《53《血紅蛋白的提取和分離》參考課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《53《血紅蛋白的提取和分離》參考課件（59頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離 血紅蛋白含有四條肽鏈血紅蛋白含有四條肽鏈, ,每條肽鏈環(huán)繞一個每條肽鏈環(huán)繞一個亞亞鐵血紅素基團(tuán)，鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血紅蛋白因含有血紅蛋白因含有血紅素血紅素而呈而呈紅色。紅色。一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識: :學(xué)生活動學(xué)生活動1:1:1 1 、分離生物大分子的基本思路是什么？、分離生物大分子的基本思路是什么？2 2 、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3 3 、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)
2、蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？的差異進(jìn)行提純？4 4 、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？實(shí)驗(yàn)材料？5 5 、用什么方法分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)、用什么方法分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì) ？一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識-蛋白質(zhì)提取和分離原理蛋白質(zhì)提取和分離原理 蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物理化蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：學(xué)性質(zhì)： 形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。質(zhì)、親和力等千差萬別。 提取提取分離分離方法方法凝膠色譜法凝膠色譜法 凝膠電泳法凝膠電
3、泳法 （1 1）原理：）原理：（2 2）材料）材料大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 ( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法（3 3）分離過程）分離過程 混合物混合物上上 柱柱洗洗脫脫大分子流動快大分子流動快小分子流動慢小分子流動慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速
4、流動。白質(zhì)分子的差速流動。 ( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法 1 1、什么是凝膠？、什么是凝膠？ 2 2、什么是凝膠色譜法？、什么是凝膠色譜法？學(xué)生活動學(xué)生活動2:2:3 3、凝膠色譜法的原理是什么？、凝膠色譜法的原理是什么？4 4、請用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對分子質(zhì)、請用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過程。量不同蛋白質(zhì)的具體過程。1 1 、什么是緩沖液？、什么是緩沖液？2 2、 緩沖液的作用是什么？緩沖液的作用是什么？學(xué)生活動學(xué)生活動3:3:3 3、 緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過的人體緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過的人體血液的緩沖物質(zhì)有哪些？血液的緩沖物質(zhì)
5、有哪些？4 4、 本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？（二）、緩沖溶液（二）、緩沖溶液由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，醋酸，醋酸/ /醋酸鈉，醋酸鈉，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等緩沖溶液洗脫劑緩沖溶液洗脫劑組成：組成：配制：配制：作用：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pHpH的緩沖液。的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液抵制外界酸堿對溶液pHpH的干擾而保持的干擾而保持 pHpH穩(wěn)定。穩(wěn)定。（二）
6、、緩沖溶液（二）、緩沖溶液1 1 、什么是電泳？、什么是電泳？2 2、 影響電泳遷移速度的因素有哪些？影響電泳遷移速度的因素有哪些？學(xué)生活動學(xué)生活動4:4:4 4、電泳分離各種分子的原理是什么？、電泳分離各種分子的原理是什么？（三）、電泳（三）、電泳3 3、 如何消除電荷對電泳遷移速度的影響？如何消除電荷對電泳遷移速度的影響？5 5 、請描述電泳的過程？、請描述電泳的過程？2 2凝膠電泳法：凝膠電泳法：（1 1）原理：）原理： 不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)
7、致不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動方向和運(yùn)不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動方向和運(yùn)動速度不同。動速度不同。 影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素( (三三) )電泳電泳1.1.電泳的概念電泳的概念指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程. .影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素 決定決定運(yùn)動方向運(yùn)動方向形成形成庫侖力庫侖力形成形成阻力阻力決定決定運(yùn)動速率運(yùn)動速率電荷性質(zhì)電荷性質(zhì)電荷量電荷量分子形狀分子形狀分子大小分子大小 在一定在一定pHpH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的加入
8、帶負(fù)電荷多的SDSSDS，形成，形成“蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合復(fù)合物物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 （2 2）分離方法：）分離方法：（3 3）分離過程：）分離過程： 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。( (三三) )電泳電泳電泳檢測結(jié)果電泳檢測結(jié)果二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1 1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2 2）
9、粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3 3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。白質(zhì)除去。（4 4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。（一）樣品處理（一）樣品處理1 1、紅細(xì)胞的洗滌：、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。用生理鹽水洗滌。2 2、血紅蛋白的釋放：、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用
10、下，紅細(xì)胞破裂釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放3 3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。漏斗分出紅色透明液體。4 4、透析：、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PHPH為為7.07.0）透析。）透析。樣品處理樣品處理粗粗 分分 離離純純 化化純度鑒定純度鑒定 血液組成血液組成成分成分 1.洗洗 滌滌 紅紅 細(xì)細(xì) 胞胞 2.釋放釋放血紅蛋白血紅蛋白 3.分離分離血紅蛋白血紅蛋白 4.透析透析血紅蛋白血紅蛋白二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作跳轉(zhuǎn)跳轉(zhuǎn)血液組成成分
