（江蘇專版）2019版高考生物二輪復(fù)習(xí) 專題八 現(xiàn)代生物科技專題講義（含解析）.doc

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現(xiàn)代生物科技專題 [理清——知識聯(lián)系] [記清——主干術(shù)語] 1．基因工程操作中用到的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和載體。 2．限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割。 3．質(zhì)粒是常用的載體，它是一種小型的環(huán)狀DNA分子，具有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)及標(biāo)記基因。 4．基因工程的基本操作程序：目的基因的獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測與鑒定。 5．基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。 6．目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)入動物細(xì)胞常用顯微注射法，導(dǎo)入微生物細(xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法。 7．檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因常用DNA分子雜交技術(shù)，檢測目的基因是否進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄同樣是采用分子雜交技術(shù)，檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)常用抗原—抗體雜交技術(shù)。 8．蛋白質(zhì)工程的操作過程：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)→基因表達(dá)→產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)。 9．植物組織培養(yǎng)的基本過程： 外植體愈傷組織根、芽→植物體。 10．植物體細(xì)胞雜交需要用酶解法制備原生質(zhì)體，所用的酶包括纖維素酶和果膠酶。 11．人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法分為物理法和化學(xué)法，物理法包括離心、振動、電激等，化學(xué)法一般用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑。 12．動物細(xì)胞培養(yǎng)需滿足的條件有充足的營養(yǎng)、適宜的溫度和pH、氣體及無菌、無毒的環(huán)境。 13．單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，并可以大量制備的優(yōu)點(diǎn)。 14．誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電激等。 15．早期胚胎發(fā)育的過程：受精卵→卵裂期→桑椹胚→囊胚→原腸胚。 16．胚胎的早期培養(yǎng)所需培養(yǎng)液的成分包括：無機(jī)鹽、有機(jī)鹽(兩鹽)；維生素、激素(兩素)；氨基酸、核苷酸(兩酸)以及水、血清等。 17．胚胎移植的基本程序：對供、受體的選擇和處理→配種或進(jìn)行人工授精→對胚胎的收集、檢查、培養(yǎng)或保存→胚胎移植→移植后的檢查。 18．胚胎移植過程中兩次使用激素，第一次用孕激素對供、受體進(jìn)行同期發(fā)情處理，第二次用促性腺激素對供體進(jìn)行超數(shù)排卵處理。 19．生態(tài)工程建設(shè)的目的是遵循自然界物質(zhì)循環(huán)的規(guī)律，充分發(fā)揮資源的生產(chǎn)潛力，防止環(huán)境污染，達(dá)到經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益的同步發(fā)展。 20．生態(tài)工程所遵循的基本原理有物質(zhì)循環(huán)再生原理、物種多樣性原理、協(xié)調(diào)與平衡原理、整體性原理及系統(tǒng)學(xué)和工程學(xué)原理。 [澄清——思維誤區(qū)] 關(guān)注點(diǎn)1　對基因工程中的“載體”與細(xì)胞膜上的“載體”區(qū)分不清 [澄清]　基因工程中的載體是DNA分子，其功能是攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞；細(xì)胞膜上的載體是蛋白質(zhì)，其功能是協(xié)助某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。 關(guān)注點(diǎn)2　誤認(rèn)為限制酶是一種酶 [澄清]　限制酶是一類酶，而不是一種酶。 關(guān)注點(diǎn)3　誤認(rèn)為啟動子是起始密碼子(RNA)，終止子是終止密碼子(RNA) [澄清]　啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(信使RNA上的三個相鄰堿基)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(信使RNA上的三個相鄰堿基)。 關(guān)注點(diǎn)4　對蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)與基因工程的實(shí)質(zhì)認(rèn)識不清 [澄清]　蛋白質(zhì)工程是定向改造或生產(chǎn)人類所需蛋白質(zhì)(可以為自然界中不存在的蛋白質(zhì))，而基因工程是定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品(一般生產(chǎn)自然界中已存在的蛋白質(zhì))。 關(guān)注點(diǎn)5　誤認(rèn)為植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個體屬于有性生殖 [澄清]　植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個體不屬于有性生殖，而屬于無性繁殖，細(xì)胞分裂方式為有絲分裂，包括脫分化和再分化兩個階段。 關(guān)注點(diǎn)6　誤認(rèn)為獲取細(xì)胞產(chǎn)品與人工種子的時期相同 [澄清]　獲取細(xì)胞產(chǎn)品的時期應(yīng)為脫分化之后再分化之前的愈傷組織，而制作人工種子需要在再分化后形成的胚狀體階段。 關(guān)注點(diǎn)7　對植物組織培養(yǎng)與動物細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別不明 [澄清]　(1)植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)都存在細(xì)胞的培養(yǎng)過程，但植物細(xì)胞可以先分裂再分化，而動物細(xì)胞只分裂不分化。 (2)植物組織培養(yǎng)可以培養(yǎng)成新個體，動物細(xì)胞培養(yǎng)只能培養(yǎng)出一團(tuán)細(xì)胞，不能培養(yǎng)成一個新個體。 關(guān)注點(diǎn)8　對受精標(biāo)志與受精完成的標(biāo)志認(rèn)識不清 [澄清]　(1)卵子是否受精的標(biāo)志是第二極體的形成(即在透明帶和卵細(xì)胞膜間隙觀察到兩個極體)。 (2)受精完成的標(biāo)志是雌雄原核融合成含二倍染色體的合子。 關(guān)注點(diǎn)9　誤認(rèn)為胚胎發(fā)育的過程中，細(xì)胞的全能性完全相同 [澄清]　胚胎發(fā)育的過程中，細(xì)胞的全能性并非完全相同，桑椹胚階段的細(xì)胞具有全能性，囊胚是開始分化的階段，原腸胚時期已出現(xiàn)高度分化。隨著個體的發(fā)育，細(xì)胞的全能性越來越低。 關(guān)注點(diǎn)10　對胚胎移植中的“同種”認(rèn)識不清 [澄清]　同種動物之間進(jìn)行胚胎移植易成功。這里的“同種”是指“同一物種”。 關(guān)注點(diǎn)11　誤認(rèn)為胚胎分割是有性生殖 [澄清]　胚胎是由受精卵形成的，屬于有性生殖； 胚胎分割技術(shù)屬于無性生殖，也屬于克隆。 關(guān)注點(diǎn)12　認(rèn)為不同的生態(tài)工程所依據(jù)的原理相同 [澄清]　建立不同的生態(tài)工程時要依據(jù)不同的原理，因地制宜，不能相互照搬。 