阿帕替尼通過下調(diào)VEGFR2-PLC-ERK12通路表達抑制胃癌細胞株MGC-803增殖 臨床醫(yī)學專業(yè)

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1、前 言 近年來胃癌發(fā)病率和死亡率明顯下降，但胃癌仍然是一個重要的公眾健康問題。胃癌在中國的發(fā)病率居第2，死亡率居第3，是中國四大特色腫瘤之一。其中，晚期胃癌占60-80%，而現(xiàn)有治療手段獲益有限，5年生存率僅20%。有些無法切除、復發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃癌患者無法達到根治。最佳支持治療（BSC）預后僅有幾個月。對于轉(zhuǎn)移性胃癌，現(xiàn)有資料顯示，聯(lián)合化療雖然能夠提高疾病的緩解率，提高患者生存率，但毒性較高。近些年來，多種靶向藥物正在進行臨床研究，如抗表皮細胞生長因子受體1（EGFR）和2（HER-2）單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制藥和血管生成抑制藥。這些靶向治療是未來癌癥治療的趨勢，也符合國家“精準醫(yī)療”的理

2、念。 抑制腫瘤血管生成，是當今抗腫瘤治療的熱點。當腫瘤半徑<2mm時，它主要依靠擴散在細胞周圍的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣生存。隨著瘤體的增大，腫瘤本身或宿主組織將建立起新生血管網(wǎng)已供給瘤體營養(yǎng)。 阿帕替尼就是一種抑制腫瘤血管生成的新型靶向藥物。它能高度選擇性競爭細胞內(nèi)VEGFR-2的ATP結合位點，阻斷下游信號轉(zhuǎn)導，抑制腫瘤組織新生血管生成。體外實驗結果顯示，阿帕替尼對胃癌細胞也具有一定殺傷力。目前已公布的阿帕替尼Ⅱ期臨床試驗數(shù)據(jù)，阿帕替尼組的結果具有較高統(tǒng)計學意義（P<0.001 OS&PFS）其中阿帕替尼850mg qd組較安慰劑組中位生存期延長2.3個月，中位PFS延長2.3個月。近期公布的阿

3、帕替尼Ⅲ期臨床試驗結果顯示，阿帕替尼組總生存期（OS）比安慰劑組延長1.8個月（median OS 6.5 vs.4.7 months, HR 0.71, P=0.01），中位PFS也被顯著延長（2.6 vs.1.8 months, HR 0.44, P<0.001）。阿帕替尼的臨床試驗結果令人鼓舞。 紫杉醇是一種抗微管藥物，能特異性的結合到腫瘤細胞的微管β位上，使微管聚合成團塊或束狀，使其穩(wěn)定性增加，從而抑制腫瘤細胞內(nèi)微管網(wǎng)的正常重組，導致腫瘤細胞死亡。在各項研究中，紫杉醇單藥治療晚期胃癌的有效率17%～23%。早期Ⅱ期臨床試驗表明紫杉醇和其他藥物無交叉耐藥，也沒有毒性相加或重疊。在RAI

4、NBOW研究中，紫杉醇與另一種抗VEGFR2藥物雷莫蘆單抗聯(lián)用，被證實要由于單用紫杉醇組，無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）明顯延長，因此，抗VEGFR2靶向藥物與紫杉醇聯(lián)用，成為胃癌治療領域一個重要的研究方向。 目前阿帕替尼主要適用于接受過2種系統(tǒng)化療后進展或復發(fā)的晚期胃癌患者，屬于胃癌治療的三線藥物，對晚期胃癌患者生存期的延長有著良好的效果。然而，目前尚未有臨床研究涉及阿帕替尼在早期及中期胃癌方面的治療，如果在胃癌的早期使用阿帕替尼，是否能通過對腫瘤血管生成的抑制有效遏制胃癌的進展；阿帕替尼與紫杉醇聯(lián)用是否對胃癌細胞有更好的殺滅作用，這些都尚不得而知。 本課題旨在從細胞、蛋白水平

