恩諾沙星和玉米赤霉烯酮新型納米材料標記免疫檢測方法

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1、摘 要 食品中有毒有害污染物威脅著人類的健康，也是導致食品安全問題出現(xiàn)的重要因素之一。免疫分析方法因其高靈敏度、高通量、高特異性、低檢測成本及操作快捷簡便等優(yōu)異特性而被廣泛應用于食品中痕量污染物的快速分析。以納米材料為探針元件的新型納米免疫傳感分析方法為進一步提高檢測靈敏度及拓寬應用范圍提供了必要的支持。本論文以零維半導體量子點（QDs）、金納米粒子（AuNPs）和二維黑磷納米片（BPNSs）-貴金屬納米復合物（BP-Au、BP-Pt、BP-Au-Pt）等不同維度的納米材料為研究對象，探索了其獨特的光，熱，吸附和催化性能，并依次為免疫傳感分析探針元件，構建了4類新型納米免疫分析方法，從而實

2、現(xiàn)了對食品中小分子污染物的快速，高度靈敏的檢測。具體內容如下： 1. 量子點熒光及熒光淬滅納米免疫層析傳感分析方法的研究 以最大發(fā)射波長（λex）為585 nm的橘紅色CdTe/ZnS羧基水溶性QDs作為熒光探針元件，通過化學共價結合分別與玉米赤霉烯酮（ZEN）單克隆抗體（ZEN-Ab）或抗恩諾沙星（ENR）多克隆抗體（ENR-Ab）偶聯(lián)制備免疫探針，構建了基于QDs熒光信號的半定量免疫層析傳感分析方法（QICS）。并選用λex=525 nm的綠色QDs與雞卵白蛋白（OVA）偶聯(lián)制備作為熒光供體探針，選用最大吸收波長（λAb）為520 nm的AuNPs分別與ZEN-Ab或ENR-Ab結合制

3、備熒光受體探針，構建了基于QDs/AuNPs淬滅體系的熒光淬滅半定量免疫層析傳感分析方法（A-FICS）。在用于ZEN的檢測時，QICS及A-FICS分別實現(xiàn)了PBS緩沖液中1、0.25 μg L-1 ZEN的檢出以及谷物樣品中20、5 μg L-1 ZEN的檢出。在用于ENR的檢測時，QICS及A-FICS同樣分別實現(xiàn)了PBS緩沖液中1、0.25 μg L-1ENR的檢出，且實現(xiàn)了動物源性食品中5、1.25 μg L-1 ENR的檢出。兩種方法均可以在30 min內實現(xiàn)對食品中污染物的快速檢測，且A-FICSs具有更高的靈敏度。相比于市售酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，ICSs具有靈敏度高

4、、快捷及簡便等優(yōu)點，適用于動物源性食品及谷物樣品中食品污染物的現(xiàn)場可視化快速檢測。 2. 黑磷-金納米復合物新型熒光淬滅免疫層析傳感分析方法研究 利用BPNSs的化學不穩(wěn)定性合成了λAb=518 nm的BPNSs-AuNPs復合物（BP-Au），通過密度泛函理論（DFT）探索了BP-Au復合材料的形成機理，并通過熒光分析測定了BP-Au復合材料對QDs的熒光猝滅率。BP-Au與ZEN-Ab偶聯(lián)制備新型熒光淬滅探針。選用λex=525 nm的QDs與OVA偶聯(lián)作為熒光供體探針，構建了基于QDs/BP-Au淬滅體系的熒光淬滅半定量免疫層析分析方法（B-FICS）。B-FICS對ZEN的檢測限為

5、0.1 μg L-1，對谷物樣品進行檢測，檢測限為2 μg kg-1。B-FICS的靈敏度較A-FICS提高了2.5倍，證明對于QDs的淬滅而言，BP-Au比AuNPs具有更強的性能和應用潛力。B-FICS的成功構建為谷物中ZEN的快速，高靈敏度檢測提供了一種新穎的方法，并為BPNSs在免疫傳感分析及食品安全檢測中的應用提供了新思路。 3. 黑磷-金納米復合物高靈敏度光熱免疫層析傳感分析方法研究 除光吸收性能外BP-Au具有優(yōu)異的光熱性能。相較于BPNSs，BP-Au的光熱轉換率（η）提高了12.9%。借助BP-Au良好的光熱性能及物理吸附性能，將ENR-Ab與其偶聯(lián)制備了新型光熱傳感探針

6、。以此構建了基于BP-Au的光熱定量免疫層析分析方法（PT-ICS）。該方法通過對T線處溫度變化的分析實現(xiàn)了ENR的高靈敏定量檢測分析，其檢測限為0.023 μg L-1，線性范圍為0.03-10 μg L-1。對動物源性食品樣品進行檢測，檢測范圍為0.45–150 μg kg-1，回收率為72.6％-126.2％。該PT-ICS較可視化半定量ICS和ELISA試劑盒的測定結果更為靈敏，為動物源性食品中ENR殘留的快速、高靈敏定量檢測提供了新策略，并有望用于其他食品污染物的高度靈敏檢測。 4. 以黑磷-鉑納米復合物為納米酶探針的免疫吸附比色及光熱傳感分析技術研究 在BPNSs表面原位還原超

