細(xì)胞工程：第四章細(xì)胞融合與單克隆抗體

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1、第四章第四章 細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合與單克隆抗體 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞融合及其方法細(xì)胞融合及其方法一、細(xì)胞融合（一、細(xì)胞融合（cell fusion）的定義）的定義 又稱體細(xì)胞雜交（又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridization）或）或細(xì)胞雜交（細(xì)胞雜交（cell hybridization），是指在），是指在離體條件離體條件下用下用人工方法人工方法將不同種生物或同種生物不同類(lèi)型的將不同種生物或同種生物不同類(lèi)型的單細(xì)胞單細(xì)胞通過(guò)通過(guò)無(wú)性方式無(wú)性方式融合成一個(gè)融合成一個(gè)雜合細(xì)胞雜合細(xì)胞的技術(shù)。的技術(shù)。 分為分為自發(fā)細(xì)胞融合自發(fā)細(xì)胞融合和和誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合。（一）（一） 自

2、發(fā)細(xì)胞融合自發(fā)細(xì)胞融合（ spontaneous cell fusion） 指在未施加任何條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融指在未施加任何條件的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。合現(xiàn)象。 體內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合體內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合 可以在受精過(guò)程、個(gè)體內(nèi)的肌管形成、胚胎著可以在受精過(guò)程、個(gè)體內(nèi)的肌管形成、胚胎著床、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成、腫瘤細(xì)胞的融合等床、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成、腫瘤細(xì)胞的融合等過(guò)程中觀察到。過(guò)程中觀察到。o 體外細(xì)胞的自發(fā)融合體外細(xì)胞的自發(fā)融合o 小鼠和雞成肌細(xì)胞的融合：可在原代培養(yǎng)中觀察小鼠和雞成肌細(xì)胞的融合：可在原代培養(yǎng)中觀察到，只有處于到，只有處于G1期的成肌細(xì)胞才能彼此發(fā)生融期的成肌細(xì)

3、胞才能彼此發(fā)生融合。合。o o 腫瘤細(xì)胞的融合：體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)一腫瘤細(xì)胞的融合：體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)一樣彼此發(fā)生融合。樣彼此發(fā)生融合。（二）（二） 誘導(dǎo)細(xì)胞融合（誘導(dǎo)細(xì)胞融合（ induced cell fusion） 指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。 人工誘導(dǎo)形成的融合細(xì)胞有兩類(lèi)：人工誘導(dǎo)形成的融合細(xì)胞有兩類(lèi)：同核體同核體（homokaryon）：由同一基因型親本細(xì)：由同一基因型親本細(xì) 胞融合而來(lái)。胞融合而來(lái)。異核體異核體（heterokaryon）：由不同基因型親本細(xì)：由不同基因型親本細(xì) 胞融合而來(lái)。胞融合而來(lái)。生物法、物理生物

4、法、物理法、化學(xué)法法、化學(xué)法 二、細(xì)胞融合的主要過(guò)程二、細(xì)胞融合的主要過(guò)程細(xì)胞在誘導(dǎo)劑或正弦電場(chǎng)作用下凝聚，彼此細(xì)胞在誘導(dǎo)劑或正弦電場(chǎng)作用下凝聚，彼此靠近靠近；兩個(gè)相鄰細(xì)胞之間的質(zhì)膜相互融合兩個(gè)相鄰細(xì)胞之間的質(zhì)膜相互融合；質(zhì)膜上的受體、；質(zhì)膜上的受體、糖蛋白等質(zhì)膜成分在融合后的質(zhì)膜上糖蛋白等質(zhì)膜成分在融合后的質(zhì)膜上重新分布重新分布；細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)發(fā)生發(fā)生融合融合；細(xì)胞核融合細(xì)胞核融合，形成融合細(xì)胞。，形成融合細(xì)胞。細(xì)胞橋的形成：細(xì)胞膜磷脂分子擾動(dòng)出現(xiàn)通道細(xì)胞橋的形成：細(xì)胞膜磷脂分子擾動(dòng)出現(xiàn)通道三、細(xì)胞融合技術(shù)三、細(xì)胞融合技術(shù) 細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞間遺傳信息轉(zhuǎn)移、基細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞間遺傳信

