2019-2020年高中生物 第4章 現(xiàn)代生物技術(shù) 第15課時(shí) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)同步備課教學(xué)案 北師大版選修1.doc

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2019-2020年高中生物 第4章 現(xiàn)代生物技術(shù) 第15課時(shí) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)同步備課教學(xué)案 北師大版選修1 [學(xué)習(xí)導(dǎo)航]　1.閱讀教材P77～78內(nèi)容，掌握PCR技術(shù)原理。2.結(jié)合教材P79～80內(nèi)容，了解PCR技術(shù)的基本操作過(guò)程，討論P(yáng)CR技術(shù)的影響因素。 [重難點(diǎn)擊]　1.簡(jiǎn)述PCR的原理。2.了解PCR技術(shù)的基本操作過(guò)程并討論P(yáng)CR技術(shù)的影響因素。 一、PCR的原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)中DNA復(fù)制的過(guò)程和細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程是類(lèi)似的，請(qǐng)結(jié)合已學(xué)習(xí)的DNA分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制的相關(guān)知識(shí)，分析PCR的原理。 1.DNA的平面結(jié)構(gòu)示意圖 (1)寫(xiě)出各個(gè)標(biāo)號(hào)的名稱①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鳥(niǎo)嘌呤核糖；④胸腺嘧啶；⑤脫氧核糖；⑥磷酸基團(tuán)；⑦胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸；⑧氫鍵；⑨堿基對(duì)；⑩一條脫氧核糖核苷酸鏈。 (2)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模瑸榱嗣鞔_表示DNA鏈的方向，通常將羥基末端稱為3′端；將磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端，按此原則在圖上方框內(nèi)標(biāo)出兩條鏈的方向。 答案　左鏈上5′端，下3′端；右鏈上3′端，下5′端。 2.細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核糖核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 打開(kāi)DNA雙螺旋 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3′端起點(diǎn) 3.PCR原理與反應(yīng)過(guò)程 (1) PCR概念：是一種體外酶促合成特定DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。 (2)條件及作用 條件 作用 待擴(kuò)增的目的DNA片段 作為復(fù)制的模板 兩種人工合成的單鏈DNA片段 合成DNA時(shí)所需要的特異引物 四種三磷酸脫氧核苷酸 原料 耐熱TaqDNA聚合酶 酶促作用 緩沖溶液 反應(yīng)介質(zhì) (3)反應(yīng)過(guò)程 ①變性 溫度上升到94～98 ℃時(shí)，目的DNA雙鏈變性解旋為單鏈模板。 ②復(fù)性 溫度下降到40～60 ℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。 ③延伸 溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核糖核苷酸在耐熱的TaqDNA聚合酶的作用下。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。 ④循環(huán)：繼續(xù)上述的3個(gè)過(guò)程，DNA片段被不斷的擴(kuò)增。若開(kāi)始加入了N個(gè)DNA模板片段，理論上，循環(huán)n次后能獲得N2n個(gè)DNA片段。 1.PCR原理 PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制的引物在化學(xué)本質(zhì)上是否相同？請(qǐng)分析原因。 答案　不相同。體內(nèi)DNA復(fù)制所需引物為RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反應(yīng)時(shí)所用引物一般是人工合成的單鏈DNA片段。 2.PCR反應(yīng)過(guò)程 (1)PCR反應(yīng)中需要解旋酶和DNA聚合酶嗎？若需要，則與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制有何區(qū)別？ 答案　PCR反應(yīng)不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反應(yīng)中需要高溫使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高溫。 (2)PCR的每次循環(huán)中應(yīng)如何控制溫度？請(qǐng)分析原因。 答案　每次循環(huán)中先高溫解旋，再低溫使引物與模板結(jié)合，最后適當(dāng)升溫有利于Taq DNA聚合酶發(fā)揮作用。 (3)結(jié)合下圖分析PCR過(guò)程中DNA復(fù)制的方向是怎樣的？ 答案　DNA的羥基(—OH)末端為3′端，磷酸基團(tuán)的末端為5′端。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 歸納總結(jié)　PCR擴(kuò)增與DNA復(fù)制的異同 項(xiàng)目 DNA復(fù)制 PCR擴(kuò)增 不同點(diǎn) 時(shí)期 有絲分裂間期或減數(shù)分裂Ⅰ前的間期 任何時(shí)期 場(chǎng)所 活細(xì)胞內(nèi) 細(xì)胞外 酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的Taq DNA聚合酶 引物 有轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生RNA作引物，無(wú)需人工加入 無(wú)轉(zhuǎn)錄，無(wú)引物產(chǎn)生，需人工加入兩種DNA引物 特點(diǎn) 邊解旋邊復(fù)制 先全部解旋后開(kāi)始復(fù)制 緩沖液 不需緩沖液 配制緩沖液代替細(xì)胞核液 設(shè)備 無(wú) 控制溫度變化的溫控設(shè)備 相同點(diǎn) 原理 嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 引物 都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 模板 DNA的兩條鏈為模板 特點(diǎn) 半保留復(fù)制 原料 游離的四種脫氧核苷酸 1.