5、研究阿帕替尼單藥與胃癌化療藥物紫杉醇聯(lián)用后的相互作用及其可能機制，為臨床治療提供一定的啟示。 一、材料與方法 （一）實驗材料 1.實驗室 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室 2.細胞株 人低分化胃腺癌細胞株MGC-803（購于中國科學院上海細胞庫） 3.實驗藥品及試劑 阿帕替尼（Apatinib）：江蘇恒瑞公司 PRMI-1640培養(yǎng)基：美國GIBCO公司 胎牛血清（FBS）：美國GIBCO公司 PBS：美國Thermo公司 二甲基亞砜（DMSO）：美國Thermo公司 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）：美國Sigma公司 胰蛋白酶-EDTA消化液：So

6、larbio公司 CCK-8試劑盒：康為世紀 Annexin VFITC/IP 凋亡檢查試劑盒：康為世紀 周期檢測試劑盒：康為世紀 抗β-actin單克隆抗體：美國Proteintech公司 抗PKC, p-PKC(α/βⅡThr683/641)：美國CST公司 p44/42 MAPK (ERK1/2) ：美國CST公司 p-p44/42 MAPK (p-ERK1/2) (Thr202/Tyr204) ：美國CST公司 紅色上樣緩沖液：美國CST公司 紫杉醇（Paclitaxel）：美國Sigma公司 4.主要儀器設備 Forma ClassⅡA2生物安全柜（Therm

7、o，美國）；Forma 3111 細胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；Varioskan Flash多功能酶標儀（Thermo，美國）；SORVALL ST 16R離心機（Thermo，美國）；-80℃超低溫冰箱（Thermo，美國）；4℃冰箱（海爾，中國），F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細胞儀（BD，美國）；Power-pac基礎電泳儀Bio-Rad，美國）；ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）；10-100ul、100-1000ul可調(diào)移液器 （Eppendorf, 德國）； 20-200ul八道可調(diào)移液器（High Tech Lab, 波蘭）。 （二）實驗方法

8、 （1）細胞培養(yǎng)： 人胃癌細胞株MGC803培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，5％CO2，37℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。細胞傳代使用0.1%胰酶溶液（含0.02% EDTA）消化，置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）環(huán)境下，1-2min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。細胞凍存時常規(guī)將細胞消化成單細胞懸液后離心，棄上清，使用適量含有20%胎牛血清及4%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，放入含有異丙醇的凍存盒，以按-1℃／min的速度降溫，降至-80℃后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。 （2）細胞生長曲線測定： 取生長狀

9、況良好的MGC-803細胞，胰酶消化后，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，制成單細胞懸液后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5*10^3、1*10^4、2*10^4、3*10^4、4*10^4、5*10^4，均勻接種于96孔板中，每孔加入200μl，每個濃度設5個復孔，共接種6塊96孔板，置于5％CO2，37℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)12/24/36/48/60/72小時后，小心吸取上清液，用CCK-8法計數(shù)活細胞。根據(jù)計數(shù)結果，繪制MGC-803細胞生長曲線。 （3）CCK-8法測定細胞毒實驗： A．試驗原理： CCK-8試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二

10、磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比?？墒褂妹笜藘x根據(jù)溶液吸光度變化比較細胞相對數(shù)目變化，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。 B．試驗分組： 空白對照組：不加細胞，只有培養(yǎng)液； 細胞對照組：只有細胞和培養(yǎng)液，不加藥物； 阿帕替尼單用組：只加阿帕替尼，設7個濃度水平，相鄰濃度之間2倍稀釋； 紫杉醇單用組：只加紫杉醇，設7個濃度水平，相鄰濃度之間2倍稀釋； 聯(lián)合用藥組：根據(jù)Cho