5、息轉(zhuǎn)移、基因在染色體的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。因在染色體的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。細(xì)胞融合技術(shù)的主要過(guò)程：細(xì)胞融合技術(shù)的主要過(guò)程： 1、制備親本細(xì)胞；、制備親本細(xì)胞； 2、誘導(dǎo)細(xì)胞融合；、誘導(dǎo)細(xì)胞融合； 3、篩選雜合細(xì)胞。、篩選雜合細(xì)胞。（一）親本細(xì)胞的制備（一）親本細(xì)胞的制備1 1、對(duì)于植物和微生物細(xì)胞的融合必需先制備原生、對(duì)于植物和微生物細(xì)胞的融合必需先制備原生質(zhì)體。質(zhì)體。2 2、動(dòng)物單細(xì)胞可以直接用于細(xì)胞融合。、動(dòng)物單細(xì)胞可以直接用于細(xì)胞融合。（二）（二） 誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)日本血凝年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)日本血凝性病毒引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合性病毒引起艾

6、氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞。成多核細(xì)胞。 20世紀(jì)世紀(jì)70年代初，高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)年代初，高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)能促使植物原生質(zhì)體融合。體融合。 20世紀(jì)世紀(jì)80年代，齊默曼等建立年代，齊默曼等建立電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。細(xì)胞細(xì)胞A A細(xì)胞細(xì)胞B B雜交細(xì)胞雜交細(xì)胞生物法生物法化學(xué)法化學(xué)法物理法物理法人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：病毒誘導(dǎo)：滅活的仙臺(tái)病毒病毒誘導(dǎo)：滅活的仙臺(tái)病毒化學(xué)誘導(dǎo)：化學(xué)誘導(dǎo)：PEG、Ca2+、溶血卵磷脂等、溶血卵磷脂等物理誘導(dǎo)：電誘導(dǎo)物理誘導(dǎo)：電誘導(dǎo)1 1、生物法、生物法病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：主要是

7、由于：主要是由于病毒病毒附著在宿主細(xì)胞膜上起附著在宿主細(xì)胞膜上起搭橋作用搭橋作用，細(xì)，細(xì)胞聚集在一起，黏結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，胞聚集在一起，黏結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，細(xì)胞間形成細(xì)胞間形成通道通道，病毒同時(shí)進(jìn)入兩個(gè)，病毒同時(shí)進(jìn)入兩個(gè)細(xì)胞細(xì)胞打破兩個(gè)細(xì)胞膜的隔閡打破兩個(gè)細(xì)胞膜的隔閡，引發(fā)細(xì)，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目的。的。 衣殼粒(capsomer)衣殼(capsid)核髓(genome)被膜(envelope)刺突(spike)核衣殼 病毒的磷脂外衣與動(dòng)物細(xì)胞膜相似病毒的磷脂外衣與動(dòng)物細(xì)胞膜相似，病毒外殼，病毒外殼上的某些上的某些糖蛋白糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功

8、能。有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。 機(jī)制主要是病毒表面刺突的機(jī)制主要是病毒表面刺突的神經(jīng)氨酸酶神經(jīng)氨酸酶的作用。的作用。當(dāng)病毒位于兩個(gè)細(xì)胞之間時(shí)，神經(jīng)氨酸酶降解細(xì)胞當(dāng)病毒位于兩個(gè)細(xì)胞之間時(shí)，神經(jīng)氨酸酶降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部凝集在病毒周?chē)?，在膜上的糖蛋白，使?xì)胞膜局部凝集在病毒周?chē)?，在高高pH和和Ca+條件下局部細(xì)胞膜發(fā)生融合。條件下局部細(xì)胞膜發(fā)生融合。 仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏病毒等。仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏病毒等。仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因。因HAJ病毒病毒毒力弱毒力弱，易被

9、，易被滅活而常采用。滅活而常采用。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。因此，目前已病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。因此，目前已經(jīng)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。2、化學(xué)法、化學(xué)法可以采用的化學(xué)誘導(dǎo)劑包括：可以采用的化學(xué)誘導(dǎo)劑包括：NaNO3、高、高pH的高濃度的高濃度Ca2+離離子、子、聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、溶菌、溶菌酶、明膠、抗體酶、明膠、抗體 、植物凝血素、植物凝血素、伴刀豆

10、球蛋白伴刀豆球蛋白A等。等。細(xì)胞膜電荷平衡被打破。細(xì)胞膜電荷平衡被打破。 聚乙二醇聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一種多聚化合是一種多聚化合物。物。PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵氫鍵，在相，在相鄰的原生質(zhì)體間起到鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。的作用，使原生質(zhì)體接觸。 當(dāng)當(dāng)PEG分子被洗脫時(shí)，分子被洗脫時(shí)，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時(shí)，一種原生質(zhì)體此時(shí)，一種原生質(zhì)體上上帶正電的基團(tuán)帶正電的基團(tuán)