7、小鉑納米粒子（PtNPs），形成BP -Pt納米酶。基于其良好的類過氧化物酶性質和物理吸附性質，制備了新型的非酶信號探針用以替代辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗，并建立了一步法非酶免疫吸附分析方法（NISS）用于高靈敏度檢測ENR，LOD為0.005μgL-1，靈敏度為0.068μgL-1（R2=0.994）。此外，基于TMB催化氧化產物（oxTMB）在808 nm處的良好光熱性能，建立了光熱免疫吸附測定（PT-NISS）。PT-NISS的檢測結果與NISS一致。另外，NISS和PT-NISS在動物衍生食品樣品中的ENR回收率分別為75.1％-124.1％和71.2％-119.1％。檢測結果與

8、市售ELISA試劑盒一致。NISS和PT-NISS為檢測食品樣品中的殘留污染物提供了更為快速和有希望的策略，并有望用于檢測其他高度敏感的生物大分子。 關鍵詞：食品污染物；二維黑磷納米片；光熱傳感；納米酶；量子點；熒光猝滅；免疫分析 ABSTRACT Food contamination threatens human health and is one of the important factors leading to food safety issues. Immunoassays are widely used for the rapid analysis of trace

9、 contaminants in food due to their high specificity, high sensitivity, high throughput, low detection cost, and fast and easy operation. The new nano-immunoassays using nano-materials as probe elements provides necessary support for further improving the sensitivity and broadening the application ra

10、nge. In this thesis, nano-materials with different dimensions such as zero-dimensional semiconductor quantum dots (QDs), gold nanoparticles (AuNPs) and two-dimensional black phosphorus nanosheets (BPNSs) -precious metal nanocomposites (BP-Au, BP-Pt, BP-Au-Pt) are taken as research object, and their

11、unique light, heat, adsorption and catalytic properties are explored. Using the above nanomaterials as probe elements for immunosensing analysis, five new types of nanoimmunoassays have been established, thereby achieving rapid and highly sensitive detection of small molecular contaminants in food.

12、The details are as follows: 1. Quantum dot fluorescence and fluorescence quenching nanoimmunochromatographic sensing assays In this section, orange-red CdTe/ZnS carboxyl water-soluble QDs with a maximum emission wavelength of 585 nm are used as fluorescent probe elements. They are chemically coval

13、ently bound to zearalenone (ZEN) monoclonal antibody (ZEN-Ab) or anti- Enrofloxacin (ENR) polyclonal antibody (ENR-Ab) was conjugated to prepare immunoprobe, and fluorescent semi-quantitative immunochromatographic sensing assay (QICS) was established. In addition, green QDs with maximum emission wav

14、elength of 525 nm was coupled with chicken ovalbumin (OVA) as fluorescent donor probes, and AuNPs with maximum absorption wavelength of 520 nm was combined with ZEN-Ab or ENR-Ab as fluorescent receptor probes. A fluorescence quenching semi-quantitative immunochromatographic sensing assay (A-FICS) ba

15、sed on QDs/AuNPs quenching system was constructed. When used for the detection of ZEN, QICS and A-FICS respectively achieved the detection limits (LODs) of 1 and 0.25 μg L-1 ZEN in PBS buffer and 20 and 5 μg L-1 ZEN in cereal samples. When used for ENR detection, QICS and A-FICS achieved LODs of 1 a

16、nd 0.25 μg L-1ENR in PBS buffer and 5 and 1.25 μg L-1 ENR in animal-derived food samples. Both assays achieved rapid detection of contaminants in food within 30 minutes, and A-FICSs has higher sensitivity. Compared with commercial ELISA kits, ICSs have the advantages of high sensitivity, quickness,

17、and simple operation. They are suitable for the on-site visualization and rapid detection of food contaminants in cereal and animal-derived food samples. 2. A novel fluorescence quenching immunochromatographic sensing method based on black phosphorus-Au nanocomposites as acceptor probe In this sec

18、tion, the chemical instability of BPNSs was used to synthesize a BPNSs-AuNPs nanocomposites (BP-Au) with a maximum absorption wavelength of 518 nm. The formation mechanism of BP-Au composites was explored by density functional theory (DFT). The fluorescence quenching rate of QDs by BP-Au composites

19、was measured by fluorescence analysis. Furthermore, BP-Au was coupled with ZEN-Ab as novel fluorescence acceptor probe, and QDs with a maximum emission wavelength of 525 nm was coupled with OVA as fluorescent donor probe. A fluorescence quenching semi-quantitative immunochromatographic analysis meth

20、od (B-FICS) based on the QDs/BP-Au quenching system was constructed. B-FICS has LOD of 0.1 μg L-1 for ZEN in PBS buffer and 2 μg kg-1 in cereal samples. The sensitivity of B-FICS is 2.5 times higher than that of A-FICS, which proves that for quenching QDs, BP-Au has stronger performance and applicat

21、ion potential than AuNPs. The successful construction of B-FICS provided a novel method for rapid and high-sensitivity detection of ZEN in cereals, and provided new ideas for the application of two-dimensional BPNSs in food safety testing. 3. High sensitivity photothermal immunochromatographic sens

22、ing assay based on black phosphorus-Au nanocomposite as photothermal probe A novel photothermal sensing probe was established by coupling BP-Au with ENR-Ab through physical adsorption, and a photothermal quantitative immunochromatographic analysis method (PT-ICS) based on the good photothermal perf