關(guān)注點(diǎn)13　誤認(rèn)為實(shí)現(xiàn)生態(tài)經(jīng)濟(jì)有時可以不遵循生態(tài)學(xué)的基本原理 [澄清]　實(shí)現(xiàn)生態(tài)經(jīng)濟(jì)一定要遵循生態(tài)學(xué)的基本原理，如果違背這些原理，就會使生態(tài)系統(tǒng)偏離穩(wěn)態(tài)，甚至導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)崩潰。 關(guān)注點(diǎn)14　誤認(rèn)為污染物是不能利用的資源 [澄清]　對環(huán)境造成危害的污染物，采取一定的措施和技術(shù)，就能夠進(jìn)行回收和循環(huán)利用，這樣不但能夠減少環(huán)境污染，而且能提高資源的利用率，減少資源的浪費(fèi)。 關(guān)注點(diǎn)15　誤認(rèn)為提高能量利用率＝提高能量傳遞效率 [澄清]　提高能量的利用率，可通過縮短食物鏈和能量的多級利用來實(shí)現(xiàn)。提高能量的傳遞效率，需通過提高下一營養(yǎng)級的同化量來實(shí)現(xiàn)。 2個主攻點(diǎn)之(一)　基因工程和克隆技術(shù) 一、基因工程 1．基因工程的基本工具(填圖) 2．基因工程的基本操作程序(填空) (1)目的基因的獲取途徑： 方法 具體操作 直接 分離 從自然界已有的物種中分離，如從基因文庫中獲取 人 工 合 成 化學(xué) 方法 已知核苷酸序列的較小基因，直接利用DNA合成儀用化學(xué)方法合成，不需要模板 逆轉(zhuǎn) 錄法 以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下人工合成 PCR 技術(shù) 擴(kuò)增 ①原理：DNA復(fù)制 ②條件：模板DNA、引物、脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 (2)基因表達(dá)載體——重組質(zhì)粒的構(gòu)建： ①表達(dá)載體的組成：目的基因＋啟動子＋終止子＋標(biāo)記基因＋復(fù)制原點(diǎn)。 ②啟動子和終止子：啟動子是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，啟動轉(zhuǎn)錄；終止子是終止轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。 (3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞： 植物細(xì)胞 動物細(xì)胞 微生物細(xì)胞 常用 方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法 顯微注射技術(shù) Ca2＋處理法 受體 細(xì)胞 受精卵、體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 (4)目的基因的檢測與鑒定： ①導(dǎo)入檢測：DNA分子雜交技術(shù)(使用DNA探針)。 ②表達(dá)檢測 ③個體生物學(xué)水平鑒定，如對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行抗蟲或抗病等接種實(shí)驗。 3．蛋白質(zhì)工程(填空) 二、克隆技術(shù) 1．植物組織培養(yǎng)技術(shù)(填圖) 2．動物細(xì)胞培養(yǎng)(填圖) 3．動物體細(xì)胞克隆技術(shù)(填圖) 4．動物細(xì)胞融合與單克隆抗體(填圖) 考向(一)　基因工程的操作工具、原理及過程 [真題導(dǎo)向] 1．(2014江蘇高考，多選)下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，錯誤的是(　　) A．切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均特異性地識別6個核苷酸序列 B．PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng) C．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因 D．抗蟲基因即使成功地插入到植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá) 解析：選ABC　限制性核酸內(nèi)切酶大多特異性識別6個核苷酸序列，但并非都只識別6個核苷酸序列；PCR中耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用；載體質(zhì)粒上抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇，而不是抗生素合成基因；目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不一定都能正常表達(dá)。 2．(2017江蘇高考)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過程示意圖如下，請回答下列問題： (1)從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過________獲得________用于PCR擴(kuò)增。 (2)設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳_______________位點(diǎn)。設(shè)計引物時需要避免引物之間形成________________，而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴(kuò)增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破壞________________的堿基配對。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有________(填序號：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O(shè)計引物)。 解析：(1)PCR技術(shù)可在體外對DNA進(jìn)行擴(kuò)增，模板可以是mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。(2)設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對的引物(引物1和引物2)時，需在引物中增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶的識別序列，便于目的基因與質(zhì)粒的連接。為了避免引物自連，設(shè)計引物時需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對。(3)根據(jù)PCR的過程可知，圖中步驟1為變性，步驟2為退火(復(fù)性)，步驟3為延伸，這三個步驟構(gòu)成一個循環(huán)。(4)退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，過高的退火溫度會破壞引物與模板的堿基配對。因G、C之間的氫鍵數(shù)多于A、T之間的氫鍵數(shù)，故GC含量高的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。(5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能的原因是退火溫度過高使擴(kuò)增效率降低，也可能是未按照目的基因兩端的核苷酸序列來設(shè)計引物，因此可以采取的措施是降低退火溫度、重新設(shè)計引物等。 答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄　cDNA　(2)限制性核酸內(nèi)切酶　堿基互補(bǔ)配對　(3)變性　(4)引物與模板　GC含量高 (5)②③ 　 (1)原理：利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。 (2)條件及作用： 條件 作用 在一定的緩沖液中進(jìn)行 提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境 四種脫氧核苷酸 作為合成DNA子鏈的原料 DNA母鏈 作為DNA復(fù)制的模板 Taq DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸 溫度 控制 90～95 ℃ 變性：使DNA片段雙鏈解開 55～60 ℃ 復(fù)性：使解開的兩條DNA單鏈分別與相應(yīng)的引物結(jié)合 70～75 ℃ 延伸：Taq DNA聚合酶催化子鏈合成 (3)解題規(guī)律總結(jié)： ①模型圖示： ②規(guī)律總結(jié)： 循環(huán)數(shù) 第一輪 第二輪 第三輪 第n輪 DNA分子數(shù) 2 4 8 2n 含引物的DNA分子數(shù) 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1 同時含引物A、B的DNA分子數(shù) 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物數(shù)量 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n＋1－2 含與脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數(shù) 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n DNA分子種類 2 4 5 5 3．