11、u-Talalay聯(lián)合指數(shù)法原則，分別設置阿帕替尼與紫杉醇各5個濃度水平：水平1：阿帕替尼濃度3+紫杉醇濃度3；水平2：阿帕替尼濃度4+紫杉醇濃度4；水平3：阿帕替尼濃度5+紫杉醇濃度5；水平4：阿帕替尼濃度6+紫杉醇濃度6；水平5：阿帕替尼濃度7+紫杉醇濃度7（如下表所示）。 表1：聯(lián)合用藥組說明：根據(jù)Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法原則，設5個濃度水平。 紫杉醇濃度 濃度1 濃度2 濃度3 濃度4 濃度5 濃度6 濃度7 阿帕替尼濃度 濃度1 濃度2 濃度3 濃度4

12、 濃度5 濃度6 濃度7 藥物配置：阿帕替尼干粉-20℃保存，用DMSO溶解成10mM儲存液，-80℃?zhèn)溆?，使用時用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。紫杉醇用DMF溶解成10mM儲存液，-80℃?zhèn)溆?。使用時用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。 C．試驗步驟： 取對數(shù)生長期的MGC-803細胞，用0.25%胰酶消化成單細胞懸液后計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為3*10^4進行鋪板，每孔180μl（約5000個細胞/孔），接種于96孔板，5％CO2，37℃環(huán)境中靜

13、置培養(yǎng)6h后備用。 100μM阿帕替尼倍比稀釋7個濃度，實驗組加入20μl不同濃度的阿帕替尼，空白組加入20μl 1640培養(yǎng)液，空白對照組不加細胞，只有等量培養(yǎng)液。置于5％CO2，37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h后，用吸引器吸去每孔液體，加入RPMI1640：CCK-8=10:1配置的溶液110μl。置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中孵育，2小時后用酶標儀在450nm波長處測定OD值。 中效濃度（Dm）的計算（即半數(shù)抑制濃度（IC50）） 根據(jù)A450計算細胞存活率（fu）： 細胞生存率（fu）=實驗組OD值-空白對照組OD值對照組OD值-空白對照組OD值 根據(jù)細胞存活率計算藥物抑制率（fa

14、）： 細胞抑制率（fa）=1-生存率（fu）=對照組OD值-實驗組OD值對照組OD值-空白對照組OD值 將中效方程式fafu=（DDM）m兩邊取對數(shù)得： log（fafu）=log（DDm）m=mlogD-mlogDm 設Y= log（fafu），X=logD，則可得直線方程： Y=mX + a (其中m為斜率，a為截距) 當Fa=0.5時，X=logDm= - am ,可計算出阿帕替尼及紫杉醇單用及聯(lián)合用藥時的Dm值。 聯(lián)合用藥效果判定： 由中效方程fafu=（DDM）m可得：D=Dm（fafu）1/m 當fa=0.1、0.2……0.8、0.9時，即可

15、計算出兩藥聯(lián)合所需濃度（D）；運用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法中的量效公式計算出量效聯(lián)合時的聯(lián)合用藥指數(shù)（CI）： CIx=D1Dx1+D2Dx2+αD1D2Dx1Dx2 結果判定： CI值 強度 結果 <0.1 ＋＋＋＋＋ 超強聯(lián)合 0.1-0.3 ＋＋＋＋ 強聯(lián)合 0.3-0.7 ＋＋＋ 聯(lián)合 0.7-0.85 ＋＋ 中等聯(lián)合 0.85-0.90 ＋ 弱聯(lián)合 0.90-1.10 相加 1.10-1.20 － 弱拮抗 1.20-1.45 －－ 中等拮抗 1.45-3.3 －－－ 拮抗 3,3-10 －－－－ 強

16、拮抗 >10 －－－－－ 超強拮抗 （4）碘化丙啶染色法（Propidium Iodide Staining）測定細胞周期： 實驗原理： 碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一種可以嵌合到雙鏈DNA和RNA的堿基對中并與之結合的熒光染料，無堿基特異性。碘化丙啶與雙鏈DNA結合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內(nèi)的DNA被PropidiumIodide染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進行細胞周期和細胞凋亡的分析。 實驗步驟： 取對數(shù)生長期的MGC-803細胞，用0.1%胰酶溶液消化成單細