下列關(guān)于DNA復(fù)制和PCR技術(shù)的描述中，正確的是(　　) A.DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從5′端延伸DNA鏈 B.DNA復(fù)制不需要引物 C.引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合 D.PCR擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列 答案　C 解析　DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，故DNA復(fù)制需要引物；DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，而不能從5′端延伸DNA鏈；引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與DNA母鏈相結(jié)合；PCR擴(kuò)增的對(duì)象是DNA，不是氨基酸序列。 2.PCR技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低難以對(duì)樣品進(jìn)行研究的問(wèn)題，而被廣泛應(yīng)用，與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR可以快速擴(kuò)增所需的DNA片段，請(qǐng)分析回答下列有關(guān)問(wèn)題： (1)體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程中用解旋酶打開(kāi)雙鏈DNA，而PCR技術(shù)中的解旋原理是_________。 (2)此過(guò)程需要一種Taq DNA聚合酶，該酶是從____________________中分離的。 (3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是______________。 (4)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較，PCR反應(yīng)要在______________中才能進(jìn)行，并且要嚴(yán)格控制________條件。 (5)PCR中加入的引物有________種，加入引物的作用是____________________________。 答案　(1)DNA的熱變性原理　(2)水生耐熱細(xì)菌Taq　(3)耐高溫　(4)一定的緩沖溶液　溫度　(5)2　作為DNA復(fù)制的起點(diǎn) 解析　(1)PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開(kāi)，從而解旋，其原理是DNA的熱變性原理。 (2)Taq DNA聚合酶是從水生耐熱細(xì)菌Taq中提取的。 (3)與普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的環(huán)境中不變性，具有耐高溫的特性。 (4)PCR反應(yīng)需要適宜的溫度和pH，因此PCR反應(yīng)要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，并需嚴(yán)格控制好溫度條件。 (5)PCR需要兩種引物，引物的識(shí)別位點(diǎn)決定了PCR擴(kuò)增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段單鏈DNA，作用是引導(dǎo)DNA復(fù)制，可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵，成為DNA復(fù)制的起點(diǎn)。 一題多變 細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制需要適宜的溫度和pH嗎？若需要，是如何實(shí)現(xiàn)的？ 答案　需要。細(xì)胞內(nèi)的適宜溫度和pH與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，低等生物與環(huán)境因素有關(guān)。 易錯(cuò)提醒　與PCR原理有關(guān)的三個(gè)易錯(cuò)點(diǎn) (1)酶的作用位點(diǎn)：解旋酶的作用是使DNA兩條鏈之間的氫鍵斷開(kāi)；DNA聚合酶與DNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認(rèn)為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵。 (2)DNA聚合酶和DNA連接酶：DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸連接到已有的單鏈片段的3′端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。 (3)PCR中的解旋過(guò)程：PCR過(guò)程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開(kāi)氫鍵，但此時(shí)的溫度不會(huì)破壞磷酸二酯鍵，因此，DNA加熱變性后變?yōu)閱捂?，并未分解成單體。 二、DNA片段的PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè) DNA片段的PCR擴(kuò)增可以利用PCR熱循環(huán)儀完成，而產(chǎn)物的檢測(cè)則利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。