23、ormance of BP-Au was constructed. The LOD of PT-ICS for ENR is 0.023 μg L-1 in PBS buffer, and the linear range is 0.03-10 μg L-1. When detection animal derived food samples, the detection range of 0.45–150 μg kg-1 and a recovery rate of 72.6% -126.2% was achieved. The PT-ICS is more sensitive than

24、semi-quantitative ICSs and the ELISA kit, which provides a new strategy for the rapid and highly sensitive quantitative detection of ENR residues in animal-derived foods, and is expected to be used for highly sensitive detection of other food contaminants. 4. Colorimetric and photothermal non-enzym

25、atic immunosorbent sensing assay based on black phosphorus-platinum nanocomposite as nanometer enzyme probe Ultra-small platinum nanoparticles (PtNPs) were reduced in situ on the surface of BPNSs to form BP-Pt nanozymes. Based on its good peroxidase-like properties and physical adsorption propertie

26、s, a novel nanozymatic signal probe was prepared to replace the horseradish peroxidase (HRP) -labeled secondary antibody, and a one-step non-enzymatic immunosorbent assay (NISS) was established. The assay (NISS) was used to highly sensitive detect ENR with LOD of 0.005 μgL-1 and a sensitivity of 0.0

27、68μgL-1 (R2 =0.994) in PBS buffer. In addition, based on the good photothermal performance of TMB catalytic oxidation product (oxTMB) at 808 nm, a photothermal immunosorbent assay (PT-NISS) was established. The test results of PT-NISS are consistent with NISS. In addition, the ENR recoveries of NISS

28、 and PT-NISS in animal-derived food samples were 75.1% -124.1% and 71.2% -119.1%, respectively. The detection results were consistent with commercially available ELISA kits. NISS and PT-NISS provided faster and promising strategies for the detection of residual contaminants in food samples, and are

29、expected to be used to highly sensitive detect other biological macromolecules. Keywords: Food contaminants, quantum dots, two-dimensional black phosphorus nanosheets, photothermal sensing, nanoenzymes, fluorescence quenching, immunoassay 目 錄 第一章 緒 論 1 1.1 食品安全檢測技術概述 1 1.1.1 液相色譜技術 1

30、1.1.2 氣相色譜技術 1 1.1.3 毛細管電泳技術 2 1.1.4 其他前瞻性技術 2 1.2 免疫檢測分析研究概述 2 1.3 納米免疫分析傳感技術研究概述 4 1.3.1比色免疫傳感分析 4 1.3.2 熒光免疫傳感分析 6 1.3.3 光熱免疫傳感分析 11 1.3.4 納米酶免疫傳感分析 13 1.4 二維黑磷納米片 15 1.4.1 黑磷納米片 16 1.4.2 黑磷納米片的制備 17 1.4.3 黑磷納米片的應用 18 1.5 本課題研究的意義和內容 21 1.5.1 研究意義 21 1.5.2 主要研究內容 21 1.6 參考文獻 23 第

31、二章 量子點熒光及熒光淬滅納米免疫層析傳感分析方法的研究 33 2.1 前言 33 2.2 材料與方法 34 2.2.1 實驗試劑 34 2.2.2 主要儀器 35 2.2.3 待測物抗體的純化及包被原的制備 35 2.2.4 傳感探針的制備 36 2.2.5 量子點及熒光及熒光淬滅納米免疫層析傳感分析方法設計思路 37 2.2.6 試紙條的組裝與檢測步驟 39 2.2.7 樣品分析 40 2.3 結果與討論 40 2.3.1 傳感探針的表征 40 2.3.2 免疫層析傳感分析方法的優(yōu)化 42 2.3.3 免疫層析分析方法的建立 47 2.4 本章小結 51 2

32、.5 參考文獻 52 第三章 黑磷-金納米復合物熒光淬滅免疫層析傳感分析方法研究 54 3.1 前言 54 3.2 材料與方法 54 3.2.1 實驗試劑 54 3.2.2 主要儀器 55 3.2.3 玉米赤霉烯酮單克隆抗體純化及包被原的制備 55 3.2.4 熒光淬滅探針的制備（BP-Au-Ab） 56 3.2.5 熒光供體探針的制備（QDs-OVA） 56 3.2.6 黑磷-金納米復合物熒光淬滅免疫層析傳感分析方法設計思路 56 3.2.7 試紙條的組裝與檢測步驟 57 3.2.8 樣品分析 57 3.3 結果與討論 57 3.3.1 黑磷-金納米復合物表征 5

33、7 3.3.2 黑磷-金納米復合物合成機理研究 60 3.3.3 黑磷-金納米復合物熒光淬滅免疫層析傳感分析方法的優(yōu)化 62 3.3.4 黑磷-金納米復合物熒光淬滅免疫層析傳感分析方法的優(yōu)化 64 3.4 本章小結 69 3.5 參考文獻 70 第四章 黑磷-金納米復合物高靈敏光熱免疫層析傳感分析方法研究 73 4.1 前言 73 4.2 材料與方法 74 4.2.1 實驗試劑 74 4.2.2 主要儀器 75 4.2.3 恩諾沙星多克隆抗體的純化及包被原的制備 75 4.2.4 光熱傳感探針的制備[37] 75 4.2.5 光熱性能的測定 76 4.2.6 恩諾