17、胞懸液后計數(shù)，調(diào)整濃度為610^4/ml進行鋪板，每孔單細胞懸液2ml,接種于12孔板，置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，吸去培養(yǎng)液。80μM阿帕替尼倍比稀釋5個濃度，各實驗組加入2ml含不同濃度阿帕替尼的培養(yǎng)液，空白組加入2ml完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h，小心收集細胞培養(yǎng)液及貼壁細胞，冰浴預冷的95%乙醇固定細胞12小時后予碘化丙啶染色。流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況，數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理，得出細胞各周期比例。 （5）Annexin-V/PI雙染法測定細胞凋亡： 實驗原理： 在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細胞發(fā)生凋

18、亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。 實驗步驟： 取對數(shù)生長期的MGC-803細胞，用0.1%胰酶溶液消化成單細胞懸液后計數(shù)，調(diào)整濃度為610^4/ml進行鋪板，每孔單細胞懸液2ml,接種于12孔板，置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，吸去培養(yǎng)液。80μM阿帕替尼倍比稀釋5個濃度，各實驗組加入2ml含不同濃度阿帕替尼的培養(yǎng)液，空白組加入2ml完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h，小心收集細胞培養(yǎng)液及貼

19、壁細胞。1000r/min離心5min，沉淀細胞。冰浴預冷的PBS洗滌兩次，再次離心沉淀細胞。用去離子水按1：4稀釋Binding Buffer 250μl重懸細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1106/ml；取100 μl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5 μl Annexin V／FITC和10 μl 20μg／ml的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15min，然后在反應管中加入400μl PBS，流式細胞儀（FACS），分析數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理，得出細胞凋亡率。 （6）Western blot蛋白印記分析： 實驗原理： 蛋白印跡（Western blot）又被稱作免疫印跡，是一種被廣泛應用并得到公認的技

20、術，用于檢測組織或細胞提取物中蛋白表達水平。Western blot技術利用抗體與特定待檢測的蛋白結合，測定生物樣品中的蛋白表達水平?？贵w與其靶點蛋白表位的精確結合可用于檢測蛋白質(zhì)中具有高度特異性的氨基酸序列。抗體也可檢測蛋白質(zhì)的特異性翻譯后修飾（PTM）。 溶液配制： 1）10%過硫酸銨： 將1g過硫酸銨溶解于10ml去離子水中，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩? 2）SDS上樣緩沖液： Tris-HCL（1M PH6.8） 1ml 10%SDS 4ml DTT（1M） 1ml 臺盼藍

21、 0.02g 去離子水 終體積為100ml 3）SDS-PAGE甘氨酸電泳緩沖液 Tris堿 15g 甘氨酸 94g SDS 1g 去離子水 終體積為1000ml 3）TBS緩沖液 Tris-HCL（1M PH7.5） 100ml NaCL 9g 去離子水 終體積為1000ml 4）TBST液

22、 1000ml TBS緩沖液中加入1ml Tween-20至終濃度為0.1% 5）轉(zhuǎn)模緩沖液 Tris堿 3.03g 甘氨酸 14.41g 甲醛 100ml-200ml 去離子水 終體積為1000ml 注：根據(jù)蛋白分子量不同調(diào)整甲醛濃度（10%-20%之間） 6）封閉液 用TBST溶液將脫脂奶粉配制成5%封閉液。 7）分離膠和濃縮膠配制： 分離膠制備如下以（10ml體積為例）： 6% 8% 10% 12%

23、 去離子水 5.3ml 4.6ml 4.0ml 3.3ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 2.7ml 3.3ml 4.0ml 1.5M Tris（PH8.8） 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10%SDS 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 10%過硫酸銨 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml TEMED 0.08ml 0.006ml 0.04ml 0.04ml 濃縮膠制備如下： 總體積5ml 去離子水 2.77ml 30%丙烯酰胺 0，83 ml 0.5M Tris（PH8.8）