閱讀教材，完善下列內(nèi)容： 1.DNA片段的PCR擴(kuò)增 準(zhǔn)備：按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放于實(shí)驗(yàn)桌上 ↓ 移液：用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組成成分 ↓ 混合：蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁 ↓ 離心：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10 s，目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部 ↓ 反應(yīng)：將離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng) (1)加入離心管中的物質(zhì)應(yīng)包括：模板DNA、TaqDNA聚合酶、4種三磷酸脫氧核苷酸、2種引物、緩沖液。 (2)離心管中要加入少量石蠟油，目的是防止反應(yīng)溶液的揮發(fā)。 (3)熱循環(huán)儀的反應(yīng)程序應(yīng)設(shè)定為： (4)影響因素：在PCR實(shí)驗(yàn)中，需要擴(kuò)增的DNA片段的大小決定延伸的時(shí)間，片段越大，中溫延伸的時(shí)間越長(zhǎng)；引物的堿基數(shù)量和組成則決定著復(fù)性溫度的選擇，如果引物越短，A、T含量越多，復(fù)性溫度就越低，反之引物越長(zhǎng)，G、C含量越多，復(fù)性溫度就越高，這是因?yàn)镚、C之間是由3個(gè)氫鍵連接，A、T之間是由2個(gè)氫鍵連接。 (5)PCR過(guò)程中，循環(huán)次數(shù)是不是越多越好？ 答案　不是。TaqDNA聚合酶在PCR擴(kuò)增過(guò)程中存在110－5的出錯(cuò)幾率，而且隨著循環(huán)次數(shù)的增加，其活性也會(huì)逐漸降低。因此，PCR過(guò)程中，循環(huán)次數(shù)并非越多越好，一般控制在25～35個(gè)循環(huán)。 2.擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) (1)原理：瓊脂糖凝膠具有大小一致的剛性濾孔，帶有大量負(fù)電荷的DNA分子在外加電場(chǎng)的作用下可以通過(guò)這些濾孔向正極泳動(dòng)。DNA片段在凝膠中的泳動(dòng)速率主要取決于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子會(huì)在凝膠的一定位置形成DNA條帶。 (2)過(guò)程 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠，制作成電泳膠板 　　　　　↓ 在DNA樣品中加入0.2倍體積的載樣緩沖液混勻 　　　　　↓ 取20 μL加入樣品孔內(nèi) 　　　　　↓ 80 V穩(wěn)壓電泳20～40 min 　　　　　↓ 當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑電泳到凝膠底部時(shí)，切斷電源 　　　　　↓ 將膠板浸入溴化乙錠溶液染色5～10 min 　　　　　↓ 在紫外透射儀上觀察電泳條帶 1.實(shí)驗(yàn)過(guò)程分析 (1)離心的目的是什么？在離心的過(guò)程中，微量離心管的蓋子為什么一定要蓋嚴(yán)？ 答案　離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效率。微量離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢。 (2)在離心前要用手輕輕彈擊管的側(cè)壁，目的是什么？ 答案　離心前用手輕輕彈擊管的側(cè)壁目的是使反應(yīng)液混合均勻。 (3)PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，為什么這樣操作？還有哪些操作與此目的相同？ 答案　為避免外源DNA等的污染。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。 2.結(jié)果檢測(cè) (1)實(shí)驗(yàn)中為什么要測(cè)定DNA的含量？ 答案　實(shí)際操作過(guò)程中會(huì)有許多因素影響DNA含量，所以需要對(duì)DNA含量進(jìn)行測(cè)定。 (2)如何判斷DNA擴(kuò)增成功？ 答案?、倏梢酝ㄟ^(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。②電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。 (3)PCR擴(kuò)增過(guò)程可能會(huì)出現(xiàn)哪些異常結(jié)果？ 答案　樣品產(chǎn)物少，或產(chǎn)生新的DNA。 歸納總結(jié)　PCR擴(kuò)增DNA片段的操作要點(diǎn) (1)避免外源DNA的干擾，所用儀器、緩沖液、蒸餾水等都需要在使用前高壓滅菌。 (2)緩沖液、酶、DNA引物和DNA模板等如果長(zhǎng)期保存，需要在－20 ℃冰箱內(nèi)保存。其中，DNA引物和DNA模板要避免反復(fù)凍融，否則容易造成DNA的降解。 (3)在用微量移液管混合PCR反應(yīng)體系的各種成分時(shí)，一定注意避免各種溶液之間的相互污染，需遵循每吸取一種溶液就要更換一個(gè)槍頭的原則。 (4)為防止DNA引物與模板DNA在室溫非特異性結(jié)合進(jìn)行PCR反應(yīng)，需在冰盒上混合PCR擴(kuò)增體系的各種組分。 (5)為避免反應(yīng)過(guò)程中高溫使EP管中的水蒸氣溢出管外而導(dǎo)致PCR過(guò)程中各種成分的濃度發(fā)生變化，須在PCR反應(yīng)過(guò)程中加入無(wú)菌的石蠟油防止溶液的揮發(fā)。 3.使用PCR儀具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為(　　) ①設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序?、诎磁浞綔?zhǔn)備好各組分③用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分?、苓M(jìn)行PCR反應(yīng)　⑤離心使反應(yīng)液集中在離心管底部 A.②③⑤④① B.①⑤③②④ C.②③⑤①④ D.④②⑤③① 答案　C 解析　PCR反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備(包括配制配方及將各配方放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上)→移液→混合→離心→反應(yīng)。