糧食中玉米赤霉烯酮膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)方法編制說(shuō)明
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1、 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 編制說(shuō)明 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 標(biāo)準(zhǔn)起草組 2011年11月 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 編制說(shuō)明 1.任務(wù)來(lái)源及工作過(guò)程 國(guó)務(wù)院糧食管理流通條例和糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)都明確規(guī)定糧食收購(gòu)要對(duì)真菌毒素玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢驗(yàn)控制,而我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)體系中缺少嘔吐毒素快速檢測(cè)的方法及標(biāo)準(zhǔn)因此,該項(xiàng)研究迫在眉睫。 我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),農(nóng)產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛,糧食收購(gòu)多集中在縣以下單位的糧食收儲(chǔ)庫(kù)點(diǎn)。時(shí)間短,收購(gòu)量大,存在很多隱患
2、。主要集中在以下方面:一方面糧食入庫(kù)時(shí)間短,不宜長(zhǎng)時(shí)間露天存放,因此對(duì)玉米赤霉烯酮的檢測(cè)需要快速定性。另一方面收購(gòu)企業(yè)技術(shù)力量和硬件設(shè)備不足,利用大型儀器檢測(cè)收購(gòu)糧真菌毒素?zé)o法普及。因此目前在糧食收購(gòu)環(huán)節(jié)最需要解的問(wèn)題就是建立高效、快速、低成本的定性檢測(cè)方法。 傳統(tǒng)上,真菌毒素的分析一般采用薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。TLC雖然簡(jiǎn)便,但靈敏度差;HPLC雖然靈敏度高,但樣品處理煩瑣,操作復(fù)雜,儀器昂貴。這兩種方法都不適合在收購(gòu)原糧時(shí)進(jìn)行快速定性檢測(cè)。因此需要玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)方法的研究,從源頭解決儲(chǔ)備糧真菌毒素污染問(wèn)題。 為了確保公民的飲食安全,進(jìn)一步保證產(chǎn)品質(zhì)量、
3、規(guī)范生產(chǎn)、為市場(chǎng)監(jiān)督提供依據(jù),需要制定《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》標(biāo)準(zhǔn),按照GB2760-2007的要求,對(duì)小麥粉及其制品中玉米赤霉烯酮的含量進(jìn)行監(jiān)督。 本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定是根據(jù)國(guó)家糧食局標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量中心下達(dá)的 年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂任務(wù),由北京市糧油食品檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)起草。項(xiàng)目編號(hào): 2. 編制過(guò)程 2.1 第一階段工作 第一階段為收集國(guó)內(nèi)外玉米赤霉烯酮測(cè)試分析標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)資料,了解掌握玉米赤霉烯酮測(cè)定方法的最新技術(shù)發(fā)展情況階段。本階段查閱了大量的文獻(xiàn)資料,參考國(guó)內(nèi)外玉米赤霉烯酮測(cè)定方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)編制小組成員經(jīng)過(guò)研究和討論一致認(rèn)為,膠體金快速
4、檢測(cè)方法具有較好的可操作性和實(shí)用性,因此我們參考這些先進(jìn)方法和產(chǎn)品,并根據(jù)國(guó)內(nèi)糧食行業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)和檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用情況,著手制定《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》的基本思路和主要工作方向。 2.2 第二階段工作 第二階段為組織起草并召開(kāi)標(biāo)準(zhǔn)起草組工作會(huì)議。本標(biāo)準(zhǔn)起草組在經(jīng)過(guò)收集、整理資料和調(diào)研工作的基礎(chǔ)上,提出標(biāo)準(zhǔn)提綱,確定了標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容和要求。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組成員單位進(jìn)行討論、論證,形成標(biāo)準(zhǔn)初步文本;標(biāo)準(zhǔn)起草組成員單位間通過(guò)多種形式不斷交流、補(bǔ)充、完善標(biāo)準(zhǔn)文本,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和比對(duì)試驗(yàn),最終形成該標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。 本階段重點(diǎn)組織了玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)。先后開(kāi)展了兩