34、沙星黑磷-金納米復合物光熱免疫層析傳感方法設計思路[37] 76 4.2.7 試紙條的組裝與檢測步驟 77 4.2.8 樣品分析 78 4.3 結果與討論 78 4.3.1 黑磷-金納米復合物探針的表征 78 4.3.2 復合物在NC膜上的應用性能評價 79 4.3.3 黑磷-金納米復合物光熱免疫層析傳感方法的優(yōu)化 80 4.3.4 黑磷-金納米復合物光熱免疫層析傳感方法的建立 83 4.4 本章小結 88 4.5 參考文獻 89 第五章 以黑磷-鉑納米復合物為納米酶探針的免疫吸附比色及光熱傳感分析技術研究 93 5.1 前言 93 5.2材料與方法 94 5.2.

35、1 實驗試劑 94 5.2.2 主要儀器 94 5.2.3 恩諾沙星多克隆抗體的純化及包被原的制備 95 5.2.4 BP-Pt納米酶的制備 95 5.2.5 恩諾沙星黑磷-鉑納米酶免疫吸附比色及光熱傳感方法設計思路 95 5.2.6 免疫吸附傳感分析方法的建立及檢測步驟 97 5.3 結果與討論 97 5.3.1 黑磷-鉑納米納米酶探針的表征 97 5.3.2 黑磷-鉑納米復合物穩(wěn)態(tài)動力學分析 101 5.3.3 非酶免疫吸附傳感分析方法的優(yōu)化 103 5.3.4 非酶免疫吸附比色傳感分析方法（NISS）的建立 105 5.3.5 非酶免疫吸附光熱傳感分析方法（PT-N

36、ISS）的建立 108 5.4 本章小結 110 5.5 參考文獻 112 第六章 結 論 115 6.1 全文總結 115 6.2 論文的創(chuàng)新點 116 6.3 論文的不足之處 117 第七章 展 望 118 攻讀博士學位期間發(fā)表論文情況 119 致 謝 122 主要符號表 英文縮寫 英文全稱 中文 AA L-ascorbic acid 抗壞血酸 Ab Antibody 抗體 AFM Atomic force microscope 原子力顯微鏡 BP Black phosphorus 黑磷 BSA Bovine al

37、bumin 牛血清蛋白 EDC 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶聯(lián)免疫吸附分析 FT-IR Fourier transform infrared spectrum 傅里葉變換紅外光譜 HR-TEM High-resolution transmission electron microscope 高分辨率透射電子顯微鏡 LOD Limit of de

38、tection 最低檢測限 MRL Maximum residue limit 最大殘留限量 NHS N-Hydroxy succinimide N-羥基丁二酰亞胺 NIR Near Infrared 近紅外光譜 NP Nanoparticle 納米粒子 NS Nanosheet 納米片 OVA ovalbumin 雞卵白蛋白 PT Photothermal 光熱 PVC Polyvinyl chloride 聚氯乙烯 QDs Quantum dots 量子點 TEM Transmission electron microscope

39、 透射電子顯微鏡 UV Ultraviolet 紫外光譜 XPS X-ray photoelectron spectroscopy X射線光電子能譜分析 第一章 緒 論 食品衛(wèi)生安全直接關系國計民生，同時也是推動經(jīng)濟發(fā)展、促進社會和諧的必要條件。食品貿易的全球化進程增加了受污染食品的傳播風險，食品安全問題作為一個全球性問題，引起了國家、食品行業(yè)以及消費者越來越多的關注。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計，每年約6億人因食品污染物（病原體，天然毒素，食品添加劑，農獸藥殘留等）[1-3]患病，并導致42萬人死亡。其中因真菌毒素污染而造成的糧食安全問題以及因獸藥抗生素殘留而導致

40、的抗菌素耐藥性（AMR）問題已成為全球人類和動物健康的主要威脅。我國2019年發(fā)布的GB 2761—2017和GB 31650—2019標準中，分別對6類真菌毒素和267類獸藥殘留制定了2230項限量及使用要求，實現(xiàn)了對真菌毒素及獸藥品類及食品種類的基本覆蓋，為加強我國食品安全治理管理提供了強有力的支撐[4, 5]。 1.1 食品安全檢測技術概述 食品安全檢測技術的開發(fā)及應用在保障居民食品衛(wèi)生安全中的重要性不言而喻。然而，由于真菌毒素和獸藥殘留往往以痕量的形式存在，加之復雜的食品基質嚴重干擾檢測結果，因此開發(fā)出靈敏度高、準確性好的檢測分析方法一直是食品安全分析領域的巨大挑戰(zhàn)。目前，要實現(xiàn)高

41、精度和高靈敏度，食品分析和安全驗證主要依靠傳統(tǒng)儀器分析方法。 1.1.1 液相色譜技術 帶有不同檢測器（例如二極管陣列檢測器（DAD）、質譜（MS）、熒光檢測器（FLD））的液相色譜（LC）已被廣泛應用于食品污染物檢測中，特別是針對具有高極性、非揮發(fā)性以及熱不穩(wěn)定性的污染物的檢測[6-9]。我國也基于HPLC開發(fā)了多項食品安全國家標準檢測方法。與其他方法相比，該方法因效能高、靈敏度高以及使用廣范等優(yōu)勢而被廣泛接受。其中，基于MS檢測系統(tǒng)的HPLC-MS/MS的檢測過程無需衍生化，通過在色譜洗脫過程中對多個碎片離子的特殊監(jiān)控即可實現(xiàn)定量檢測[10-12]。 1.1.2 氣相色譜技術 搭載