PCR儀是一種自動(dòng)控制溫度的儀器，設(shè)計(jì)好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)了。 4.近20年來(lái)，PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖)，在短時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，從而使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)加熱使DNA雙鏈間的______鍵完全打開(kāi)，稱為_(kāi)_____；而在細(xì)胞中是在_______酶的作用下進(jìn)行的。 (2)如果只需要大量克隆模板DNA中間的某個(gè)特定區(qū)段，應(yīng)該加入________種特定的引物。當(dāng)溫度降低至40 ℃時(shí)，引物與兩條“舒展”的模板鏈的特定位置結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的______端連接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方向都是______________。 (3)PCR技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個(gè)條件，即液體環(huán)境、適宜的________和__________，前者由________自動(dòng)調(diào)控，后者則靠__________來(lái)維持。 (4)通過(guò)PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制，如果將一個(gè)用15N標(biāo)記的DNA分子放入試管中，以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次之后，則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例是________。 問(wèn)題導(dǎo)析　(1)解旋是使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，PCR技術(shù)是利用DNA的熱變性原理，細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不論復(fù)制幾次，含有15N標(biāo)記的DNA分子都只有2個(gè)。 答案　(1)氫　解旋　解旋　(2)兩　3′　從子鏈的5′端向3′端延伸　(3)溫度　酸堿度　PCR儀　緩沖液　(4)1/8 解析　(1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為解旋，而在細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個(gè)基本反應(yīng)步驟：變性(94～98 ℃)、復(fù)性(40～60 ℃)、延伸(72 ℃)，其特異性依賴于與靶序列互補(bǔ)的引物，引物是兩段與待擴(kuò)增DNA序列互補(bǔ)的片段，兩引物之間的距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。由于DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，則DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(3)PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖溶液)，每一個(gè)步驟需要適宜的溫度和酸堿度等。(4)一個(gè)DNA分子連續(xù)復(fù)制四次之后，形成16個(gè)DNA分子，15N標(biāo)記的DNA分子有2個(gè)，則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為1/8。  1.用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20～30個(gè)核苷酸，是一小段(　　) A.DNA B.RNA C.單鏈DNA或RNA D.雙鏈DNA 答案　C 2.符合PCR反應(yīng)條件的一項(xiàng)是(　　) ①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境?、贒NA模板　③合成引物?、芩姆N脫氧核苷酸?、軩NA聚合酶　⑥D(zhuǎn)NA解旋酶?、呦拗菩詢?nèi)切酶?、鄿乜卦O(shè)備 A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧ C.③④⑤⑥⑦⑧ D.①②③④⑤⑧ 答案　D 解析　PCR反應(yīng)模擬的是生物細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件，只是無(wú)需解旋酶(可熱變性)，也不需要基因工程的工具酶(限制性內(nèi)切酶)。 3.下列關(guān)于PCR的描述中，正確的是(　　) ①PCR是一種酶促反應(yīng)　②引物決定了擴(kuò)增的特異性?、蹟U(kuò)增DNA利用了熱變性的原理　④擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列 A.①②④ B.②③④ C.①③④ D.①②③ 答案　D 解析　PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，在高溫條件下，把DNA的雙鏈打開(kāi)，緩慢冷卻后，又重新結(jié)合，需要耐高溫的DNA聚合酶，同時(shí)，還需要引物，從引物的3′端連接脫氧核苷酸。 4.下圖所示為PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，請(qǐng)分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物(　　) A.第一次循環(huán) B.第二次循環(huán) C.第三次循環(huán) D.第四次循環(huán) 答案　A 解析　在PCR反應(yīng)中，以引物為標(biāo)記，第一次循環(huán)時(shí)，以加入的DNA為模板，兩條DNA鏈可分別由引物Ⅰ和引物Ⅱ與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一種引物；從第二次循環(huán)開(kāi)始，上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng)，所以會(huì)形成DNA分子兩端均含引物的情況，如下圖所示，因此題干中所出現(xiàn)的情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。 