24、 1.26 ml 10%SDS 0.05ml 10%過硫酸銨 0.05ml TEMED 0.005ml 8）蛋白樣品制備： 1. 從培養(yǎng)瓶中去除培養(yǎng)液，用1X PBS輕柔洗滌細胞兩次，吸凈PBS。 2. 加入1X SDS樣本緩沖液（6孔板中每孔加入100ul，直徑10ml培養(yǎng)皿中加入500ul）裂解細胞。立即刮下細胞，用移液槍轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，置于冰上備用。 3. 超聲裂解10-25秒，完成細胞裂解和剪切DNA。 4. 95℃水浴中加熱5分鐘，在冰上冷卻。 5. 將冷卻后樣本離心5分鐘，-80℃保存?zhèn)溆谩? 9）BCA法測定蛋白濃度： 實驗原理： 在

25、堿性溶液環(huán)境中，二價銅離子（Cu2+）可與蛋白質(zhì)結構中的肽鏈結構形成絡合物，同時蛋白質(zhì)將二價銅離子（Cu2+）還原成一價亞銅離子（Cu+）。BCA試劑可題型地與一價亞銅離子（Cu+）結合，形成穩(wěn)定的有色復合物，可在562nm波長處檢查該復合物的最大吸收光，所測定的吸光度值（OD）與蛋白質(zhì)濃度成正比。根據(jù)蛋白質(zhì)標準曲線，可計算出被測蛋白質(zhì)的濃度。 實驗步驟： A． 根據(jù)試劑盒說明書，相鄰濃度2倍稀釋BSA標準品（2μg/μl），得到0 μg/μl、0.0625 μg/μl、0.125 μg/μl、0.25 μg/μl、0.5 μg/μl、1 μg/μl、2 μg/μl共7個標準樣品濃度；

26、 B． 計算BCA工作液總量： BCA工作液總量=（BCA標準品樣本個數(shù)+位置樣本個數(shù)）x復孔數(shù)x每個樣本BCA工作液體積 根據(jù)計算出的BCA工作液所需總量，將試劑A和試劑B按照50：1的體積比，配置BCA工作液，充分混勻。 C． 將稀釋好的A-G BSA標準品和待測蛋白質(zhì)樣品（原液或樣品）各25μl分別加到做好標記的96孔板中。每個測定樣本做3個平行反應復孔。 D． 加入200μl BCA工作液。平板搖床混勻30秒。 E． 37℃環(huán)境下孵育30分鐘后冷卻至室溫。 F． 用酶標儀在540-590nm范圍內(nèi)測定每個樣品及BSA標準品吸光度值，繪制標準曲線，計算各樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

27、 10）SDS-PAGE電泳 A．清洗玻璃板： 去污劑輕輕擦洗玻璃板兩面，去除表面污漬，清水沖洗干凈后，使用蒸餾水沖洗，然后晾干備用。可用無水乙醇擦拭晾干后，用玻璃紙隔離保存。梳子使用前用水洗凈，臨使用前用無水乙醇擦拭后晾干。 B．玻璃板檢漏： 玻璃板在水平桌面上對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上，往玻璃板間灌水，靜置15分鐘觀察液面是否下降，若出現(xiàn)漏液則需查明原因后重新放置玻璃板，并再次檢漏，若無漏液，則將玻璃板間液體輕輕倒去，殘余液體用濾紙吸干。 C．灌膠與上樣： 按目標蛋白分子量選擇合適的分離膠濃度配置，成分詳見上表，最后加入TEMED，配制分離膠時要充分混勻

28、，可用1000μl移液槍輕輕吹打，此外應保證試劑在使用期內(nèi)，特別是過硫酸銨。灌膠時動作輕柔，掌握好速度，避免小氣泡產(chǎn)生（濃度越小的分離膠含水越多，膠凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層異丙醇壓膠，壓膠后的膠凝的更平整、更快（灌膠時開始可稍快一些，膠面快到所需高度時可放慢速度。操作時膠需要沿玻璃板邊緣流下，可避免產(chǎn)生氣泡。加異丙醇液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。操作時帶好手套口罩等防護措施，因為未聚合的丙烯酰胺具有一定神經(jīng)毒性。 待分離膠凝固后，棄取表面壓膠的異丙醇，殘余異丙醇可用濾紙小心吸干，按上表成分配制濃縮膠，最后加入TEMED，之后輕輕搖勻，避免混入氣泡。將濃縮膠小心灌入，將玻璃