(2016江蘇高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請回答下列問題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識別序 列及切 割位點(diǎn) 圖1 圖2 (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用__________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中_________________________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________________________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 解析：(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因時，應(yīng)保留目的基因和至少一個標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)的完整性，即遵循“目的基因切兩側(cè)，標(biāo)記基因留一個”的基本原則，最好選擇切割產(chǎn)生不同末端的兩種限制酶同時切割質(zhì)粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來的不正常表達(dá)，因此據(jù)圖分析應(yīng)選擇的限制酶為BclⅠ和HindⅢ，切割后質(zhì)粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標(biāo)記基因。酶切后的載體和目的基因通過DNA連接酶的作用形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒需要導(dǎo)入Ca2＋處理后的處于感受態(tài)的大腸桿菌(處于感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性大大增加，便于重組質(zhì)粒進(jìn)入)。(2)由上述分析可知，為了篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)先配制含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基，平板上長出的菌落為導(dǎo)入普通質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的大腸桿菌菌落，進(jìn)一步鑒定出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可利用PCR擴(kuò)增的方式,結(jié)合電泳技術(shù)來分析處理。DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?在PCR過程中，當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后,DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈,因此應(yīng)選擇引物甲和引物丙。(3)因為BclⅠ和BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端相同,所以可以被DNA連接酶連接,連接部位的6個堿基對序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的識別序列，連接部位不能被這兩種酶切開。(4)由圖可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識別并切割，因此圖中質(zhì)粒上存在3個Sau3A Ⅰ的切割位點(diǎn)，若將3個切割位點(diǎn)之間的DNA片段分別編號為a、b和c，則完全酶切(3個切割位點(diǎn)均被切割)會產(chǎn)生3種大小的DNA片段，即為a、b和c；考慮只切1個切割位點(diǎn)，有三種情況，都產(chǎn)生一種大小的DNA片段，即大小均為a＋b＋c；考慮切2個切割位點(diǎn)，則會產(chǎn)生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3AⅠ識別并切割圖中質(zhì)粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。 答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受　(2)四環(huán)素　引物甲和引物丙　 (3) 都不能　(4)7 　 (1)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。限制酶是一類酶，不是一種酶。限制酶的化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。 (2)在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個末端。 (3)限制酶和DNA連接酶的作用部位都是脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵(不是氫鍵), 只是一個切開，一個連接。限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。 (4)限制酶切割位點(diǎn)所處的位置必須是在所需的標(biāo)記基因之外，這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性，有利于對目的基因的檢測。 (5)為使目的基因與載體形成相同的DNA片段末端連接，通常使用同一種限制酶將二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所產(chǎn)生的末端也存在互補(bǔ)關(guān)系時，則兩末端也可連接。用兩種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。 [過關(guān)練習(xí)] 1.將經(jīng)過擴(kuò)增的DNA和質(zhì)粒用相同的限制酶進(jìn)行如右圖所示的切割，電泳得到純凈的B片段和D片段，將兩種片段置于適宜的緩沖液中用DNA連接酶處理。如果只考慮兩個片段的環(huán)狀連接，則能形成不同核苷酸序列的環(huán)狀DNA的種類是(　　) A．6種　　　　　　　　 B．3種 C．2種 D．1種 解析：選A　只考慮兩個片段的環(huán)狀連接，能形成的環(huán)狀DNA有B片段與B片段同向連接的、B片段與B片段反向連接的、D片段與D片段同向連接的、D片段與D片段反向連接的、B片段與D片段同向連接的及B片段與D片段反向連接的，共6種。 2．(2018徐州模擬)下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述，正確的是(　　) A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同 B．PCR反應(yīng)中周期性的溫度設(shè)置是特定的，與擴(kuò)增的目的基因和引物無關(guān) C．在構(gòu)建基因表達(dá)載體時通常需要大量的目的基因和載體 D．質(zhì)粒上的目的基因都必須整合到受體細(xì)胞的DNA上才能表達(dá) 解析：選C　不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同；PCR反應(yīng)中周期性的溫度可在一定范圍內(nèi)設(shè)置，不是特定的；在構(gòu)建基因表達(dá)載體時通常需要大量的目的基因和載體，這樣獲得基因表達(dá)載體的概率更 高；質(zhì)粒本身是DNA，也能自我復(fù)制，所以進(jìn)入受體細(xì)胞以后，既可以自己進(jìn)行表達(dá)，也可以整合到受體細(xì)胞的DNA上并表達(dá)。 3．下圖為綠色熒光小鼠制備流程圖，Gfp是綠色熒光蛋白基因。請據(jù)圖回答問題： (1)據(jù)圖分析可推知，載體上的Neo為________基因，其表達(dá)產(chǎn)物可與________發(fā)揮作用而最終將____________的胚胎干細(xì)胞篩選出來。 (2)完成過程①需要的工具酶是____________，完成過程②常用的方法是___________，完成過程⑤后，胚胎干細(xì)胞應(yīng)與囊胚中的________部位相結(jié)合。 (3)進(jìn)行過程⑥之前，要對代孕母鼠用某種激素處理，目的是_____________________。 (4)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)裝置應(yīng)置于________________的氣體環(huán)境中，以保證培養(yǎng)環(huán)境pH的相對穩(wěn)定。 解析：(1)根據(jù)題意知，Gfp是目的基因，所以載體上的Neo為標(biāo)記基因。根據(jù)題圖可知，其表達(dá)產(chǎn)物可與G418發(fā)揮作用而最終將導(dǎo)入目的基因的胚胎干細(xì)胞篩選出來。(2)完成過程①需要的工具酶是DNA連接酶，完成過程②常用的方法是顯微注射法，完成過程⑤后，胚胎干細(xì)胞應(yīng)與囊胚中的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)部位相結(jié)合。(3)過程⑥是胚胎移植，進(jìn)行胚胎移植之前，要對代孕母鼠進(jìn)行同期發(fā)情處理。(4)細(xì)胞培養(yǎng)液中通入含5%的CO2的空氣可以保證培養(yǎng)環(huán)境pH的相對穩(wěn)定。 答案：(1)標(biāo)記　G418　導(dǎo)入目的基因　(2)DNA連接酶 顯微注射法　內(nèi)細(xì)胞團(tuán)　(3)使其同期發(fā)情　(4)含一定量(5%)的CO2 考向(二)　綜合考查基因工程的應(yīng)用 [真題導(dǎo)向] 1．(2018江蘇高考)為生產(chǎn)具有特定性能的α淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656個堿基對)，利用基因工程大量制備α淀粉酶，實(shí)驗流程見下圖。請回答下列問題： (1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的________________。 (2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的________端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是_______________ ________________________________________________________________________。 (3)進(jìn)行擴(kuò)增時，反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。(填序號) ①變性溫度?、谕嘶饻囟取、垩由鞙囟取、茏冃詴r間?、萃嘶饡r間?、扪由鞎r間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列： 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測虛線框后的第一個密碼子最多有________種。 (5)獲得工程菌表達(dá)的α淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結(jié)果如下： 緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4KH2PO4 50 mmol/L TrisHCl 50 mmol/L GlyNaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對 活性(%) 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實(shí)驗結(jié)果，初步判斷該α淀粉酶活性最高的條件為________________________ ___________________________________________________。 解析：(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α淀粉酶基因前，需先獲得細(xì)菌的基因組DNA作為模板，并依據(jù)α淀粉酶基因兩端的部分核苷酸序列合成兩條引物。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時，只能從3′端延伸DNA子鏈，為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′端加上限制性酶切位點(diǎn)，并且要注意在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，這樣既能防止目的基因、載體的自身連接，又能確保目的基因與表達(dá)載體的定向連接。(3)PCR技術(shù)包括變性、退火(復(fù)性)和延伸三步，變性溫度決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的解鏈，且時間很短；退火時引物結(jié)合到互補(bǔ)的DNA單鏈上，退火溫度由引物復(fù)性溫度決定，其溫度設(shè)定與引物的長度、堿基組成及濃度等有關(guān)；延伸時間與產(chǎn)物片段的長度有關(guān)，產(chǎn)物在1 kb以內(nèi)的延伸時間為1 min左右，3～4 kb的延伸時間為3～4 min。(4)圖中虛線框內(nèi)共含有24個堿基，mRNA上3個相鄰的堿基編碼1個氨基酸，故共包含8個密碼子。虛線框后的第1個密碼子的第1個堿基是U，第2和第3個堿基各有4種可能性，因此共有16種可能性。題干表明控制α淀粉酶的基因有1 656個堿基對，說明圖中虛線框后的第一個密碼子肯定不是終止密碼子(3種終止密碼子為UAA、UAG、UGA)，故虛線框后第一個密碼子實(shí)際最多有16－3＝13(種)可能性。(5)分析表格中的數(shù)據(jù)，酶相對活性最高為99.5%，對應(yīng)的條件是pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl。 答案：(1)基因組DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連　(3)②?、蕖?4)8　13 (5)pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L TrisHCl 2．(2015江蘇高考)胰島素A、B鏈分別表達(dá)法是生產(chǎn)胰島素的方法之一。下圖1是該方法所用的基因表達(dá)載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程(融合蛋白A、B分別表示β半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白)。請回答下列問題： (1)圖1基因表達(dá)載體中沒有標(biāo)注出來的基本結(jié)構(gòu)是________。 (2)圖1中啟動子是________酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達(dá)；氨芐青霉素抗性基因的作用是_____________________________________________________。 (3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時必需的工具酶有____________________。 (4)β半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達(dá)，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部，其意義在于________________________________________________________。 (5)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β半乳糖苷酶被切成多個肽段，這是因為_________________________ _____________________________________________________________________________。 (6)根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu)，請推測每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量。你的推測結(jié)果是________，理由是______________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)基因表達(dá)載體中應(yīng)具有啟動子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。