5.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將____________的末端稱為5′端，當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的________開(kāi)始延伸DNA鏈。 (2)PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開(kāi)DNA雙鏈的問(wèn)題，但又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的新問(wèn)題。到20世紀(jì)80年代，科學(xué)家從一種Taq細(xì)菌中分離到________________________，它的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用解決了上述問(wèn)題。要將Taq細(xì)菌從其他普通的微生物中分離出來(lái)，所用的培養(yǎng)基叫____________。 (3)PCR的每次循環(huán)可以分為_(kāi)_________________三步。假設(shè)在PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在5次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有________個(gè)這樣的DNA片段。 (4)簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的主要應(yīng)用：_______________________________(要求至少答兩項(xiàng))。 答案　(1)磷酸基團(tuán)　3′端　(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶　選擇培養(yǎng)基　(3)變性、復(fù)性和延伸　32　(4)遺傳疾病的臨床診斷、法醫(yī)鑒定、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等 解析　一條脫氧核苷酸鏈一端是游離的羥基，另一端是游離的磷酸基團(tuán)，含羥基的一端是3′端，含磷酸基團(tuán)的是5′端。引物的5′端與模板鏈的3′端結(jié)合，然后沿著引物的3′端延伸。耐高溫的Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是實(shí)現(xiàn)PCR的關(guān)鍵，該酶可以利用選擇培養(yǎng)基從一些微生物中分離出來(lái)。PCR一次循環(huán)要經(jīng)歷變性、復(fù)性和延伸三個(gè)階段。 課時(shí)作業(yè) [基礎(chǔ)過(guò)關(guān)] 1.PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是(　　) ①PCR過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA②PCR過(guò)程不需要DNA聚合酶?、跴CR過(guò)程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的　④PCR過(guò)程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制 A.③④ B.①② C.①③ D.②④ 答案　C 解析　PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相比較，主要有兩點(diǎn)不同：(1)PCR過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長(zhǎng)度通常為20～30個(gè)核苷酸。(2)PCR過(guò)程中，DNA解旋不依賴解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 2.DNA擴(kuò)增過(guò)程中，DNA片段經(jīng)若干次擴(kuò)增，與其數(shù)目的理論值變化相符的圖是(　　) 答案　C 解析　PCR反應(yīng)中，DNA的擴(kuò)增數(shù)目和生物體內(nèi)的DNA復(fù)制是類(lèi)似的，即1個(gè)DNA分子復(fù)制一次，變?yōu)?個(gè)，復(fù)制2次，產(chǎn)生4個(gè)DNA分子，呈指數(shù)擴(kuò)增，開(kāi)始有一個(gè)DNA分子的模板，經(jīng)過(guò)n次復(fù)制后得到的DNA分子的數(shù)量為2n，與曲線C相符合。 3.下列各項(xiàng)屬于引物作用的是(　　) A.打開(kāi)DNA雙鏈 B.催化合成DNA子鏈 C.使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始復(fù)制 D.提供模板 答案　C 解析　DNA分子的復(fù)制具有方向性，即只能從子鏈的5′端→3′端方向進(jìn)行復(fù)制。當(dāng)引物與DNA母鏈結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈。 4.如圖為DNA變性和復(fù)性示意圖，下列相關(guān)說(shuō)法正確的是(　　) A.向右的過(guò)程為加熱(94～98 ℃)變性的過(guò)程 B.向左的過(guò)程是DNA雙鏈迅速致冷復(fù)性 C.變性與在生物體內(nèi)解旋過(guò)程的條件、實(shí)質(zhì)都相同 D.圖中DNA片段共有4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)、4個(gè)3′端 答案　A 5.PCR一般要經(jīng)過(guò)三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時(shí)(　　) A.仍與引物Ⅰ結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸 B.與引物Ⅱ結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸 C.同時(shí)與引物Ⅰ和引物Ⅱ結(jié)合進(jìn)行子鏈的延伸 D.