11、可能與另外一個(gè)可能與另外一個(gè)原生質(zhì)體中原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。 在在高高Ca2+和和pH溶液溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，將進(jìn)一步分子洗脫，將進(jìn)一步加劇電荷平衡失調(diào)加劇電荷平衡失調(diào)，從而，從而提高融合的幾率。因此，提高融合的幾率。因此，PEG結(jié)合高結(jié)合高pH、高濃度、高濃度Ca2+誘導(dǎo)融合方法成為一種較常用的細(xì)胞融合方法。誘導(dǎo)融合方法成為一種較常用的細(xì)胞融合方法。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的：融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。異核率較高；融合

12、過(guò)程不受物種限制。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：融合過(guò)程繁瑣，：融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。可能對(duì)細(xì)胞有毒害。3、物理法、物理法電融合誘導(dǎo)法電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用）：利用電場(chǎng)電場(chǎng)來(lái)誘導(dǎo)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合。生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合。原理：在直流電脈沖的刺原理：在直流電脈沖的刺激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜質(zhì)膜表面的電荷和氧化還表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變?cè)娢话l(fā)生改變，使異種，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生生質(zhì)膜瞬間破裂質(zhì)膜瞬間破

13、裂，進(jìn)而，進(jìn)而連連接接，直到閉和成完整的膜，直到閉和成完整的膜形成形成融合體融合體。優(yōu)點(diǎn)：融合率高，重復(fù)性優(yōu)點(diǎn)：融合率高，重復(fù)性與可控制性強(qiáng)與可控制性強(qiáng) 。缺點(diǎn)：可能會(huì)造成不可恢缺點(diǎn)：可能會(huì)造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。復(fù)的細(xì)胞損傷。（三）篩選融合細(xì)胞（三）篩選融合細(xì)胞細(xì)胞融合是一個(gè)細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的隨機(jī)的物理過(guò)程，經(jīng)融合后細(xì)胞將物理過(guò)程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以以多種形式多種形式出現(xiàn)。出現(xiàn)。問(wèn)題：?jiǎn)栴}：A與與B融合過(guò)程中，你能預(yù)見(jiàn)有哪些形式的融合過(guò)程中，你能預(yù)見(jiàn)有哪些形式的細(xì)胞嗎？細(xì)胞嗎？ A-B（非同源細(xì)胞融合體），（非同源細(xì)胞融合體），A-A，B-B（同源細(xì)胞同源細(xì)胞融合體融合體）。）。 A-A-A

14、，B-B-B，A-A-B，B-B-A等多核體（含有雙等多核體（含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體）。親不同比例核物質(zhì)的融合體）。未融合的未融合的A，B 。 篩選的基本原理是通過(guò)培養(yǎng)和篩選，把融合篩選的基本原理是通過(guò)培養(yǎng)和篩選，把融合體從同核體以及未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞體從同核體以及未發(fā)生融合的兩種親本細(xì)胞中分離出來(lái)。中分離出來(lái)。o 篩選的方法篩選的方法o 非選擇性篩選非選擇性篩選：利用雜交細(xì)胞生長(zhǎng)比親本細(xì)胞：利用雜交細(xì)胞生長(zhǎng)比親本細(xì)胞快的現(xiàn)象，用機(jī)械的方法（如毛細(xì)管吸取法）把快的現(xiàn)象，用機(jī)械的方法（如毛細(xì)管吸取法）把單個(gè)雜交細(xì)胞挑選出來(lái)，分裂繁殖，培養(yǎng)出細(xì)胞單個(gè)雜交細(xì)胞挑選出來(lái)，分裂繁殖，培養(yǎng)出

15、細(xì)胞克隆。克隆。o 選擇性篩選選擇性篩選：根據(jù)細(xì)胞對(duì)：根據(jù)細(xì)胞對(duì)藥物的抗性、營(yíng)養(yǎng)要藥物的抗性、營(yíng)養(yǎng)要求或溫度敏感性求或溫度敏感性等的不同，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，等的不同，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，將雜交細(xì)胞分離出來(lái)。將雜交細(xì)胞分離出來(lái)。o 常用方法有：抗藥性篩選；營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選；溫常用方法有：抗藥性篩選；營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選；溫度敏感型篩選等。度敏感型篩選等。四、動(dòng)物細(xì)胞融合的應(yīng)用四、動(dòng)物細(xì)胞融合的應(yīng)用1、突破有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。、突破有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。鼠鼠雞、鼠雞、鼠兔、鼠兔、鼠猴、人猴、人鼠、人鼠、人兔、兔、人人雞、人雞、人蛙、酵母菌蛙、酵母菌雞等。雞等。2、成