(2)啟動子是轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達(dá)。圖中的氨芐青霉素抗性基因充當(dāng)了標(biāo)記基因，可用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時，需要用同種限制酶分別切割目的基因和載體，然后用DNA連接酶將目的基因和載體連接。(4)胰島素肽鏈上具有蛋白酶的切割位點(diǎn)，會導(dǎo)致胰島素被菌體內(nèi)的蛋白酶降解，而通過融合表達(dá)將切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部可防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)的蛋白酶降解。(5)根據(jù)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，并結(jié)合β半乳糖苷酶被切成多個肽段，獲得了完整的胰島素A鏈、B鏈這一信息，可以推測β半乳糖苷酶中必然含有多個甲硫氨酸，胰島素A鏈、B鏈不含甲硫氨酸。(6)每一條肽鏈的兩個末端分別含有一個氨基和一個羧基，某些氨基酸的R基中也含有氨基，因此含兩條肽鏈的胰島素中至少含有2個游離的氨基。 答案：(1)終止子　(2)RNA聚合　作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來　(3)限制酶和DNA連接酶　(4)防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解　(5)β半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸　(6)至少2個　兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸R基團(tuán)中可能還含有游離的氨基 　 (1)基因工程操作過程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)沒有堿基互補(bǔ)配對現(xiàn)象。 (2)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的，基因表達(dá)需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動子與終止子之間的部位。 (3)植物細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)成為完整植物體，因此受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞；動物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。 (4)基因表達(dá)載體中，啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(信使RNA上的三個相鄰堿基)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(信使RNA上的三個相鄰堿基)。 (5)基因表達(dá)載體的構(gòu)建是最核心的一步，在體外進(jìn)行。個體水平上的檢測和鑒定是衡量基因工程操作是否成功的最簡單最有效的方法。 [過關(guān)練習(xí)] 1．甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)DNA后，利用________技術(shù)擴(kuò)增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達(dá)時不能合成完整長度的________，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。設(shè)計合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結(jié)合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。提取宿主細(xì)胞的________進(jìn)行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達(dá)上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，并在補(bǔ)加__________的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，則該宿主細(xì)胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。 A．病毒的DNA聚合酶　 B．宿主的DNA聚合酶 C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶 解析：(1)體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增采用的技術(shù)手段是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))。將基因內(nèi)個別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后，在翻譯時終止密碼子提前出現(xiàn)，不能合成完整長度的多肽(或蛋白質(zhì))。(2)為了使目的基因能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并正常表達(dá)，需要將目的基因與載體(運(yùn)載體)連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞。利用分子雜交技術(shù)，鑒定篩選獲得成功表達(dá)目的RNA的細(xì)胞時，需提取宿主細(xì)胞的總RNA。(3)將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)由于沒有Uaa，翻譯將會在終止密碼子處停止，將不能翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻譯出完整蛋白，需要在培養(yǎng)基中加入Uaa。轉(zhuǎn)錄時，識別啟動子的酶為RNA聚合酶，因為轉(zhuǎn)錄在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，所以轉(zhuǎn)錄用的酶為宿主細(xì)胞的RNA聚合酶。 答案：(1)PCR　多肽(或蛋白質(zhì))　(2)載體　總RNA (3)非天然氨基酸(Uaa)　D 2．(2019屆高三常州四校調(diào)研)如圖為利用奶牛的乳汁生產(chǎn)胰島素的流程圖?；卮鹣铝袉栴}： (1)質(zhì)粒載體的基本組成單位是________________，質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的條件有__________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。而作為基因表達(dá)載體，除了滿足上述基本條件外，還需要具有啟動子和終止子。 (2)據(jù)圖分折，最好選用________________(填限制酶名稱)分別切割含目的基因的DNA分子和質(zhì)粒分子。當(dāng)胰島素基因和質(zhì)粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是__________________。 (3)要使胰島素基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過質(zhì)粒載體，而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是____________________________________________________。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受精卵的方法是______________；經(jīng)檢測，胰島素基因已導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因組中，但轉(zhuǎn)基因奶牛通過乳腺生物反應(yīng)器未生產(chǎn)出胰島素，根據(jù)中心法則分析，其原因可能是________________________________________________________________________。 (4)通過乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)胰島素，需提前對形成的受精卵進(jìn)行篩選，保留含性染色體組成為___________(填“XX”或“XY”)的類型。 