5、輪比對(duì)試驗(yàn),針對(duì)各家分析實(shí)際操作時(shí)標(biāo)準(zhǔn)文本中存在的問(wèn)題及建議,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修改,得到標(biāo)準(zhǔn)起草小組的一致認(rèn)可,形成該標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。 3 編制原則 3.1 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009、GB/T 20000.2-2009 和GB/T 20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4 部分 化學(xué)分析方法》的規(guī)定和要求編寫,在標(biāo)準(zhǔn)框架、結(jié)構(gòu)和內(nèi)容等方面符合這些標(biāo)準(zhǔn)的要求。 3.2 強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了糧食中玉米赤霉烯酮的安全限量,且本標(biāo)準(zhǔn)所確定的檢測(cè)方法能滿足該標(biāo)準(zhǔn)的初步篩選測(cè)定。 4.國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù) 4.1 本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快
6、速測(cè)試卡檢測(cè)方法》標(biāo)準(zhǔn)為推薦性標(biāo)準(zhǔn),其主要內(nèi)容包括: (1) 封面 (2) 前言 (3) 標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容:范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器設(shè)備、樣品制備、樣品測(cè)定與結(jié)果判定。 4.2 主要試驗(yàn)(或驗(yàn)證)的分析 4.2.1標(biāo)準(zhǔn)方法原理 玉米赤霉烯酮毒素膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)技術(shù)原理是基于抗原抗體反應(yīng)、免疫金標(biāo)記技術(shù)及毛細(xì)管層析技術(shù)。以微孔膜為固相載體,將可特異性識(shí)別玉米赤霉烯酮的抗體標(biāo)記紅色或紫紅色的膠體金顆粒,檢測(cè)卡的膜上兩個(gè)色帶分別固定玉米赤霉烯酮抗原,以及抗鼠源性抗體的二抗,根據(jù)色帶的顏色變化進(jìn)行結(jié)果評(píng)估。質(zhì)控色帶(control line)不會(huì)被樣品中的玉米赤霉烯酮影響,而
7、在每次反應(yīng)后都應(yīng)出現(xiàn),用于證明檢測(cè)條是否正常。檢測(cè)色帶(test line)在樣品中沒(méi)有玉米赤霉烯酮或樣品中玉米赤霉烯酮的含量低于檢測(cè)限時(shí)會(huì)顯現(xiàn);在樣品中玉米赤霉烯酮含量等于或高于檢測(cè)限時(shí)不出現(xiàn)。 4.2.2驗(yàn)證方案 4.2.2.1驗(yàn)證對(duì)象及驗(yàn)證單位 參考糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn),確定本次驗(yàn)證糧種為小麥和玉米,考慮到加標(biāo)樣品的毒素分布、均勻性等影響,本次驗(yàn)證全部采用天然陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證;驗(yàn)證毒素為玉米赤霉烯酮(DON);驗(yàn)證用膠體金快速測(cè)試卡采用國(guó)內(nèi)二家公司提供的DON三批次。驗(yàn)證單位為(北京)國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心、(湖北)國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心、(遼寧)國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心、(重慶)國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)
8、中心、(四川)國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心和(廣西)國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心。 4.2.2.2陽(yáng)性樣品的制備 北京中心將收集到的陽(yáng)性樣品粉碎,至少80%以上通過(guò)20目篩,篩上和篩下物混勻,采用免疫親和柱高效液相色譜法對(duì)制備的陽(yáng)性樣品進(jìn)行混合均勻度測(cè)定,混合均勻性達(dá)到要求后將陽(yáng)性樣品分發(fā)給六家國(guó)家檢測(cè)中心。 4.2.2.3 陽(yáng)性樣品定值 六家國(guó)家檢測(cè)中心收到陽(yáng)性樣品后,采用免疫親和柱高效液相色譜法進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果報(bào)送北京中心進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,取平均值作為理論值。 4.2.2.4 測(cè)試卡驗(yàn)證 六家國(guó)家中心將分發(fā)并定值后的高濃度陽(yáng)性樣品與空白樣品按照各測(cè)試卡樣品量要求分別稱取,配置所需濃度,然后按照