無(wú)需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈 答案　B 解析　當(dāng)由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時(shí)，此單鏈引物固定端為5′端，因此與它互補(bǔ)的子鏈應(yīng)從另一端開(kāi)始合成，即與引物Ⅱ結(jié)合延伸DNA子鏈。 6.PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它調(diào)控不同溫度的目的是(　　) ①94 ℃，使DNA分子變性，磷酸二酯鍵斷開(kāi)　②94 ℃，使DNA分子變性，解開(kāi)螺旋　③40 ℃時(shí)，使DNA分子開(kāi)始復(fù)制、延伸?、?0 ℃時(shí)，引物與DNA單鏈結(jié)合?、?2 ℃時(shí)，使DNA分子開(kāi)始復(fù)制、延伸?、?2 ℃，使DNA分子恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，恢復(fù)活性 A.①③⑤ B.②③⑤ C.②④⑤ D.②④⑥ 答案　C 解析　PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解旋與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。當(dāng)溫度上升至94 ℃時(shí)，DNA分子變性，解開(kāi)雙螺旋結(jié)構(gòu)；溫度下降到40 ℃時(shí)，引物與DNA單鏈結(jié)合，恢復(fù)活性；溫度上升至72 ℃時(shí)，DNA分子開(kāi)始復(fù)制、延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。 7.下列有關(guān)PCR過(guò)程的敘述中，不正確的是(　　) A.在PCR的變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，DNA在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)可利用解旋酶實(shí)現(xiàn) B.復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的 C.延伸過(guò)程中需要耐高溫的DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D.PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高 答案　C 解析　變性是為了使DNA內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋打開(kāi)，DNA在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)借助解旋酶來(lái)實(shí)現(xiàn)；根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，引物可與 DNA模板鏈結(jié)合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四種脫氧核苷酸為原料；PCR過(guò)程所需溫度較高，會(huì)導(dǎo)致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高溫的DNA聚合酶。 8.下列關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的說(shuō)法中不正確的是(　　) A.在DNA樣品中加入0.2倍體積的載樣緩沖液混勻 B.當(dāng)指示劑電泳到凝膠底部時(shí)，切斷電源 C.電泳后將膠板浸入溴酚藍(lán)溶液中染色5～10 min D.在紫外透射儀上觀察電泳條帶 答案　C 解析　溴酚藍(lán)是電泳指示劑，電泳后染色是用溴化乙錠溶液。 [能力提升] 9.下列關(guān)于PCR操作過(guò)程的敘述，錯(cuò)誤的是(　　) A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌 B.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲(chǔ)存 C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化 D.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換 答案　C 解析　在冰箱中放置的緩沖液和酶從冰箱中取出后應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，而不能迅速融化，故C錯(cuò)誤。 10.關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是(　　) A.化石樣品分析、刑偵破案、DNA序列測(cè)定 B.診斷遺傳病、基因克隆、化石樣品分析 C.DNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案 D.診斷遺傳病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定 答案　D 解析　PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上用于遺傳病的基因診斷、基因克隆、DNA序列測(cè)定，法醫(yī)上用于刑偵破案，古生物學(xué)上用于生物化石樣品分析。PCR技術(shù)是以4種脫氧核苷酸為原料，合成雙鏈DNA的過(guò)程，PCR技術(shù)不能用于合成核苷酸。 11.有關(guān)PCR技術(shù)的說(shuō)法，下列敘述不正確的是(　　) A.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù) B.在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類(lèi)似 C.PCR反應(yīng)只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸 D.PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性和延伸 答案　C 解析　PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的英文縮寫(xiě)，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類(lèi)似，也需要提供模板(母鏈)、酶、原料、引物等條件。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性和延伸三步。 