解析：(1)質(zhì)粒載體是小型環(huán)狀DNA，其基本組成單位是脫氧核苷酸，質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的條件有具有自我復(fù)制的能力、有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)、含有標(biāo)記基因。作為基因表達(dá)載體，除了滿足上述基本條件外，還需要具有啟動子和終止子。(2)據(jù)圖分折，最好選用SmaⅠ、PstⅠ分別切割含目的基因的DNA分子和質(zhì)粒分子。當(dāng)胰島素基因和質(zhì)粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。(3)要使胰島素基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過質(zhì)粒載體，而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是目的基因無復(fù)制原點(diǎn)，無表達(dá)所需的啟動子。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受精卵的方法是顯微注射法；經(jīng)檢測，胰島素基因已導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因組中，但轉(zhuǎn)基因奶牛通過乳腺生物反應(yīng)器未生產(chǎn)出胰島素，根據(jù)中心法則分析,其原因可能是胰島素基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常。(4)通過乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)胰島素，需提前對形成的受精卵進(jìn)行篩選，要選雌性的受精卵，故保留含性染色體組成為XX的類型。 答案：(1)脫氧核苷酸　具有自我復(fù)制的能力、有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)、含有標(biāo)記基因　(2)SmaⅠ、PstⅠ　磷酸二酯鍵　(3)目的基因無復(fù)制原點(diǎn)和無表達(dá)所需的啟動子　顯微注射法　(目的基因的)轉(zhuǎn)錄或翻譯異?！?4)XX 考向(三)　克隆技術(shù)及應(yīng)用 [真題導(dǎo)向] 1．(2018江蘇高考)花藥離體培養(yǎng)是重要的育種手段。下圖是某二倍體植物花藥育種過程的示意圖，下列敘述正確的是(　　) A．為了防止微生物污染，過程①所用的花藥需在70%乙醇中浸泡30 min B．過程②的培養(yǎng)基中需添加較高濃度的細(xì)胞分裂素以利于根的分化 C．過程③逐步分化的植株中可篩選獲得純合的二倍體 D．過程④應(yīng)將煉苗后的植株移栽到含有蔗糖和多種植物激素的基質(zhì)上 解析：選C　通常將花藥用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30 s，立即取出，在無菌水中清洗；過程②為脫分化形成愈傷組織的過程，所用培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素的比例應(yīng)適中；過程③為再分化，因用秋水仙素處理了由花藥形成的愈傷組織細(xì)胞，故能篩選獲得純合的二倍體；過程④應(yīng)將煉苗后的植株移栽到土壤中。 2.(2018江蘇高考，多選)如圖為細(xì)胞融合的示意圖，下列敘述正確的是(　　) A．若a細(xì)胞和b細(xì)胞是植物細(xì)胞，需先去分化再誘導(dǎo)融合 B．a(chǎn)細(xì)胞和b細(xì)胞之間的融合需要促融處理后才能實(shí)現(xiàn) C．c細(xì)胞的形成與a、b細(xì)胞膜的流動性都有關(guān) D．c細(xì)胞將同時表達(dá)a細(xì)胞和b細(xì)胞中的所有基因 解析：選BC　若a細(xì)胞和b細(xì)胞是植物細(xì)胞，應(yīng)先用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁，然后再誘導(dǎo)融合；a細(xì)胞和b細(xì)胞之間的融合需要借助物理、化學(xué)等方法處理后才能實(shí)現(xiàn)；細(xì)胞的融合與細(xì)胞膜的流動性有關(guān)；融合后的c細(xì)胞中的基因進(jìn)行選擇性表達(dá)，只能表達(dá)a、b兩細(xì)胞的部分基因。 3．(2014江蘇高考)為了獲得植物次生代謝產(chǎn)物，先用植物外植體獲得愈傷組織，然后在液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。 請回答下列問題： (1)外植體經(jīng)誘導(dǎo)后形成愈傷組織的過程稱為___________________________________。 (2)在愈傷組織懸浮培養(yǎng)時，細(xì)胞干重、蔗糖濃度和pH的變化如上圖所示。細(xì)胞干重在12 d后下降的原因有_________________________；培養(yǎng)液中蔗糖的作用是_____________、______________。 (3)多倍體愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物量常高于二倍體。二倍體愈傷組織細(xì)胞經(jīng)______________處理，會產(chǎn)生染色體加倍的細(xì)胞。為檢測愈傷組織細(xì)胞染色體數(shù)目，壓片前常用纖維素酶和________酶解離愈傷組織。若愈傷組織細(xì)胞(2n)經(jīng)誘導(dǎo)處理后，觀察到染色體數(shù)為8n的細(xì)胞，合理的解釋是______________________________________________、 ____________________________。 (4)為了更好地獲得次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)中采用植物細(xì)胞的固定化技術(shù)，其原理與酵母細(xì)胞固定化類似。 下列說法正確的有____________(填序號)。 ①選取旺盛生長的愈傷組織細(xì)胞包埋 ②必須在光照條件下培養(yǎng) ③培養(yǎng)過程中需通空氣 ④固定化后植物細(xì)胞生長會變慢 解析：(1)外植體是植物體離體的組織、器官或細(xì)胞，誘導(dǎo)形成愈傷組織的過程稱為脫分化。(2)在培養(yǎng)過程中，蔗糖除為細(xì)胞提供能源，還具有調(diào)節(jié)滲透壓的作用。隨著蔗糖的消耗，營養(yǎng)供應(yīng)減少，同時，細(xì)胞代謝產(chǎn)物、廢物增加，使pH降低(偏酸)，不利于細(xì)胞生長。(3)秋水仙素或低溫處理都可誘導(dǎo)細(xì)胞染色體數(shù)目加倍。纖維素酶和果膠酶處理細(xì)胞壁，可以使細(xì)胞之間易于分離(解離)。(4)獲得植物次生代謝產(chǎn)物應(yīng)選用生長旺盛的愈傷組織；愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸，故需要通氣；愈傷組織沒有葉綠體，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的過程不需要光照；固定化細(xì)胞所用包埋材料會影響營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的擴(kuò)散，使固定化后的植物細(xì)胞生長速度變慢。 答案：(1)脫分化　(2)蔗糖濃度下降，pH降低　提供能源　調(diào)節(jié)滲透壓　(3)秋水仙素(低溫)　果膠　經(jīng)加倍到4n的細(xì)胞處于有絲分裂后期　經(jīng)加倍到8n的細(xì)胞處于有絲分裂中期　(4)①③④ (1)植物細(xì)胞A和植物細(xì)胞B雜交獲得的雜種細(xì)胞的類型有三種：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要進(jìn)行篩選。 (2)雜種細(xì)胞形成的標(biāo)志：生成新的細(xì)胞壁。 (3)雜種植株遺傳物質(zhì)的變化：雜種植株的變異類型屬于染色體變異，雜種植株的染色體數(shù)通常是兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目之和，雜種植株屬于異源多倍體。 (4)植物組織培養(yǎng)時植物激素和光照的使用： ①植物激素的使用：脫分化階段先使用生長素，后使用細(xì)胞分裂素，以促進(jìn)細(xì)胞的分裂；再分化階段需要調(diào)節(jié)生長素與細(xì)胞分裂素的比例，當(dāng)生長素比例低時，利于芽的形成，生長素比例較高時，可促進(jìn)根的形成。 ②光照的使用：脫分化階段不需要給予光照，再分化階段需要給予光照，以利于葉綠素的形成。 (5)利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)物時，有時只需將外植體培養(yǎng)到愈傷組織，從愈傷組織中獲取產(chǎn)物。 [過關(guān)練習(xí)] 1．下列有關(guān)細(xì)胞工程的敘述，正確的是(　　) A．PEG是促細(xì)胞融合劑，可直接誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合 B．用原生質(zhì)體制備人工種子，要防止細(xì)胞破裂 C．骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)免疫處理，可直接獲得單克隆抗體 D．核移植克隆的動物，其線粒體DNA來自供卵母體 解析：選D　PEG是促細(xì)胞融合劑，能誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合，融合前需先用酶解法去除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁；制備人工種子應(yīng)該用組織培養(yǎng)形成的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，而不是原生質(zhì)體；單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，骨髓瘤細(xì)胞不能分泌抗體；利用核移植技術(shù)克隆動物時，是將體細(xì)胞的細(xì)胞核移入去除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，所以克隆動物的線粒體DNA來自供卵母體。 2．設(shè)計植物體細(xì)胞雜交實(shí)驗時，如果期望獲得性狀優(yōu)良的作物新品種，通常不需要考慮的是(　　) A．選擇具有優(yōu)良性狀的親本 B．選擇能去除細(xì)胞壁的酶 C．親本間的生殖隔離 D．培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的濃度及比例 解析：選C　設(shè)計植物體細(xì)胞雜交的目的是期望獲得性狀優(yōu)良的作物新品種，所以需要選擇具有優(yōu)良性狀的親本；由于細(xì)胞壁的存在會阻礙細(xì)胞的融合，所以要用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁；由于植物體細(xì)胞雜交可以打破物種間的界限，故不需要考慮親本間的生殖隔離；培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的濃度及比例會影響細(xì)胞的脫分化和再分化。 3．胰島B細(xì)胞移植是一種有效治療糖尿病的方法。利用小鼠再生胰腺提取物(RPE) 可定向誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)分化成胰島B細(xì)胞。請回答下列問題： (1)取人羊膜組織刮除血塊、上皮細(xì)胞，沖洗后剪碎，然后用________________酶處理，最終制成hAMSCs 懸液。將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長到一定階段時，出現(xiàn)________________現(xiàn)象，此時細(xì)胞停止分裂增殖，這時需要將細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)處理，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 (2)取傳至第 3 代的hAMSCs放入細(xì)胞培養(yǎng)板，同時加入RPE 進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。該代hAMSCs 能保持細(xì)胞正常的________________。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)15天后，提取細(xì)胞的______________，用胰島素基因探針進(jìn)行分子雜交，可初步檢測 hAMSCs 是否分化成胰島 B 細(xì)胞。(3)用人的雜交瘤細(xì)胞來生產(chǎn)人源單克隆抗體難以成功，因此單克隆抗體大都來自鼠源。但鼠源單抗在人體內(nèi)使用時，會產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫原性，為解決這一問題，發(fā)明了嵌合抗體，大致過程如圖所示： 嵌合抗體能降低鼠源抗體的免疫原性，從圖中可以推測，免疫原性的產(chǎn)生主要與抗體的________(填“V區(qū)”或“C區(qū)”)有關(guān)，嵌合抗體的生產(chǎn)屬于_______________工程范疇。 解析：(1)用胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)處理人羊膜組織，可制成hAMSCs懸液。將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長到一定階段時，會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。(2)10代以內(nèi)的細(xì)胞可以保持正常的二倍體核型，因此傳至第 3 代的hAMSCs能保持細(xì)胞正常的(二倍體)核型。細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì)是基因的選擇性表達(dá)，因此要檢測 hAMSCs 是否分化成胰島 B 細(xì)胞，可提取細(xì)胞的RNA(或mRNA)，用胰島素基因探針進(jìn)行分子雜交。(3)從圖中可以推測，免疫原性的產(chǎn)生主要與抗體的C區(qū)有關(guān)。嵌合抗體的生產(chǎn)屬于蛋白質(zhì)工程范疇。 答案：(1)胰蛋白(或膠原蛋白)　接觸抑制　(2)(二倍體)核型　RNA　(3)C區(qū)　蛋白質(zhì)　 一、選擇題 1．(2019屆高三南京六校聯(lián)考)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分別降解一個1 000 bp(1 bp即1個堿基對)的DNA分子， 對降解產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳，在電場的作用下，降解產(chǎn)物分開，凝膠電泳結(jié)果如圖所示。該DNA分子的酶切圖譜(單位：bp)正確的是(　　) 解析：選C　根據(jù)電泳圖可知KpnⅠ 切割只得到1種DNA片段，判斷該DNA分子是環(huán)狀，且該DNA分子上只有1個KpnⅠ 切點(diǎn)。EcoRⅠ 切割得到2種DNA片段，說明該DNA分子上有兩個EcoRⅠ 切點(diǎn)。據(jù)此分析選項中的酶切圖譜，只有C項符合。 2．中華鱘是地球上最古老的脊椎動物，被稱為“活化石”。研究者試圖通過蛋白質(zhì)工程改造中華鱘體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)，使其更加適應(yīng)現(xiàn)在的水域環(huán)境。下列說法錯誤的是(　　) A．該工程可以定向改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu) B．改造蛋白質(zhì)是通過改造基因結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的 C．改造后的中華鱘和現(xiàn)有中華鱘仍是同一物種 D．改造后的中華鱘的后代不具有改造的蛋白質(zhì) 解析：選D　蛋白質(zhì)工程通過對基因進(jìn)行人工合成或修飾，最終定向改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)；改造后的中華鱘遺傳物質(zhì)變化不大，和現(xiàn)有中華鱘不存在生殖隔離，仍是同一物種；改造后的中華鱘含有控制新蛋白質(zhì)合成的基因，所以后代具有改造的蛋白質(zhì)。 3．(2018江蘇六市二模)農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒是植物基因工程中常用的運(yùn)載體，下列相關(guān)敘述正確的是(　　) A．Ti質(zhì)粒是能夠自主復(fù)制的單鏈DNA B．Ti質(zhì)粒中磷酸基團(tuán)都與兩個脫氧核糖相連接 C．重組Ti質(zhì)粒的受體細(xì)胞只能是植物愈傷組織細(xì)胞 D．Ti質(zhì)粒上的基因可全部整合到受體細(xì)胞染色體上 解析：選B　Ti質(zhì)粒是能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子，其分子內(nèi)部的磷酸基團(tuán)都與兩個脫氧核糖相連接。重組Ti質(zhì)粒的受體細(xì)胞可以是植物愈傷組織細(xì)胞，也可以是其他的植物細(xì)胞，如植物的受精卵細(xì)胞。