42、不同檢測器（如氫火焰離子檢測器（FID）和熱導檢測器（TCD））的氣相色譜技術（GC）和氣相色譜-質譜（GC-MS）技術被用于食品污染物的檢測[13, 14]。但除了高揮發(fā)性的農藥成分外，多數(shù)食品中污染物因具有高極性和低揮發(fā)性等特性，需要復雜的衍生化后才可通過GC分析。盡管GC相關技術在許多揮發(fā)性農藥殘留檢測及食品揮發(fā)性物質檢測方面具有許多優(yōu)勢[15]，但由于需要進行衍生化步驟（通常會遇到降解問題），因此其在真菌毒素和獸藥殘留等污染物的分析中的應用并不廣泛[16, 17]。 1.1.3 毛細管電泳技術 毛細管電泳（Capillary-electrophoresis，CE）[18-20]因樣

43、品消耗小、高校、快速等優(yōu)勢而得到了廣泛的應用。但CE常需通過搭載檢測器（如紫外、電導率及化學發(fā)光檢測器）等方式實現(xiàn)分析檢測，且其較短的光路嚴重影響了檢測靈敏度[21]，因此限制了其在真菌毒素和獸藥殘留等污染物檢測中的應用。 1.1.4 其他前瞻性技術 復雜的檢測步驟，笨重且昂貴的儀器是限制其在現(xiàn)場測試中應用的主要瓶頸。儀器的靈敏度和便攜性似乎無法同時實現(xiàn)。因此，研究人員將目光轉向其他前瞻性方法上，例如拉曼光譜技術（Raman）[22, 23]、分子印跡技術（MIT）[24, 25]、電化學方法或時間分辨光譜技術[26, 27]。不幸的是，同樣的問題仍然存在。 值得一提的是，食品中蛋白質、

44、鹽類、脂質和其他小分子物質等復雜成分極易污染儀器，從而導致信號波動大、檢測靈敏度低以及基質效應等一系列問題。因此，樣品預處理成為了幾乎所有儀器分析檢測中最為基本且必不可少的步驟[28-30]。常見的樣品預處理方法包括固相萃取（SPE）[31, 32]，分散固相萃取（D-SPE）[33, 34]，固相微萃?。⊿PME）[35, 36]，免疫親和柱（IAC）[37]，磁性固相萃?。∕SPE），分散液-液微萃取（DLLME）等方法[38-40]。但預處理過程操作繁瑣、耗時長、提取試劑及樣品需求量大且損耗程度高等問題，成為了限制儀器分析技術應用的又一個關鍵因素。 因此建立高效、快速、高靈敏度的現(xiàn)場快

45、速分析技術，使食品污染物的檢測分析方法逐漸向更簡單，更高效的方向邁進，對從源頭上控制和防范食品安全風險，實現(xiàn)“從農田到餐桌”的食品安全綜合管理，保證食品產業(yè)的可持續(xù)、快速發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。 1.2 免疫檢測分析研究概述 免疫分析技術（Immunoassay，IA）于20世紀50年代興起，Yalow和Berson于1959年首次提出的放射免疫檢測方法[41]，并因此而獲得1977年諾貝爾生理和醫(yī)學獎[42]。這成為了當時唯一的生物學分析技術。但放射性元素對人體健康帶來的危害以及其廢物對環(huán)境造成的惡劣影響使得開發(fā)基于非放射性標記物的免疫分析方法成為了亟待解決的問題。1966年下半年，Av

46、rameas和Pierce首次開發(fā)了抗原抗體的酶標記技術（Immuno-enzymatic techniques），在一定程度上解決了信號標記的問題。自酶標記技術在1970年被用于免疫組織化學檢測后，Engvall和Perlmann于1971年首次實現(xiàn)了固相酶免疫定量檢測[43]，標志著酶聯(lián)免疫吸附分析方法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）的成功構建（圖1-1）。自此，IA技術被廣泛應用于生物醫(yī)學診斷、食品和環(huán)境污染物檢測分析等領域。 圖1-1 免疫分析技術基本原理 Fig. 1-1 Scheme of immunoassays IA的

47、根本原理為至少一種抗體與抗原發(fā)生特異性的結合反，通過與抗原或抗體偶聯(lián)的標記物的信號放大反應實現(xiàn)對待測物的定性或定量檢測[44]。常見的IA可分為競爭分析（直接競爭[45]和間接競爭[46]）和非競爭分析（雙抗夾心）兩類。在眾多應用領域中，對真菌毒素、農獸藥殘留、以及生理激素等食品及環(huán)境中常見的小分子污染物的識別及檢測通常通過競爭法實現(xiàn)，這是因為其僅具有單一表面決定簇，無法形成多個抗體[47-49]。目前已有基于獨特型抗體、抗異型抗體或抗體可變區(qū)片段的開放夾心式非競爭分析方法應用于小分子待測物的檢測中，但仍處于探索階段[50]。對于腫瘤標志物、致病菌、食物過敏源等具有多個表面決定簇的生物大分子待