12.在PCR擴(kuò)增DNA的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)一個(gè)DNA分子經(jīng)過(guò)30次循環(huán)后，應(yīng)該得到230個(gè)DNA分子，但是結(jié)果只有約210個(gè)DNA分子，那么出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因不可能是(　　) A.Taq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制 B.系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥 C.循環(huán)次數(shù)不夠 D.引物不能與親鏈結(jié)合 答案　D 解析　如果Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預(yù)期的少，則A項(xiàng)正確。如果PCR系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥，達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果，則B項(xiàng)正確；如果循環(huán)次數(shù)過(guò)少，產(chǎn)物的量比預(yù)期的少，則C項(xiàng)正確；如果引物設(shè)計(jì)不合理，也許不能與模板DNA結(jié)合，造成無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增，而結(jié)果得到了210個(gè)DNA分子，則D項(xiàng)錯(cuò)誤。 13.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，下圖表示合成過(guò)程，請(qǐng)據(jù)圖分析回答下列問(wèn)題： (1)A過(guò)程高溫使DNA變性解旋，對(duì)該過(guò)程原理的敘述，正確的是(　　) A.該過(guò)程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵 B.該過(guò)程用到限制性內(nèi)切酶破壞磷酸二酯鍵 C.該過(guò)程不需要解旋酶的作用 D.該過(guò)程與人體細(xì)胞的過(guò)程完全相同 (2)C過(guò)程要用到的酶是______________。這種酶在高溫下仍保持活性，因此在PCR擴(kuò)增時(shí)可以__________加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反應(yīng)除提供酶外，還需要滿足的基本條件有__________________________________________________________。 (3)如果把模板DNA的兩條鏈用15N標(biāo)記，游離的脫氧核苷酸不做標(biāo)記，控制“94 ℃～40 ℃～72 ℃”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標(biāo)記的DNA占________。 (4)如果模板DNA分子共有a個(gè)堿基對(duì)，其中含有胞嘧啶m個(gè)，則該DNA復(fù)制10次，需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸________個(gè)。 (5)PCR中由堿基錯(cuò)配引起的變異屬于________。假設(shè)對(duì)一個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，第一次循環(huán)時(shí)某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯(cuò)配，則擴(kuò)增若干次后檢測(cè)所用DNA的擴(kuò)增片段，與原DNA相應(yīng)片段相同的占________。 答案　(1)C　(2)Taq DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、適當(dāng)?shù)臏囟燃熬彌_溶液　(3)1/4　(4)(210－1)(a－m)　(5)基因突變　3/4 解析　(1)高溫所起的作用類(lèi)似于解旋酶，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂湣?2)C過(guò)程為PCR技術(shù)的延伸階段，當(dāng)系統(tǒng)溫度上升至72 ℃左右時(shí)，緩沖溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈，Taq DNA聚合酶是耐熱的，高溫下不變性，所以一次性加入即可。PCR反應(yīng)需要模板、四種脫氧核苷酸作原料、酶、能量等，需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行。(3)PCR技術(shù)遵循半保留復(fù)制的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)三次循環(huán)，共產(chǎn)生23個(gè)DNA分子，其中有2個(gè)DNA分子含有15N標(biāo)記。(4)在一個(gè)雙鏈DNA分子中，C＋T占?jí)A基總數(shù)的一半，故T的數(shù)目為a－m，復(fù)制10次，相當(dāng)于新增加了(210－1)個(gè)DNA分子。故需補(bǔ)充T的數(shù)目為(210－1)(a－m)。(5)基因中的堿基對(duì)改變屬于基因突變。對(duì)一個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，第一次循環(huán)時(shí)某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯(cuò)配，第二次以后按正常配對(duì)方式進(jìn)行擴(kuò)增，錯(cuò)配鏈作模板擴(kuò)增的都是錯(cuò)誤的DNA分子，原正常鏈作模板擴(kuò)增的都是正常的DNA分子，故若干次后檢測(cè)所用DNA的擴(kuò)增片段，與原DNA相應(yīng)片段相同的占3/4。 14.PCR是一種體外快速擴(kuò)增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時(shí)內(nèi)可使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)個(gè)。PCR需要模板DNA、引物、脫氧核苷酸和DNA聚合酶等條件。