11、血液組成成分閱讀思考：閱讀思考：1.1. 血液由血液由_和和_兩部分組成。兩部分組成。2.2. 血細(xì)胞中血細(xì)胞中_細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是量最高的有機(jī)化合物是_。3.3. 該化合物是由該化合物是由 _和和_構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2O2和和CO2CO2結(jié)合的結(jié)合的_基團(tuán)?；鶊F(tuán)。血漿血漿血細(xì)胞血細(xì)胞紅細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白血紅蛋白2 2條條-肽鏈肽鏈2 2條條-肽鏈肽鏈 亞鐵血紅素亞鐵血紅素返回返回1.1.洗洗 滌滌 紅紅 細(xì)細(xì) 胞胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：洗滌過程
12、：血液血液100mL100mL3g3g檸檬酸鈉檸檬酸鈉低速離心低速離心2 min2 min紅細(xì)胞紅細(xì)胞血血 漿漿吸出血漿吸出血漿紅細(xì)胞紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水倍體積生理鹽水?dāng)嚢钄嚢?0min重復(fù)洗滌重復(fù)洗滌3 3次，直至上清液沒有黃色次，直至上清液沒有黃色采集得到雞血采集得到雞血初次離心后的結(jié)果初次離心后的結(jié)果3 3次洗滌后的結(jié)果次洗滌后的結(jié)果返回返回2.2.釋放血紅蛋白釋放血紅蛋白閱讀思考：閱讀思考：1.1. 釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？哪些物質(zhì)？2.2. 為了加速釋放過程，采取了什么措施？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的
13、分析：目的分析：蒸餾水的作用是蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢璧哪康氖浅浞謹(jǐn)嚢璧哪康氖莀。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂加速紅細(xì)胞的破裂(2)(2)血紅蛋白的釋放：血紅蛋白的釋放： 加蒸餾水到原血液體積，再加加蒸餾水到原血液體積，再加4040體積的甲苯，體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢柚糜诖帕嚢杵魃铣浞謹(jǐn)嚢?010分鐘（加速細(xì)胞破分鐘（加速細(xì)胞破裂）裂）, ,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。磁力攪拌器磁力攪拌器返回返回3.3.分離血紅蛋白分離血紅蛋白分離過程分離過程紅細(xì)胞紅細(xì)胞混合
14、液混合液高速離心高速離心10min 離心管離心管濾紙濾紙過濾過濾脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)燒杯燒杯(3)(3)分離血紅蛋白溶液：分離血紅蛋白溶液： 過程：過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min2000r/min的速度離心的速度離心10 min10 min。 試管中溶液層次：試管中溶液層次：第第1 1層（最上層）：甲苯層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第層（無色透明）；第2 2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第淀層（白色薄層固體）；第3 3層（中下層）：血紅蛋層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第白的
15、水溶液層（紅色透明液體）；第4 4層（最下層）：層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。 分離：分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。甲苯層甲苯層（無色透明無色透明）白色薄層固體白色薄層固體紅色透明液體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層雜質(zhì)沉淀層（暗紅色暗紅色）試管中溶液層次試管中溶液層次返回返回4.4.透析血紅蛋白透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液1mL1mL利用透析袋透析利用透析袋透析透析過程透析過程返回返回純化凝膠色譜操作純化凝膠色譜操作1.1.
16、凝膠色譜柱的凝膠色譜柱的制作制作：2.2.凝膠色譜柱的凝膠色譜柱的裝填裝填：教材圖教材圖5 519193.3.樣品的樣品的加入和洗脫加入和洗脫返回返回（二）凝膠色譜操作（二）凝膠色譜操作（1 1）凝膠色譜柱的制作：）凝膠色譜柱的制作： 取長取長4040厘米，內(nèi)徑厘米，內(nèi)徑1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，兩端需用砂紙兩端需用砂紙磨平。磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端端。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出底塞中插入的玻璃管
17、的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：頂塞的制作：打孔打孔安裝玻璃管安裝玻璃管。組裝：組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。裝配好的凝膠柱返回返回材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75G-75；20mmol/L20mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液裝填裝填: :2.2.凝膠色譜柱的裝填：凝膠色譜柱的裝填：步驟步驟操作要求操作要求立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12
18、h12h洗滌平衡洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液裝填懸浮液凝膠顆粒洗脫液凝膠顆粒洗脫液沸水浴沸水浴 凝膠顆粒蒸餾水凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱固定色譜柱（2 2）凝膠色譜柱的裝填）凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇：凝膠的選擇：A A、材料：、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-G-7575）。）。B B、代表意義、代表意義：“G”G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍程度及分離范圍
19、。7575表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水脹時(shí)吸水7.57.5克?？?。 凝膠的前處理：凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：配制凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法：凝膠色譜柱的裝填方法：A A、固定：、固定：將色譜柱裝將色譜柱裝置固定在支架上。置固定在支架上。B B、裝填：、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。勻
20、。注意：注意：1 1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。之間的空隙。 2 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)橐驗(yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 洗滌平衡：洗滌平衡：裝填完畢后，裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm50cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pHpH為為7.07.0）充分洗滌平衡充分洗滌平衡1212小時(shí)小時(shí)。 注意：注意：1 1
21、、洗脫液面不要、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。離效果。2 2、不能發(fā)生洗脫液、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。返回返回3.3.樣品加入與洗脫樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面：調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：滴加透析樣品：吸管吸吸管吸1ml1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管
22、管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時(shí)注意不要破壞樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。凝膠面。 樣品滲入凝膠床：樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：洗脫：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)?shù)牧姿峋彌_液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集待紅色的蛋白質(zhì)接近色