48、測物而言，常通過雙抗夾心的方式實現(xiàn)高靈敏檢測[51-53]。 在ELISA的基礎上，1985年，Zuk RF等人將酶標記免疫分析、色譜分析和毛細管遷移等方法相結合開發(fā)了酶標記的可視化快速免疫層析分析方法（immuno-chromatographic assay，ICA）（圖1-2）[54]。與ELISA相比，ICA操作簡單，不依賴儀器，無需苛刻的實驗室條件以及專業(yè)檢測技術人員即可實現(xiàn)快速可視化分析。金納米顆粒（AuNPs）的引入更是使得ICAs逐漸成為了現(xiàn)場即時檢測（point-of-care testing，POCT）最主要的檢測手段之一，在解決全球健康問題工作中起到了至關重要的作用[55

49、]。 圖1-2 免疫層析分析檢測技術示意圖[56] Fig. 1-2. The basic structure of ICA 相較于上述儀器分析方法而言，免疫分析技術具有更高的可操作性，無需昂貴的儀器設備以及復雜的樣品前處理過程。同時，免疫分析技術還因具有檢測通量高、特異性強、線性范圍好、耗時短及成本低等不可比擬的優(yōu)勢而在分析領域種具有不可替代性。 1.3 納米免疫分析傳感技術研究概述 隨著納米技術的發(fā)展，自然科學的每個分支都受到了巨大影響。納米材料是一類一維或多維尺寸在1-100 nm（納米尺寸）范圍，或由其作為基本粒子組成的材料[57, 58]（圖1-3）。根據(jù)結構不同，納米

50、材料可被分為零維（0D）、一維（1D）、二維（2D）及三維（3D）材料，其中，將0D、1D和2D材料稱為低維材料。納米材料具有獨特的小尺寸效應（small size effect）、表面效應（surface effect）、量子尺寸效應（quantum size effect）及量子隧道效應等特性（quantum tunneling effect），并因結構尺寸、材質及形態(tài)的不同在聲、光、熱、磁、力、電等方面表現(xiàn)出了多種多樣的異于宏觀物質的優(yōu)異性能。基于上述特性，納米材料為生物醫(yī)學、航天、能源、環(huán)境以及化工等領域的發(fā)展提供了有力的支撐。 圖1-3 納米材料尺寸及分類示意圖 Fig. 1

51、-3 Schematic diagram of dimensional and classification of nanomaterials 1.3.1比色免疫傳感分析 比色分析（Colorimetric analysis）是在IA中應用最早也最為廣泛的技術之一。在初篩檢測過程中，基于比色傳感探針的信號輸出無需信號讀取分析系統(tǒng)即可通過肉眼識別實現(xiàn)定性、半定量的檢測分析，在便捷性和可操作性上均具有不可替代的優(yōu)勢。在熒光素、放射性元素及酶標記之后，1971年金納米粒子（AuNPs）的引入開啟了納米免疫分析的新篇章，并被逐漸應用于ICS的建立。 回顧過去，對于AuNPs的研究歷史可以追溯到法

52、拉第時代。法拉第在1857年發(fā)表的著作中[59]首次描述了膠體金的制備，并稱其為“可食用黃金”。該項工作為后來的膠體科學奠定了基礎。自19世紀以來，不斷有各種各樣的納米粒子被合成及應用，其合成手段也囊括了物理和化學等領域。從早期的氣體蒸發(fā)法、粉碎法逐漸發(fā)展到了后期因表面活性劑的引入而發(fā)展的氣相及液相反應法等，納米粒子的可控性、功能性以及分散性等具有被不斷提高，而因此所產生的多種性能更是推動了信息、能源、生物醫(yī)學等領域的發(fā)展。 圖1-4（A）AuNPs的LSPR效應原理圖，（B）塊狀Au的反射光譜與（C）AuNPs的消光光譜 Fig. 1-4 (A) LSPR scheme of AuN

53、Ps, (B) reflection spectrum of bulk Au and (C) extinction spectrum of AuNPs 金屬NPs具有明顯的表面效應，從而影響其光學、電學、熱力學以及磁性性質。金屬NPs表現(xiàn)出的局域表面等離子共振（LSPR）效應(圖1-4A)使其具有吸收，散射，表面增強拉曼散射（SERS）和許多其他特性。以AuNPs為例，其表現(xiàn)出了與塊狀Au單質完全不同的光學性質,且NPs的LSPR特性與粒徑有關，隨球形AuNPs的粒徑由10 nm增加到100nm，其LSPR從520 nm轉變?yōu)?70 nm（圖1-4B, C）。另外，在上述粒徑范圍內，其比表面

54、積可達到20 m2 g-1-70 m2 g-1，從而在吸附性能和化學反應活性中表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢?；谏鲜鎏匦?，NPs常被作為比色探針元件、SERS基底等用于分析領域。 然而傳統(tǒng)的A-ICS靈敏度較低，因此科學家們通過1）由納米粒子積聚介導的信號增強；2）由貴金屬納米粒子的生長誘導的信號放大；3）基于酶介導的有色產物沉積的信號增強等多種手段實現(xiàn)了靈敏度的進一步提高。 圖1-5 基于信號放大手段的比色免疫層析技術[60] Fig. 1-5 Colorimetric immunochromatography based on signal amplification Cui等人首次報道