16、為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品、成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。種培育等的重要手段。3、為制造單克隆抗體開(kāi)辟了新途徑。、為制造單克隆抗體開(kāi)辟了新途徑。思考思考？1、抗體由何種細(xì)胞產(chǎn)生？、抗體由何種細(xì)胞產(chǎn)生？2、抗體如何產(chǎn)生？、抗體如何產(chǎn)生？3、用傳統(tǒng)的方法如何獲得抗體？、用傳統(tǒng)的方法如何獲得抗體？獲得抗體的傳統(tǒng)方法：獲得抗體的傳統(tǒng)方法：把某種抗原反復(fù)注射到動(dòng)把某種抗原反復(fù)注射到動(dòng)物體內(nèi)，然后從動(dòng)物血清中分離出所需的抗體。物體內(nèi)，然后從動(dòng)物血清中分離出所需的抗體。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，純度低，產(chǎn)量低，純度低，特異性差特異性差。針對(duì)不同抗原決定簇針對(duì)不同抗原決

17、定簇的單克隆抗體混合物的單克隆抗體混合物問(wèn)題：怎樣才能問(wèn)題：怎樣才能大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體？單克隆抗體？提示提示3：用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可行嗎？用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可行嗎？提示提示1：我們所學(xué)的哪種細(xì)胞是可以無(wú)限增殖的？：我們所學(xué)的哪種細(xì)胞是可以無(wú)限增殖的？提示提示2：有什么方法能使：有什么方法能使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力和腫細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力和腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖能力同時(shí)具備呢？瘤細(xì)胞無(wú)限增殖能力同時(shí)具備呢？利用利用B淋淋巴細(xì)胞巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。產(chǎn)生抗體的功能。利用利用腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的特性。無(wú)限增殖的特性。利用利用細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有將兩種細(xì)胞融合獲得具有B B淋巴細(xì)

18、胞和腫瘤細(xì)胞特性的淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞。利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵個(gè)技術(shù)關(guān)鍵二、雜交瘤技術(shù)二、雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology）定義）定義 用用骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫與經(jīng)特定抗原免疫刺激的刺激的B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到融合得到雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)。雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外既能象骨髓

19、瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖無(wú)限增殖，又具有，又具有B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體產(chǎn)生特異性抗體的能力，通過(guò)克隆化培養(yǎng)的能力，通過(guò)克隆化培養(yǎng)獲得純的細(xì)胞可以生產(chǎn)高純度的單克隆抗體。獲得純的細(xì)胞可以生產(chǎn)高純度的單克隆抗體。1、提取細(xì)胞并培養(yǎng)、提取細(xì)胞并培養(yǎng)2、細(xì)胞細(xì)胞融合融合B淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞B淋巴細(xì)胞和瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞淋巴細(xì)胞和瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞3、獲得的雜交細(xì)胞、獲得的雜交細(xì)胞 （繼承雙親的特點(diǎn)）（繼承雙親的特點(diǎn)）檢驗(yàn)和篩選檢驗(yàn)和篩選4、雜交細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、雜交細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)5、得到化學(xué)性質(zhì)單一的，針得到化學(xué)性質(zhì)單一的，針對(duì)性強(qiáng)的抗

20、體對(duì)性強(qiáng)的抗體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基篩選 B 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞的獲得的獲得經(jīng)特定抗原免疫的經(jīng)特定抗原免疫的能產(chǎn)生目的抗體能產(chǎn)生目的抗體的動(dòng)物淋巴細(xì)的動(dòng)物淋巴細(xì)胞；胞；免疫動(dòng)物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或免疫動(dòng)物種系要與骨髓瘤細(xì)胞系一致或有相近的有相近的親源關(guān)系親源關(guān)系。 如：鼠鼠雜交瘤細(xì)胞；如：鼠鼠雜交瘤細(xì)胞； 人鼠或鼠兔雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定。人鼠或鼠兔雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定。三、單克隆抗體的制備過(guò)程三、單克隆抗體的制備過(guò)程（一）（一） 親本細(xì)胞的選擇親本細(xì)胞的選擇 一般要經(jīng)過(guò)一般要經(jīng)過(guò)初次免疫初次免疫、第二次免疫第二次免疫(向動(dòng)物腹腔向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射抗體內(nèi)注射抗體)、加強(qiáng)免疫加強(qiáng)免疫(向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射抗體向動(dòng)