農(nóng)桿菌有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒上有一段TDNA，目的基因需插入Ti質(zhì)粒上的TDNA中形成重組質(zhì)粒載體，再導(dǎo)入農(nóng)桿菌，然后讓含重組質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌侵染植物，只有Ti質(zhì)粒上的TDNA片段(內(nèi)有目的基因)而不是Ti質(zhì)粒上的全部基因整合到受體細(xì)胞染色體上。 4．下列關(guān)于人胰島素基因表達(dá)載體的敘述，正確的是(　　) A．表達(dá)載體中的胰島素基因可通過人肝細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得 B．表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均始于復(fù)制原(起)點(diǎn) C．借助抗生素抗性基因可以將含胰島素基因的受體細(xì)胞篩選出來 D．表達(dá)載體中的啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用 解析：選C　 胰島素基因在人體肝細(xì)胞中不表達(dá)，所以從肝細(xì)胞中不能提取到胰島素基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA；基因的表達(dá)始于啟動子，基因的復(fù)制始于復(fù)制原點(diǎn)；抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，可以將含胰島素基因的受體細(xì)胞篩選出來；啟動子是轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)，終止密碼子是翻譯的終點(diǎn)。 5．下列關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)的敘述，正確的是(　　) A．動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往使用液體培養(yǎng)基 B．動物細(xì)胞培養(yǎng)的目的是為了培養(yǎng)動物個體 C．在培養(yǎng)過程中通常要通入5%的CO2刺激細(xì)胞呼吸 D．動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中可用胃蛋白酶將動物組織分散成單個細(xì)胞 解析：選A　動物細(xì)胞培養(yǎng)的目的是為了獲得細(xì)胞群或細(xì)胞產(chǎn)物；動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中通常要通入5%的CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH；動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中用胰蛋白酶或膠原蛋白酶將動物組織分散成單個細(xì)胞。 6．植物細(xì)胞工程作為一門新興的生物技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于社會生產(chǎn)，下列說法錯誤的是(　　) A．人工種子是用人工薄膜為種皮包被植物愈傷組織形成的 B．植物微型繁殖運(yùn)用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可快速繁殖良種植物 C．作物脫毒常選取植物的莖尖，因為該處病毒較少或無病毒 D．植物細(xì)胞融合中常用的融合手段有離心、振動、電激和PEG法 解析：選A　人工種子常使用人工薄膜作為種皮包被胚狀體。 7．(2018江蘇四校聯(lián)考)下列關(guān)于植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用的敘述，正確的是(　　) A．離體的植物組織、器官必須經(jīng)過滅菌才能接種到組織培養(yǎng)基中 B．以植物芽尖為材料通過組織培養(yǎng)可以獲得抗毒新品種 C．生長素、細(xì)胞分裂素的調(diào)節(jié)作用在組織培養(yǎng)中非常重要 D．以人工膜包裹植物愈傷組織和營養(yǎng)物質(zhì)可制得人工種子 解析：選C　離體的植物組織、器官必須經(jīng)過消毒(滅菌會殺死植物組織和器官)才能接種到組織培養(yǎng)基中；以芽尖為材料通過組織培養(yǎng)可以獲得脫毒苗，但不屬于新品種，抗病毒的新品種需通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得；生長素、細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)作用在組織培養(yǎng)中非常重要；以人工膜包裹胚狀體和營養(yǎng)物質(zhì)可制得人工種子。 8．下列關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的敘述，錯誤的是(　　) A．生物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理制成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)可獲得單層細(xì)胞 B．研究中使用的細(xì)胞通常培養(yǎng)至10代以內(nèi)，以保持正常的二倍體核型 C．為防止雜菌污染，生物組織、培養(yǎng)液及培養(yǎng)用具需要進(jìn)行滅菌處理 D．動物細(xì)胞培養(yǎng)是制備單克隆抗體、細(xì)胞核移植、胚胎工程等技術(shù)的基礎(chǔ) 解析：選C　生物組織滅菌處理后會死亡，無法培養(yǎng)，生物組織通常做消毒處理。 9．(2018揚(yáng)州一模，多選)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如下圖所示，下列有關(guān)敘述正確的是(　　) A．過程①需使用逆轉(zhuǎn)錄酶 B．過程②利用PCR擴(kuò)增CarE基因需使用解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶 C．過程③可用NaCl溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞 D．過程④可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導(dǎo)入受體細(xì)胞 解析：選AD　利用PCR擴(kuò)增基因時，通過高溫使DNA解旋，不需要解旋酶，但需要耐高溫的DNA聚合酶；用CaCl2溶液處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。 10．(多選)超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有延緩衰老的功效。下圖為培養(yǎng)轉(zhuǎn)SOD基因胡蘿卜新品種的過程，相關(guān)敘述正確的是(　　) 　 A．過程①通常采用顯微注射法將攜帶SOD基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞 B．過程②③除培養(yǎng)基中所含激素比例不同外，其他條件完全相同 C．將愈傷組織分散成單個細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)也可能獲得大量SOD D．該育種方式獲得的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜自交后代可能會出現(xiàn)性狀分離 解析：選CD　植物基因工程中，目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的常用方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；在植物組織培養(yǎng)過程中，脫分化(②)和再分化(③)階段使用的培養(yǎng)基除植物激素的比例不同外，營養(yǎng)物質(zhì)的含量也不完全相同，并且脫分化階段不需要光照，再分化階段需要光照。 二、非選擇題 11．如圖是利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)治療遺傳性糖尿病(基因缺陷導(dǎo)致胰島B細(xì)胞不能正常合成胰島素)的過程圖解，請據(jù)圖回答下列問題： (1)圖中①結(jié)構(gòu)表示________，選擇____________(時期)的卵母細(xì)胞去核后作為受體細(xì)胞構(gòu)建重組細(xì)胞A。 (2)②所示的細(xì)胞是________________，將健康胰島素基因?qū)擘谥械某Ｓ梅椒ㄊ莀_______________。 (3)在培養(yǎng)液