9、測(cè)試卡說(shuō)明書指定的方法進(jìn)行測(cè)定。 4.2.3結(jié)果與分析 采用兩種DON測(cè)試卡(測(cè)試卡A和測(cè)試卡B),各三個(gè)批次,按照各自規(guī)定的操作步驟和評(píng)定方法對(duì)玉米中DON進(jìn)行了測(cè)定。 4.2.3.1 準(zhǔn)確性 4.2.3.1.1測(cè)試卡A 根據(jù)結(jié)果,共進(jìn)行21個(gè)濃度150次有效測(cè)試,共出現(xiàn)誤判21次,判定準(zhǔn)確率為86%,假陽(yáng)誤判出現(xiàn)3次,假陰誤判出現(xiàn)18次。 具體結(jié)果見(jiàn)下表1: 表1玉米赤霉烯酮測(cè)試卡A誤判情況表 品種 測(cè)試次數(shù) 誤判 次數(shù) 誤判率 % 假陰誤判次數(shù) 假陰誤判率% 假陽(yáng)誤判次數(shù) 假陽(yáng)誤判率% 玉米 150 21 14.0 18 12.0 3 2
10、.0 4.2.3.1.2測(cè)試卡B 根據(jù)結(jié)果,共進(jìn)行21個(gè)濃度142次有效測(cè)試,共出現(xiàn)誤判24次,判定準(zhǔn)確率為83.1%,假陽(yáng)誤判出現(xiàn)9次,假陰誤判出現(xiàn)15次。 具體結(jié)果見(jiàn)下表2: 表2玉米赤霉烯酮測(cè)試卡B誤判情況表 品種 測(cè)試次數(shù) 誤判 次數(shù) 誤判率 % 假陰誤判次數(shù) 假陰誤判率% 假陽(yáng)誤判次數(shù) 假陽(yáng)誤判率% 玉米 142 24 16.9 15 10.6 9 6.3 4.2.3.2重復(fù)性 測(cè)試卡A:按照驗(yàn)證方案,共進(jìn)行240次測(cè)試,其中有效結(jié)果為240次,共出現(xiàn)誤判29次,判定準(zhǔn)確率為87.9%,其中假陰性誤判次數(shù)為11次,出現(xiàn)比例為4.6%。
11、 測(cè)試卡B:按照驗(yàn)證方案,共進(jìn)行243次測(cè)試,其中有效結(jié)果為243次,共出現(xiàn)誤判29次,判定準(zhǔn)確率為88.1%,其中假陰性誤判次數(shù)為20次,出現(xiàn)比例為8.2%。 4.2.3.3穩(wěn)定性 4.2.3.3.1 測(cè)試卡A 根據(jù)有效結(jié)果,按照含量為限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)判定為陽(yáng)性的規(guī)則,各不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果如下表3: 表3測(cè)試卡A不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果 批次 測(cè)試次數(shù) 誤判 判定準(zhǔn)確率% 20101110 16 1 93.8 20101116 25 2 92.0 20101126 24 3 87.5 20101106 15 2 86.7 批間相對(duì)偏差% 3.8
12、 4.2.3.3.2測(cè)試卡B 根據(jù)有效結(jié)果,按照含量為限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)判定為陽(yáng)性的規(guī)則,各不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果如下表4: 表4測(cè)試卡B不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果 批次 測(cè)試次數(shù) 誤判 判定準(zhǔn)確率% G101009301 33 0 100 G101125304 39 0 100 G101125305 29 5 82.8 批間相對(duì)偏差% 10.5 4.2.3.4 約定誤差范圍試驗(yàn) 測(cè)試卡A:在40-80ppb濃度范圍內(nèi),對(duì)玉米樣本共進(jìn)行12個(gè)濃度的測(cè)定,共獲得有效結(jié)果102次,假陰出現(xiàn)16次,基本平均分布在60-80ppb濃度之間,且110與120ppb濃度下
13、也各出現(xiàn)1次誤判;假陽(yáng)出現(xiàn)3次,分別在在55ppb濃度2次、58ppb濃度1次,總體樣本假陽(yáng)誤判率為2.9%。 測(cè)試卡B:在40-80ppb濃度范圍內(nèi),對(duì)玉米樣本共進(jìn)行12個(gè)濃度的測(cè)定,共獲得有效結(jié)果92次,假陰出現(xiàn)14次,基本平均分布在60-80ppb濃度之間,另外,在120ppb濃度下出現(xiàn)1次誤判;假陽(yáng)出現(xiàn)9次,分別在在40ppb-58ppb濃度之間,總體樣本假陽(yáng)誤判率為9.8%。 4.2.4結(jié)論 4.2.4.1現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的ZEN測(cè)定方法精密度(見(jiàn)表5)。 表5玉米赤霉烯酮檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)號(hào) GB/T5009.209-2008 GB/T 23504-2009
14、 SN/T 1772-2006 標(biāo)準(zhǔn)名稱 食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定 進(jìn)出口糧谷中玉米赤霉烯酮的測(cè)定 采用方法 免疫親和層析HPLC 薄層色譜 ELISA HPLC 重復(fù)性% 15 10 10 15 / 再現(xiàn)性% / / / / / 檢出限/量 5ug/kg 20ug/kg 20ng 0.25ng 5ug/kg 回收率% / 70-100 / / 73.7-98.2 4.2.4.2測(cè)試卡性能(見(jiàn)表6): 表6測(cè)試卡B不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確率 批次 測(cè)試卡A % 測(cè)試卡B % 備注 準(zhǔn)確性 86 8