29、板間剩余空間灌滿后可將梳子水平插入濃縮膠中。灌濃縮膠時也要使膠沿玻璃板邊緣流下，避免灌膠過程中有氣泡產(chǎn)生。根據(jù)樣本數(shù)目選擇十孔或十五孔的梳子，插梳子時要保持水平。由于濃縮膠凝固時體積也會收縮減小，使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 取下梳子后后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，注意勿裝反，加入適量電泳也液后續(xù)檢漏，直至無明顯液體漏出后，繼續(xù)加入電泳緩沖液至刻度線后后開始準備上樣。在加樣前可使用10μl移液槍輕輕吹打一下加樣孔。一般在第一個孔加入marker，將要加入的樣品混合均勻，加樣前樣品可先離心，

30、尤其是長時間放置的樣品。用合適的移液器貼壁吸取樣品，注意將樣品吸出不要產(chǎn)生氣泡。將加樣器槍頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。上樣時，注意不要使樣品溢出而污染相臨的加樣孔。加樣完成后，將電泳液補充至刻度線。 D．電泳 上樣完畢后，蓋好電泳槽蓋子，注意電源正負極進行電泳。上層濃縮膠采用70V電壓，待條帶跑至分離膠時，將電壓調(diào)節(jié)至110V，直至溴酚藍染料前端至凝膠末端處為止，電泳時間約 2-3 小時。 E．轉(zhuǎn)膜 1. 電泳結束后取出凝膠，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中漂洗數(shù)秒后。按以下順序放置：陰極轉(zhuǎn)模板+海綿+濾紙+膠+PVDF膜+濾紙+海綿+陽極轉(zhuǎn)模板，放置過程中注意要將膠與PVDF膜浸沒在轉(zhuǎn)膜液中，放置P

31、VDF膜后剪角作標記。固定完成后插入轉(zhuǎn)膜槽中，確保正負極正確，用轉(zhuǎn)膜液浸沒。將整個轉(zhuǎn)膜槽放置入冰盒中，開始轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜選擇恒流，建議電流為 150-300mA,時間依據(jù)膠的濃度適當調(diào)整。 F．膜封閉： 1． 轉(zhuǎn)模完成之后，室溫下用1X TBS洗滌PVDF膜5分鐘。 2． 室溫條件下，置于封閉液中孵育膜1小時，搖床持續(xù)緩慢搖晃。 3． 剪膜后，室溫下用1X TBST洗滌5分鐘。 G． 抗體孵育： 1.一抗孵育： 按說明書稀釋方式吸取抗體后，立即加入一抗稀釋液中，可在室溫下用側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時或4℃下緩慢搖動孵育過夜。一抗孵育完成后，在搖床上用TBST洗滌5分鐘。

32、 2.二抗孵育： 二抗需根據(jù)一抗進行選擇，稀釋完成后，在室溫下側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。孵育完成后，在搖床上用TBST洗滌3遍，每次5分鐘。 H． 曝光 將A和B兩種顯影劑混合后備用，將膜置于ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)焦距與位置后，滴入適量混合后的顯影劑，開始曝光。根據(jù)不同蛋白調(diào)節(jié)曝光時間。 （8）免疫組化 免疫組化采用預制組織芯片，有完善的隨訪資料。 將石蠟切片于55℃-60℃烤箱中烘烤1-1.5h使石蠟熔化。然后取出切片迅速置于二甲苯染色缸中脫蠟3次，每次3分鐘。脫蠟完成后，將切片分別置于無水乙醇3次，每次2分鐘，置于95%乙醇3次，每