55、了一種利用雙重AuNPs偶聯(lián)實現(xiàn)信號放大的ICSs，通過利用兩種不同的AuNPs抗體偶聯(lián)物來靈敏地測定心肌肌鈣蛋白I（cTnI）（圖1-5A）。結果表明，改進的基于AuNPs的ICTS納米傳感器可以在10 min內檢測0.01 μg L-1的cTnI。與沒有信號放大的傳統(tǒng)ICTS相比，靈敏度提高了約100倍[61]?；谙嗤脑?，Zhong等人實現(xiàn)了1.4 μg L-1三聚氰胺的檢測[62]。另外，Pan等人通過將捕獲抗體-AuNPs共軛物固定在T線上建立了新型基于雙重AuNPs的ICSs，并實現(xiàn)了奶粉中103 CFU mL-1阪崎腸桿菌的高靈敏檢測（圖1-5B）。與傳統(tǒng)ICSs相比，靈敏度

56、提高了約100倍[63]。Xu等人使用寡核苷酸連接的AuNPs聚集體作為標記探針，用于檢測1型人類免疫缺陷病毒（HIV）的核酸序列（圖1-5C）。檢測靈敏度較傳統(tǒng)A-ICSs方法提高了2.5倍[64]。Zhou等人則通過在1D材料二氧化硅納米棒表面種子介導AuNPs原位生長實現(xiàn)信號放大用于測量兔IgG（圖1-5D）。方法的檢測LOD低至0.01 μg L-1，較傳統(tǒng)ICSs的靈敏度提高了50倍[65]。 1.3.2 熒光免疫傳感分析 熒光標記技于1941年由Coons等人開創(chuàng)并應用于免疫學技術中。以異硫氰酸熒光素（FITC）熒光蛋白為代表的傳統(tǒng)熒光探針因具有靈敏度高、特異性好、抗干擾能力強

57、等優(yōu)勢在醫(yī)學診斷等生命科學領域的發(fā)展中起到至關重要的作用。在納米技術的推動下，半導體量子點（QDs）、上轉換納米顆粒（UCNPs）、原子團簇（NCs）以及碳量子點（CDs）等新型熒光納米材料的引入在極大程度上提高了熒光標記技術的應用性能并拓寬了其應用范圍。與現(xiàn)有的小分子染料和熒光蛋白相比，納米熒光材料在顏色種類、比表面積以及其他物理化學性能中均表現(xiàn)出了更高的可調控性，有望替代傳統(tǒng)熒光探針實現(xiàn)高靈敏分析檢測。 1.3.2.1 量子點 在IA中，較為成熟的熒光傳感探針當屬量子點（Quantum dots，QDs），即尺寸在1-100 nm的處于NCs和宏觀物體交界的過渡區(qū)域的納米材料。經(jīng)典研究

58、中將QDs定義為半徑尺寸小于或接近激子波爾半徑的半導體納米晶。而隨著近年來納米技術研究的不斷深入，量子點的概念也得到了延伸，主要研究方向也從金屬硫族化合物拓展到了包括碳量子點、基于二維材料的量子點以及其他不含鎘的無機納米晶體等領域。 半導體量子點（semiconductor quantum dot，QDs）主要由II—VI族(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)和III-V族(如InP、InAs等)元素組成的半導體材料[66]。其中，II-VI組QDs通常顯示出色的發(fā)光特性，但同時也具有一定的生物毒性。而III-V組QDs的毒性較小，但其光學特性相對II-VI組較差。1981年，CdS

59、膠體的制備拉開了QDs研究的序幕[67]，1993年，Bawendi等人通過成核生長的方式制備了CdSe等硫族半導體納米晶體，并由此加速了QDs研究的進程[68]。根據(jù)合成方法的不同，QDs可分為膠體QDs（化學溶液生長法）、自組裝QDs（外延生長法）及場約束QDs（電場約束法）。其中，膠體QDs粒徑較?。ㄒ话阍?-20 nm）在尺寸和形狀可控性、單分散性及光譜純度和量子產率（QY）等特性中均具有不可比擬的優(yōu)勢，且因其制備成本低、合成相對簡單等優(yōu)點而被廣泛研究及應用[69]。 圖1-6 QDs的（A）能帶圖，（B）光致發(fā)光光譜圖，（C-E）核心和表面結構[66, 70, 71] Fig

60、. 1-6 The (A) Band gap diagram, (B) Photoluminescence spectrum diagram, and (C-E) Core and surface structure of QDs 與塊狀半導體不同，QDs的電子和空穴的運動在三個維度內均被限制，半導體能級在尺度極小時產生量子化現(xiàn)象，并表現(xiàn)出與原子類似的離散量子能譜，因此QDs也被成為“人造原子”，同時，這也是QDs和其他納米粒子的區(qū)別。QDs表現(xiàn)出尺寸和形狀依賴性，隨著尺寸的增加，QDs帶隙減小，光致發(fā)光(Photoluminescence, PL)光譜也隨之紅移（圖1-6A-B）。另外，Q