21、物靜脈內(nèi)注射抗體)三三個(gè)過(guò)程。個(gè)過(guò)程。 一般取最后一次加強(qiáng)免疫一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。備成細(xì)胞懸液。 骨髓瘤細(xì)胞的獲得骨髓瘤細(xì)胞的獲得 骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞： 需同時(shí)具有兩個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)需同時(shí)具有兩個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)骨髓瘤細(xì)胞系骨髓瘤細(xì)胞系不能分泌抗體不能分泌抗體，否則雜交瘤細(xì)胞將，否則雜交瘤細(xì)胞將分泌混合抗體；分泌混合抗體； 要要選擇選擇次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型缺陷型（HGPRT-） 或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 （TK- ）。o 骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)

22、物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。雜交融合率高。o 一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。（二）雜交細(xì)胞融合（二）雜交細(xì)胞融合PEG誘導(dǎo)法：誘導(dǎo)法： 將骨髓細(xì)胞：脾細(xì)胞按將骨髓細(xì)胞：脾細(xì)胞按1:41:10， 一般為一般為1:5混合，并加混合，并加入入PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合，混合時(shí)間在誘導(dǎo)細(xì)胞融合，混合時(shí)間在min內(nèi)。內(nèi)。30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱不完全培養(yǎng)液，終止攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱不

23、完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。作用。離心，棄上清，用離心，棄上清，用20小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入胞懸液加入96孔板，孔板，100L孔，孔，37、5CO2孵箱培養(yǎng)。孵箱培養(yǎng)。 細(xì)胞分裝：混合細(xì)胞中加入細(xì)胞分裝：混合細(xì)胞中加入HAT培養(yǎng)液，濃度為培養(yǎng)液，濃度為105細(xì)胞細(xì)胞/0.1mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，6天出現(xiàn)新細(xì)胞克隆。天出現(xiàn)新細(xì)胞克隆。 將不完全培養(yǎng)基加入融合細(xì)胞的過(guò)程要小心謹(jǐn)將不完全培養(yǎng)基加入融合細(xì)胞的過(guò)程要小心謹(jǐn)慎。細(xì)胞在慎。細(xì)胞在離心和高濃度離心和高濃度PEG作用下作用下皺縮皺縮并呈現(xiàn)并呈現(xiàn)交交融融狀態(tài)，加入不完全培養(yǎng)基時(shí)大量水分涌入使細(xì)胞狀態(tài)，

24、加入不完全培養(yǎng)基時(shí)大量水分涌入使細(xì)胞很快很快膨脹膨脹，若加入液體過(guò)快過(guò)多，細(xì)胞可能會(huì)因此，若加入液體過(guò)快過(guò)多，細(xì)胞可能會(huì)因此崩解崩解而導(dǎo)致而導(dǎo)致融合失敗融合失敗。骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 沒(méi)融合的淋巴細(xì)胞沒(méi)融合的淋巴細(xì)胞6-10天死亡天死亡雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞沒(méi)融合的骨髓細(xì)胞沒(méi)融合的骨髓細(xì)胞如何選擇？如何選擇？ ( (三）融合細(xì)胞的篩選三）融合細(xì)胞的篩選H, 次黃嘌呤次黃嘌呤; A, 氨基喋呤氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶胸腺嘧啶融合細(xì)胞：融合細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有具有親代雙方的遺傳性能，具有來(lái)自于來(lái)自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的淋巴細(xì)胞內(nèi)的HGPRT與與TK ，因此，因此可利用培養(yǎng)基中

25、可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用的嘌呤與嘧啶采用補(bǔ)救途徑合成補(bǔ)救途徑合成DNA，因此可在因此可在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中存活與繁殖存活與繁殖。（四）（四） 分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選 ELISA方法檢測(cè)抗體方法檢測(cè)抗體 雜交瘤抗體檢測(cè)雜交瘤抗體檢測(cè) 抗原結(jié)合法抗原結(jié)合法 第二抗體法第二抗體法抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。進(jìn)行定性或定量分析。 （五）（五）雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)通常用通常用“有限稀釋法有限稀釋法”來(lái)選擇：來(lái)選擇： 將