33、次2分鐘。然后置于70%酒精2分鐘，最后在蒸餾水中輕晃漂洗2分鐘。洗滌完成后，將切片置于10mM檸檬酸鹽緩沖液中95℃以上修復抗原修復完成后，冷卻至室溫，用雙蒸水洗滌10分鐘。 在37℃濕盒中使用與二抗來源相同的血清封閉1小時。去除封閉液滴加一抗后在4℃濕盒孵育過夜。然后使用PBST在搖床上漂洗5分鐘，再使用PBS在搖床漂洗4次，每次5分鐘。按照說明書推薦濃度滴加相應二抗，在37℃濕盒孵育20-30分鐘，然后使用PBS在搖床漂洗3次，每次5分鐘。3%H2O2封閉10分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物酶。再使用蒸餾水漂洗，最后PBS漂洗3次，每次3分鐘。 滴加SABC后在37℃中濕盒孵育20分鐘，PBST

34、搖床漂洗4次，每次5分鐘，PBS洗滌2次，每次5分鐘。DAB染色：將現(xiàn)配DAB染液滴加至組織處，置于鏡下觀察染色，直至陽性染色出現(xiàn)后使用蒸餾水沖洗1次，然后后PBS漂洗2分鐘。 蘇木素復染：滴加蘇木素至玻片上，染色后使用蒸餾水緩慢沖洗，直至洗完全洗凈蘇木素。蘇木素染色在堿性條件下呈現(xiàn)藍色，在酸性條件下呈現(xiàn)棕色，分別使用鹽酸及氨水調(diào)整返蘭時間使蘇木素染色為淡藍色。 最后按照與脫蠟復水相反的順序進行脫水，脫水后使用中性樹膠封片。 （7）統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以(xs)表示，多組之間比較采用單因素方差分析。P<0.05有統(tǒng)計學意義。 二、結 果 1

35、.MGC-803的細胞生長曲線 細胞生長曲線實驗設置5*10^3/ml、1*10^4/ml、2*10^4/ml、3*10^4/ml、4*10^4/ml、5*10^4/ml六個細胞濃度，每隔12小時觀察細胞生長情況（共計72小時）。實驗結果顯示，OD值（吸光度值）隨著細胞濃度和培養(yǎng)時間的增加而增加。大約48小時后，細胞進入平臺期，所以根據(jù)細胞生長曲線情況，選定3*10^4/ml為實驗組的細胞濃度。 2.阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇對MGC-803細胞的時效及量效關系： 阿帕替尼單用對MGC-803細胞生長的影響： 紫杉醇單用對MGC-803細胞生長的影響：

36、 阿帕替尼與紫杉醇聯(lián)用對MGC-803細胞生長的影響： Chou-Talalay聯(lián)合用藥曲線 三、分析與討論 近年來胃癌發(fā)病率和死亡率逐年下降，但胃癌仍然是一個重要的公眾健康問題。據(jù)統(tǒng)計，2012年全球胃癌新發(fā)病例約95萬（951000例），占所有癌癥比例為6.8%。胃癌在中國的發(fā)病率居第二，死亡率居第三，是中國四大高發(fā)腫瘤之一[1,2]。目前早期胃癌可通過內(nèi)鏡或手術治療，5年生存率接近90%。但我國的胃癌檢測尚未普及，很多胃癌病例是被機會性發(fā)現(xiàn)，早期胃癌僅占10%。對于進展期胃癌，根治性手術治療后5年生存率為50%左右。對于無法手術切除、復發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃癌患者，最佳

37、支持治療（BSC）預后僅有幾個月[8]。目前在胃癌外科治療領域已達成共識，即單純的手術無法完成生物學意義上的腫瘤根治，即使接受更廣泛的臟器切除和淋巴結清掃，亦然獲益有限。因此，胃癌的治療需要以外科手術為主，輔以其他多種手段（化療、放療、靶向藥物治療、生物治療等）的綜合治療。現(xiàn)有資料顯示，聯(lián)合化療雖然能夠提高疾病的緩解率和患者生存率，但毒性較高，且獲益有限[9,10]。 近些年來，多種靶向藥物進入市場，如抗表皮細胞生長因子受體1（EGFR）和2（HER-2）單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制藥和血管生成抑制劑，取得了不錯的臨床效果。相比于傳統(tǒng)細胞毒類抗腫瘤藥物，分子靶向藥物具有高選擇性、高效、低毒副作