下圖為模板DNA分子及2種引物，請(qǐng)據(jù)圖回答相關(guān)問(wèn)題： (1)PCR的全稱是__________________。PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR技術(shù)中先用94 ℃高溫處理的目的是____________________，而這一過(guò)程在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò)______________實(shí)現(xiàn)的。 (2)在PCR技術(shù)中所需要的引物通常為一段單鏈DNA。請(qǐng)?jiān)趫D中繪出引物結(jié)合的位置。 (3)若將1個(gè)DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入________個(gè)引物。 (4)DNA子鏈復(fù)制的方向是__________________，這是由于__________________________。 答案　(1)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)　使DNA變性(使DNA的兩條鏈解開(kāi))　解旋酶的催化 (2)如圖所示 (3)211－2 (4)從5′端到3′端　DNA聚合酶只能從引物的3′端開(kāi)始連接單個(gè)脫氧核苷酸分子 解析　PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在PCR技術(shù)中，用94 ℃高溫處理的目的是使DNA分子中的氫鍵斷裂，使兩條鏈解開(kāi)，即使DNA分子變性。引物通常是一種單鏈DNA，它能與解開(kāi)的DNA母鏈的3′端結(jié)合，為DNA聚合酶提供吸附位點(diǎn)，使DNA聚合酶從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，從而決定了DNA子鏈復(fù)制的方向是從5′端到3′端。在DNA分子擴(kuò)增時(shí)，需要2種引物，由于新合成的子鏈都需要引物作為復(fù)制的起點(diǎn)，故所需的引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目，即2210－2＝211－2 (個(gè))。 [真題體驗(yàn)] 15.(xx江蘇，22)小鼠雜交瘤細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體用于人體試驗(yàn)時(shí)易引起過(guò)敏反應(yīng)，為了克服這個(gè)缺陷，可選擇性擴(kuò)增抗體的可變區(qū)基因(目的基因)后再重組表達(dá)。下列相關(guān)敘述正確的是(多選)(　　) A.設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)不必考慮表達(dá)載體的序列 B.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列 C.PCR體系中一定要添加從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶 D.一定要根據(jù)目的基因編碼產(chǎn)物的特性選擇合適的受體細(xì)胞 答案　BD 解析　設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)，要考慮擴(kuò)增的目的基因與載體兩端序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，A錯(cuò)誤；DNA復(fù)制沿著模板進(jìn)行，不必知道基因的全部序列，B正確；PCR技術(shù)中的DNA聚合酶是耐高溫的DNA聚合酶，不是從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶，C錯(cuò)誤；目的基因編碼產(chǎn)物不同，相應(yīng)的受體細(xì)胞不同，D正確。 16.(xx江蘇，33節(jié)選)請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題： (1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類(lèi)似(如圖所示)。 圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。 ①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為_(kāi)_______。 ②在第________輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。 (2)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物都不合理(如圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。 ①第1組：________________________________________________________________； ②第2組：________________________________________________________________。 (3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開(kāi)_____________________________________________________________。 答案　(1)①15/16?、谌? (2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效 ②引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效 (3)DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上 解析　(1)①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為15/16。②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。(2)某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。②引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。(3)DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。