61、Ds的比表面積對其表面性質具有重要影響，隨粒徑的減小，QDs的比表面積增大，表面原子占比增加，從而導致表面原子配位不足并產生懸空鍵缺陷（圖1-6C, D）。這些表面態(tài)會降低量子點的穩(wěn)定性及電子和光學性質。上述性能是QDs量子限域效應、表面效應等特性的體現(xiàn)，也因此，量子點具有尺寸、形狀和組成可調的電子和光學特性。QDs的懸空鍵可以通過配位修飾彌補，提高穩(wěn)定性的同時進而提高其QY。QD表面的缺電子金屬離子通常與富電子親核配體相互作用。金屬硫屬化物和其他化合物量子點的表面還暴露了可以與親電子物質相互作用的富電子位點，例如Cd（OOCR）2或PbCl2，它們通過金屬原子上的空軌道與量子點表面結合（圖1

62、-6E）。同時，QDs作為納米半導體，其所具有的介電限域效應及量子隧道效應也使其顯示出了不同于常規(guī)半導體的獨特性能。 圖1-7 QDs的發(fā)射光譜范圍[70] Fig. 1-7 Emission spectrum range of QDs QDs在具有傳統(tǒng)熒光基團所具有的大多數(shù)特性的同時，還表現(xiàn)出了其他優(yōu)異的熒光性能。根據(jù)組成元素及粒徑大小的不同，QDs可以實現(xiàn)發(fā)射光譜從可見光譜到中紅外（MIR）區(qū)光譜的全覆蓋（圖1-7），這些波長延伸到MIR區(qū)域的熒光具有更長的熒光壽命。另外，其高光致發(fā)光量子產率（>90%）、良好的生物相容性、光/化學穩(wěn)定性以及表面改性的可能性等特點使其在生物化學、

63、免疫化學、細胞生物學等學科的研究中得到了廣泛的應用。 圖1-8 量子點在免疫分析技術中的應用[72-74] Fig. 1-8 Application of QDs in immunoassay 在現(xiàn)有文獻報告中，已經(jīng)探索了諸多簡單，靈敏的基于QD的熒光免疫傳感分析方法。相較于比色傳感分析方法而言，熒光標記技術大幅提升了檢測靈敏度。另外，當QD裝載或封裝在其他材料中時，其靈敏度可以得到進一步提高。在Bai等人的工作中，QDs被裝載在二氧化硅納米顆粒上，與甲胎蛋白（AFP）抗體偶聯(lián)制備了熒光傳感探針，以此建立的ICS分析獲得了良好的靈敏度，其LOD比基于AuNPs比色ICS低十倍（圖1-

64、8A）[72]。Ren等人則通過封裝CdSe/ZnS QDs合成了高發(fā)光量子點珠（QBs），構建了新型信號放大的ICS。在用于玉米中黃曲霉毒素B1（AFB1）的超靈敏檢測時，基于QB的ICS的LOD為0.42 pg mL-1（圖1-8B）。較基于QDs的ICS而言，靈敏度提高了39倍，較基于AuNPs的比色ICS而言靈敏度提高了2個數(shù)量級[73]。 圖1-9 石墨烯量子點在免疫分析技術中的應用[74] Fig. 1-9 Application of GQDs in immunoassay 另外，Sun等人基于Au/MWCNTs納米雜化物對N摻雜石墨烯量子點（N-GQDs）和CdS Q

65、Ds雙敏化海膽狀TiO2的雙重抑制作用建立了一種超靈敏光電化學免疫傳感器（PEC）用于定量檢測前列腺特異性抗原（PSA），檢測限為6.16 pg L-1（圖1-9）。方法具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性，為PEC的應用提供了廣闊的平臺和新的參考思路。 1.3.2.2金屬納米團簇 進入超小尺寸體系（<3 nm）的金屬納米團簇（Metal Nanoclusters，m-NCs）因其量子限域效應[75]而具有光學吸收、光致發(fā)光、催化活性及手性等獨特的理化性質，使其無論在物理、化學等基礎研究領域或是在生物醫(yī)學、化工、制藥等應用研究領域均取得了突破性進展[76, 77]。M-NCs是一類在配體（蛋白、DNA

66、或硫醇等）保護下由幾個到幾百個原子形成的尺寸小于3 nm的聚集體[78]（圖1-10）。在各類金屬團簇中，以硫醇鹽物質作為配體的金屬團簇因可以實現(xiàn)原子精度的表征分析，有助于以原子精度控制膠體納米粒子并實現(xiàn)對其整體結構的探索，已成為了現(xiàn)階段主要研究方向[79, 80]。目前，常見的NCs主要包括金、銀、鉑、鈀等貴金屬納米團簇及銅、鐵、鎳等納米簇和合金納米簇等[81, 82]。 圖1-10 納米團簇尺寸示意圖[83] Fig. 1-10 Scheme of nanocluster size 2011年，Zhuetal等人以AuNCs作為信號放大探針，創(chuàng)新性的制備了一種低成本的便攜光學免疫傳感器，以人IgG作為模型來證明擬議傳感器的性能。通過夾心免疫反應，基于AuNCs的雙信號放大和銀增強，實現(xiàn)了0.005 μg L-1IgG的檢測（圖1-11A）[84]。同時，可根據(jù)臨床需要，通過比色法，熒光法和肉眼觀察定性和定量測定IgG。等人通過靜電相互作用將AuNCs摻入多孔碳酸鈣（CaCO3）球中，并進一步裝配了辣根過氧化物酶/檢測抗體結合物（HRPAb2）以制備傳感探針，用于開發(fā)癌癥生