26、雜交瘤細(xì)胞稀釋?zhuān)脤㈦s交瘤細(xì)胞稀釋?zhuān)枚嗫准?xì)胞培養(yǎng)板多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖。然后孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測(cè)各孔檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性孔的孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋?zhuān)话阈柽M(jìn)行細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋?zhuān)话阈柽M(jìn)行35次，直至得到次，直至得到基因型和表型穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株?；?/p>

27、因型和表型穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株。 單細(xì)胞克隆培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞處于不利于生長(zhǎng)的環(huán)境單細(xì)胞克隆培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞處于不利于生長(zhǎng)的環(huán)境（大量非融合細(xì)胞或同核體融合細(xì)胞死亡），在培（大量非融合細(xì)胞或同核體融合細(xì)胞死亡），在培養(yǎng)孔中加入養(yǎng)孔中加入飼養(yǎng)層細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞可提高克隆效率。可提高克隆效率。 飼養(yǎng)層細(xì)胞（飼養(yǎng)層細(xì)胞（feeder cell）可釋放某些）可釋放某些生長(zhǎng)刺激生長(zhǎng)刺激因子因子到培養(yǎng)液中，促進(jìn)了雜交瘤到培養(yǎng)液中，促進(jìn)了雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)，并能，并能滿滿足雜交瘤對(duì)生長(zhǎng)密度的需要足雜交瘤對(duì)生長(zhǎng)密度的需要，從而提高雜交瘤細(xì)胞，從而提高雜交瘤細(xì)胞存活率。存活率。 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠胸腺細(xì)胞、小鼠脾細(xì)胞小鼠

28、腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠胸腺細(xì)胞、小鼠脾細(xì)胞等。等。問(wèn)題：整個(gè)制備過(guò)程為何要經(jīng)過(guò)問(wèn)題：整個(gè)制備過(guò)程為何要經(jīng)過(guò)兩次篩選兩次篩選? ?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細(xì)胞，但細(xì)胞，但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞。細(xì)胞。第二次篩選（第二次篩選（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)）：篩選出能）：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。四、單克隆抗體的應(yīng)用四、單克隆抗體的應(yīng)用 與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高強(qiáng)，靈

29、敏度高，優(yōu)越性十分明顯，優(yōu)越性十分明顯。1、提高免疫分析或其他新分析的靈敏度和重復(fù)性。、提高免疫分析或其他新分析的靈敏度和重復(fù)性。2、臨床診斷：、臨床診斷：準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速性傳播疾病、血型、懷孕或排卵、癌（早期癌抗原性傳播疾病、血型、懷孕或排卵、癌（早期癌抗原的檢測(cè)）的檢測(cè)）3、作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”治療腫瘤。治療腫瘤。 小結(jié)小結(jié)o 細(xì)胞融合的定義、原理與方法細(xì)胞融合的定義、原理與方法o 融合細(xì)胞的篩選方法：雜交瘤細(xì)胞的篩選方法融合細(xì)胞的篩選方法：雜交瘤細(xì)胞的篩選方法o 單克隆抗體的制備流程單克隆抗體的制備流程單

30、克隆抗體制備視頻：?jiǎn)慰寺】贵w制備視頻：http:/ 鼠源性單克隆抗體仍帶有鼠源性單克隆抗體仍帶有鼠抗原決定簇鼠抗原決定簇而使其而使其應(yīng)用具有局限性。例如注射到人體內(nèi)引起應(yīng)用具有局限性。例如注射到人體內(nèi)引起人抗鼠反人抗鼠反應(yīng)應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)過(guò)敏反應(yīng)、抗體很快、抗體很快被清除被清除、不能有效激發(fā)免不能有效激發(fā)免疫防御疫防御系統(tǒng)等問(wèn)題。系統(tǒng)等問(wèn)題。 現(xiàn)在的目標(biāo)是獲得低免疫原性、高效性的現(xiàn)在的目標(biāo)是獲得低免疫原性、高效性的人源人源化單克隆抗體化單克隆抗體。課后問(wèn)題：查閱文獻(xiàn)論述人源化單克隆抗體的研究課后問(wèn)題：查閱文獻(xiàn)論述人源化單克隆抗體的研究進(jìn)展。進(jìn)展。知識(shí)回顧第五章第五章 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)

