抗體主要為IgG、IgA類。 （3）一般不作為常規(guī)項(xiàng)目，在試管凝集試驗(yàn)為可疑，患者又處于慢性期時(shí)，可考慮抗球蛋白試驗(yàn)予以診斷。,3.2.2. 4、布氏菌補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),原理：綿羊紅細(xì)胞和溶血素可以形成結(jié)合物，在補(bǔ)體的作用下，發(fā)生溶血。在反應(yīng)體系中，他們作為指示系統(tǒng)，與布氏菌的特異性抗原、抗體復(fù)合物競爭結(jié)合補(bǔ)體。如果發(fā)生溶血，說明血清中沒有特異性抗體，判為陰性，即不是布病患者。,評(píng)價(jià)：主要檢查IgG類抗體，特異性強(qiáng)，適用于各型各期病人的診斷，準(zhǔn)確性高，敏感性差，對慢性病人有漏診現(xiàn)象，操作復(fù)雜，影響因素多，難以在基層推廣。,補(bǔ)體試驗(yàn)的5種成分,補(bǔ)體 溶血素 綿羊紅血球 布氏菌抗原 待檢血清（以及對照血清）,補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)注意事項(xiàng),血清滅活 恒溫水浴箱 結(jié)果的判讀 出現(xiàn)問題的分析,3.2.2.5、皮膚變態(tài)實(shí)驗(yàn),原理：IV型變態(tài)反應(yīng)，為細(xì)胞免疫。當(dāng)機(jī)體受布氏菌抗原刺激后，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞致敏，致敏的T淋巴細(xì)胞再遇到相同抗原后進(jìn)行分化、衍變、產(chǎn)生能釋放各種淋巴因子的效應(yīng)細(xì)胞。局部的變態(tài)反應(yīng)就是各種淋巴因子綜合作用的結(jié)果。 方法：前臂內(nèi)側(cè)前1/3處，酒精消毒，皮內(nèi)注射布氏菌素0.1毫升，24、48小時(shí)各觀察一次。 評(píng)價(jià)：呈陽性反應(yīng)的人只表示受過布氏菌感染；副作用大。,3.2.2.6、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA） 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA） 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)注意事項(xiàng),試驗(yàn)的穩(wěn)定性，重復(fù)性 試驗(yàn)對照的設(shè)置，強(qiáng)、弱陽性，陰性血清對照的ct值要在規(guī)定的范圍 稀釋倍數(shù),3.2.3 血清樣本的采集和保存,采血盡量使用負(fù)壓采血管，便于無菌操作編號(hào)，造表，妥善攜帶回實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)時(shí)的無菌操作 妥善保存有意義的樣本編號(hào)，凍存，背景資料,謝謝大家！,