23、譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一試管，連續(xù)收集收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功） 注意：注意：正確的加樣操作：正確的加樣操作：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。2 2、貼壁加樣。貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3.3.樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫3.3.樣品加入與洗脫樣品加入與洗脫注意：注意：正確的加樣操作是：正確的加樣操作是：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。2 2
24、、貼壁加樣。、貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。收集得到的純化后的血紅蛋白收集得到的純化后的血紅蛋白注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1. 1. 紅細(xì)胞的洗滌：紅細(xì)胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。2. 2. 凝膠的預(yù)處理：凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡3. 3. 色譜柱的裝填：色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。脫液不能斷流。4. 4. 色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶
25、均勻一致地移動。為什么？為什么？返回返回觀察你處理的血液樣品離心后觀察你處理的血液樣品離心后是否分層是否分層（見教科（見教科書圖書圖5-185-18），），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價(jià)三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價(jià)1 1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處、你是否完成了對
26、血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 2 2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖葡聚糖20002000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如或紅色葡聚糖
27、，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的亂、變寬
28、，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。裝填有關(guān)。 3 3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？斷分離效果？知識總結(jié)知識總結(jié)血血紅紅蛋蛋白白的的提提取取和和分分離離蛋白質(zhì)分子的差異性蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法凝膠色譜法原原 理理分離過程分離過程凝膠電泳法凝膠電泳法緩沖溶液緩沖溶液組組 成成作作 用用蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的提取分離提取分離樣品處理樣品處理粗粗 分分 離離純純 化化純度鑒定純度鑒定教學(xué)反饋教學(xué)反饋 1 1凝膠色譜法是根據(jù)（凝膠色譜法是根據(jù)
29、（ ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。）分離蛋白質(zhì)的有效方法。 A A分子的大小分子的大小 B B相對分子質(zhì)量的大小相對分子質(zhì)量的大小 C C帶電荷的多少帶電荷的多少 D D溶解度溶解度2 2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（維持（ ）基本不變。）基本不變。 A A溫度溫度 B pH B pH C C滲透壓滲透壓 D D氧氣濃度氧氣濃度BB3 3電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（荷（ ）的電極移動。）的電極移動。 A A相同相同 B B相反相反 C C相對相對 D D相向相向4. 4
30、. 哺乳動物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（哺乳動物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（ ）與）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。 A A血紅蛋白血紅蛋白 B B肌紅蛋白肌紅蛋白 C C肌動蛋白肌動蛋白 D D肌球蛋白肌球蛋白BA5 5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的）的含量最多。含量最多。 A A白細(xì)胞白細(xì)胞 B B血小板血小板 C C紅細(xì)胞紅細(xì)胞 D D淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞6 6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑（血劑（ ）。）。 A. NaCl B.A. NaCl B.甲苯甲苯 C. C.蒸餾水蒸餾水 D.D.檸檬酸
31、鈉檸檬酸鈉CD7 7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為顯看到試管中的溶液分為4 4層，其中第層，其中第3 3層是（層是（ ） A A無色透明的甲苯層無色透明的甲苯層 B B脂溶性物質(zhì)的沉淀層脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C C血紅蛋白的水溶液血紅蛋白的水溶液 D D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物C1 1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對蛋白質(zhì)的研究和、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B
32、B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能弄清各種蛋白質(zhì)的功能C C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D D 獲得高純度的蛋白質(zhì)獲得高純度的蛋白質(zhì)練習(xí)鞏固練習(xí)鞏固2 2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是的敘述，正確的是A A 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B B 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C C 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)
33、行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D D 二者根本無法比較二者根本無法比較3 3、使用、使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于的電泳遷移率完全取決于A A 電荷的多少電荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽鏈的多少肽鏈的多少 D D 分子形狀的差異分子形狀的差異4 4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A A 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH B pH B 維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C C 防止微生物生長防止微生物生長 D D 防止血液凝固防止血液凝固5 5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的、一分子血紅蛋白最多可攜帶的 O O2 2分子數(shù)和分子數(shù)和COCO2 2分子數(shù)分別是分子數(shù)分別是A 4A 4、2 B 42 B 4、4 4 C 2C 2、1 D1 D、1 1、1 16 6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序序自上而下自上而下是：是：有有機(jī)溶劑機(jī)溶劑-脂脂類物質(zhì)類物質(zhì)-血血紅蛋白溶液紅蛋白溶液- -紅紅細(xì)胞破碎物沉淀細(xì)胞破碎物沉淀
53《血紅蛋白的提取和分離》參考課件