31、模培養(yǎng)第一節(jié)第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)立一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)立 1907年，胚胎學(xué)家年，胚胎學(xué)家Harrison在無(wú)菌條件下，用在無(wú)菌條件下，用蓋蓋玻片懸滴培養(yǎng)法玻片懸滴培養(yǎng)法將蛙胚髓管部組織在體外培養(yǎng)了數(shù)將蛙胚髓管部組織在體外培養(yǎng)了數(shù)周，開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的先河。周，開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的先河。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1、培養(yǎng)器材的發(fā)展培養(yǎng)器材的發(fā)展 2、培養(yǎng)方法的發(fā)展、培養(yǎng)方法的發(fā)展雙蓋片懸滴培養(yǎng)法雙蓋片懸滴培養(yǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的方法旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的方法 灌注小室培養(yǎng)法灌注小室培養(yǎng)法 方便了更換培養(yǎng)液的操作，方便

32、了更換培養(yǎng)液的操作，大大降低了污染的概率大大降低了污染的概率 培養(yǎng)物可交替地接觸培養(yǎng)液和氣體培養(yǎng)物可交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細(xì)胞或組織成長(zhǎng)環(huán)境，利于細(xì)胞或組織成長(zhǎng) 供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液排出，從而使細(xì)胞生活在不斷更新排出，從而使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中的培養(yǎng)液中 3培養(yǎng)液的發(fā)展培養(yǎng)液的發(fā)展天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基( (胎汁、血漿和血清胎汁、血漿和血清) ) 人工合成培養(yǎng)基（人工合成培養(yǎng)基（需添加血清需添加血清）無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長(zhǎng)因子替代血清）無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長(zhǎng)因子替代血清） 3、培養(yǎng)液的發(fā)展、培養(yǎng)液的發(fā)展天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基

33、( (胎汁、血漿和血清胎汁、血漿和血清) ) 人工合成培養(yǎng)基（人工合成培養(yǎng)基（需添加血清需添加血清）無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長(zhǎng)因子替代血清）無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長(zhǎng)因子替代血清） 第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)概述一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)概述（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的概念（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的概念 指在指在人工條件人工條件（除滿足培養(yǎng)過(guò)程必需的營(yíng)養(yǎng)要（除滿足培養(yǎng)過(guò)程必需的營(yíng)養(yǎng)要求外，還要進(jìn)行求外，還要進(jìn)行pH和溶解氧的最佳控制）下，在和溶解氧的最佳控制）下，在細(xì)細(xì)胞生物反應(yīng)器胞生物反應(yīng)器中中高高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞密度大量培養(yǎng)動(dòng)

34、物細(xì)胞用于用于生產(chǎn)生產(chǎn)生物制品生物制品的技術(shù)。的技術(shù)。 （二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（二）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1、生產(chǎn)疫苗、生產(chǎn)疫苗 目前，通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的目前，通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的疫苗產(chǎn)品有疫苗產(chǎn)品有口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗瘡病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗等。等。2、生產(chǎn)干擾素、生產(chǎn)干擾素3、生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)藥物、生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)藥物4、生產(chǎn)人源化單克隆抗體、生產(chǎn)人源化單克隆抗體（三）動(dòng)物

35、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一般工藝流程（三）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一般工藝流程1 組織塊；組織塊；2組織塊碎片；組織塊碎片；3消化；消化；4離心；離心；5原代培原代培養(yǎng)；養(yǎng)；6傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)；7液氮罐液氮罐保存細(xì)胞；保存細(xì)胞；8復(fù)蘇培養(yǎng)；復(fù)蘇培養(yǎng)；9擴(kuò)大培養(yǎng)；擴(kuò)大培養(yǎng)；10大規(guī)模生物反大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)應(yīng)器培養(yǎng)二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法（一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性不同，可采用根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性不同，可采用懸浮培懸浮培養(yǎng)養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)和和固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)三種培養(yǎng)方

36、法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。模培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng) 指細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)增殖的培養(yǎng)指細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)增殖的培養(yǎng)方法。方法。 主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞、主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類(lèi)血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類(lèi)細(xì)胞。細(xì)胞。貼壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后貼壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)?？梢越臃N在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧效果操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較均一，

37、傳質(zhì)和傳氧效果比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可以借鑒許多細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。實(shí)際操作中可以借鑒許多細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。懸浮培養(yǎng)的缺點(diǎn)：懸浮培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 不能采用灌流培養(yǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞密度較低，另外只不能采用灌流培養(yǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞密度較低，另外只有少數(shù)細(xì)胞適合懸浮培養(yǎng)。有少數(shù)細(xì)胞適合懸浮培養(yǎng)。攪拌式生物反應(yīng)器攪拌式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器2、貼壁培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng) 指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 目前為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有目前為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)瓶、中