15、3.1 玉米 重復(fù)性 87.9 88.1 玉米 穩(wěn)定性 90 95.0 玉米 約定誤差范圍(50 mg/kg~70 mg/kg) 81.2 73.3 玉米 4.2.4.3 嘔吐毒素測(cè)試卡指標(biāo)設(shè)定 準(zhǔn)確性判定誤判率:結(jié)合4.2.4.1中目前國(guó)內(nèi)方法的各項(xiàng)指標(biāo)可設(shè)定為小于15% 重復(fù)性判定誤判率:結(jié)合4.2.4.1中目前國(guó)內(nèi)方法的各項(xiàng)指標(biāo)可設(shè)定為小于15% 穩(wěn)定性判定誤判率:結(jié)合4.2.4.1中目前國(guó)內(nèi)方法的各項(xiàng)指標(biāo)可設(shè)定為小于15% 約定誤差范圍(50 mg/kg~70 mg/kg)內(nèi)判斷誤判率: 該方法中,兩種測(cè)試卡的約定誤差范圍誤判率提取機(jī)制上進(jìn)一步改進(jìn)
16、,應(yīng)當(dāng)能解決誤判率告的問(wèn)題,因此將該濃度范圍內(nèi)的誤判率定為小于15% 5.國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建議 建議將此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)列為推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。 6.貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議(包括組織措施、技術(shù)措施、過(guò)度辦法等內(nèi)容) 建議職能管理機(jī)構(gòu),指定生產(chǎn)部門,生產(chǎn)貫徹本標(biāo)準(zhǔn)以達(dá)到保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益的目的。 7.新舊國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的總體對(duì)比 8.技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證及預(yù)期的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效果 國(guó)際上少數(shù)國(guó)家針對(duì)糧食玉米赤霉烯酮含量的檢測(cè)制定了試行方法,但方法均不統(tǒng)一。我國(guó)目前還未制定相關(guān)的快速篩選方法標(biāo)準(zhǔn)。隨著食品安全、糧食安全戰(zhàn)略意義的不斷擴(kuò)大,以及我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,加入世界貿(mào)易組織,與
17、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌,必須制定相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行安全控制?,F(xiàn)狀:我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),農(nóng)產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛,糧食收購(gòu)多集中在縣以下單位的糧食收儲(chǔ)庫(kù)點(diǎn)。時(shí)間短,收購(gòu)量大,存在很多隱患。主要集中在以下方面:一方面糧食入庫(kù)時(shí)間短,不宜長(zhǎng)時(shí)間露天存放,因此對(duì)玉米赤霉烯酮的檢測(cè)需要快速定性。另一方面收購(gòu)企業(yè)技術(shù)力量和硬件設(shè)備不足,利用大型儀器檢測(cè)收購(gòu)糧真菌毒素?zé)o法普及。因此目前在糧食收購(gòu)環(huán)節(jié)最需要解的問(wèn)題就是建立高效、快速、低成本的定性檢測(cè)方法。 該標(biāo)準(zhǔn)的制定有利于促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級(jí)和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的調(diào)整、推動(dòng)技術(shù)進(jìn)步和技術(shù)創(chuàng)新、推進(jìn)與國(guó)際慣例接軌;有利于糧食質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的建立;有利于公共食品安全。 9.參考的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)
18、 無(wú) 10.與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 11.關(guān)于強(qiáng)制性條款 12.貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議 1)首先應(yīng)在實(shí)施前保證文本的充足供應(yīng),讓每個(gè)使用者都能及時(shí)得到文本。這是保證新標(biāo)準(zhǔn)貫徹實(shí)施的基礎(chǔ)。 2)發(fā)布后、實(shí)施前應(yīng)將信息在媒體上廣為宣傳。 3)本次修訂,不僅與生產(chǎn)廠家有關(guān),而且與消費(fèi)者有關(guān)。對(duì)于使用過(guò)程中容易出現(xiàn)的疑問(wèn),要在媒體上撰文事先予以解釋。 4)要分別標(biāo)準(zhǔn)的不同使用對(duì)象,消費(fèi)者、生產(chǎn)廠家、質(zhì)量監(jiān)管部門等,有側(cè)重點(diǎn)地進(jìn)行培訓(xùn)、宣傳。 5)實(shí)施的過(guò)渡期宜定為6個(gè)月。 6)建議質(zhì)量監(jiān)督部門加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。 13.廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議 無(wú)
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