38、用等特點[3-5]。與其他類型的惡性腫瘤相比，胃癌靶向治療的發(fā)展相對滯后，但仍取得較大進展，雷莫蘆單抗已通過FDA認證用于胃癌治療，并被NCCN指南推薦[11,12]；阿帕替尼被證明是對二線化療失敗的終末期胃癌患者唯一有效的藥物，與最佳支持治療組相比，明顯延長患者的OS和PFS[6,7]。 在以往的研究中，阿帕替尼被認為是一種抗血管生成藥物，在抑制腫瘤血管生成方面取得了許多令人鼓舞的成果[13,14]。但其是否對腫瘤細胞有直接作用，相關研究尚不多，Sui Peng等8證實阿帕替尼可通過抑制膽管癌（EBDC）細胞的VEGFR2受體，從而抑制腫瘤細胞自分泌VEGF的作用，抑制腫瘤的生長[

39、15,16]。Lin C等發(fā)現(xiàn)在小細胞肺癌的治療中，阿帕替尼不僅通過細胞毒性發(fā)揮其抗癌作用，且還通過抑制RET / Src信號通路抑制遷移和侵襲[17]。Mi YJ等發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可通過抑制轉(zhuǎn)運功能來逆轉(zhuǎn)ABCB1和ABCG2介導的腫瘤細胞耐藥[18]。 本資料中，相比于對照組，阿帕替尼對胃癌細胞株MGC-803的增殖具有明顯抑制作用，IC50值為（27.92.21）μM，抑制作用呈濃度依賴性，當濃度為50μM時，其抑制率可達87%。凋亡受阻和細胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生中的重要因素，因此為初步探討其可能存在的機制，作者對試驗組細胞進行凋亡和周期的檢測。誘導細胞凋亡是抗腫瘤治療中的重要環(huán)節(jié)，但本研究

40、中，不同濃度阿帕替尼作用后的MGC-803細胞與對照組相比凋亡率無明顯區(qū)別。因此作者認為阿帕替尼并非通過誘導凋亡來抑制MGC-803細胞的生長。同時采用流式細胞儀檢測用阿帕替尼處理24h后MGC-803細胞周期分布，結果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后的細胞被明顯阻滯于G1期，G2期比例減少，S期細胞無明顯變化，且差異有統(tǒng)計學意義。 腫瘤細胞的細胞周期紊亂，細胞生長失控，導致細胞無限制增長?；熕幬锟蓪⒛[瘤細胞的周期阻滯于G0/G1期，抑制分裂相關的蛋白質(zhì)和DNA合成，從而抑制腫瘤細胞的分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用[19]。在本資料中，阿帕替尼表現(xiàn)出類似抑制效果，因此作者認為阿帕替尼可通過改變細胞周期

41、來發(fā)揮抗腫瘤作用。為進一步證實，對VEGFR2下游的VEGFR2-PLC-ERK1/2通路進行蛋白免疫印跡試驗。結果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后，磷酸化的PLC與ERK1/2水平明顯下降，且呈濃度依賴性。VEGFR2-PLC-ERK1/2通路被證實與周期調(diào)控和細胞增殖關系密切，活化的ERK1/2通過磷酸化激活Jun癌基因（c-Jun），導致DNA合成和細胞增殖[20,21]。蛋白免疫印跡試驗與細胞增殖抑制和周期受阻結果符合。 綜上所述，阿帕替尼可抑制胃癌細胞株MGC-803的增殖，并將其阻滯于G1期，從而達到抗腫瘤的效果，且該結果與細胞凋亡無關。引起這一現(xiàn)象的原因，可能是阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路關鍵蛋白磷酸化，造成MGC-803細胞DNA合成受阻，生長受限。此外，用阿帕替尼長期處理MGC803細胞后，會出現(xiàn)腫瘤細胞耐藥，為進一步研究這一現(xiàn)象，將做更多研究。 17