38、空纖維、細(xì)胞工廠和微載體瓶、中空纖維、細(xì)胞工廠和微載體等。其中等。其中微載體微載體培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過(guò)容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過(guò)濾系統(tǒng)；同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液濾系統(tǒng)；同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/ /細(xì)胞的比例、細(xì)胞的比例、適用于所有類(lèi)型細(xì)胞。適用于所有類(lèi)型細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大，占地面積大；不能擴(kuò)大培養(yǎng)比

39、較困難，投資大，占地面積大；不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。3 2 旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)14 中空纖維培養(yǎng)中空纖維培養(yǎng) 細(xì)胞工廠培養(yǎng)細(xì)胞工廠培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)目前為細(xì)胞提供貼附表目前為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有面的培養(yǎng)基質(zhì)主要有旋旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細(xì)胞工廠和微載體工廠和微載體等。等。兼具懸浮培養(yǎng)和兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)（1 1）旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)）旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 細(xì)胞貼附在轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋細(xì)胞貼附在轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋轉(zhuǎn)而流動(dòng)，轉(zhuǎn)而流動(dòng)，細(xì)胞交替接觸營(yíng)養(yǎng)和空氣細(xì)胞交替接觸營(yíng)養(yǎng)和空氣，利于細(xì)胞吸，利于細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)、進(jìn)行

40、氣體交換。收營(yíng)養(yǎng)、進(jìn)行氣體交換。細(xì)胞在細(xì)胞在體內(nèi)、體外體內(nèi)、體外的的生存空間生存空間：存在差異存在差異三維空間，高密度生長(zhǎng)三維空間，高密度生長(zhǎng)二維空間，單層生長(zhǎng)，二維空間，單層生長(zhǎng)，生長(zhǎng)密度低生長(zhǎng)密度低體內(nèi)體內(nèi)體外體外（2 2）中空纖維培養(yǎng)）中空纖維培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng)技術(shù)模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的中空纖維培養(yǎng)技術(shù)模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維三維狀態(tài)狀態(tài)，利用一種，利用一種人工的人工的“毛細(xì)血管毛細(xì)血管”即中空纖維來(lái)即中空纖維來(lái)為細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件。為細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件。 中空纖維是中空纖維是細(xì)微的管細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄，管壁為極薄的的半透膜半透膜，水分子、，水分子、小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣小分

41、子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以通過(guò)。管壁表體可以通過(guò)。管壁表面有許多面有許多海綿狀多孔海綿狀多孔結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞能在上面，細(xì)胞能在上面貼壁生長(zhǎng)。貼壁生長(zhǎng)。 細(xì)胞細(xì)胞接種到中空纖接種到中空纖維的維的外表面外表面，而充氧的，而充氧的培養(yǎng)液培養(yǎng)液灌流到中空纖維灌流到中空纖維的的內(nèi)腔內(nèi)腔。貼附在外表面。貼附在外表面的細(xì)胞吸取內(nèi)腔滲出的的細(xì)胞吸取內(nèi)腔滲出的營(yíng)養(yǎng)，迅速生長(zhǎng)繁殖。營(yíng)養(yǎng)，迅速生長(zhǎng)繁殖。一段時(shí)間后細(xì)胞占據(jù)中一段時(shí)間后細(xì)胞占據(jù)中空纖維外壁所有空間，空纖維外壁所有空間，并并在纖維表面堆積在纖維表面堆積。（3）細(xì)胞工廠培養(yǎng)）細(xì)胞工廠培養(yǎng)由一組長(zhǎng)方形培養(yǎng)小室組成。由一組長(zhǎng)方形培養(yǎng)小室組成。(a)向培養(yǎng)室內(nèi)灌注培養(yǎng)液

42、，培養(yǎng)向培養(yǎng)室內(nèi)灌注培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在各培養(yǎng)小室之間流動(dòng)液在各培養(yǎng)小室之間流動(dòng) ；(b)細(xì)細(xì)胞工廠轉(zhuǎn)動(dòng)胞工廠轉(zhuǎn)動(dòng)90。，每個(gè)培養(yǎng)小室液，每個(gè)培養(yǎng)小室液體被分隔，氣相仍到達(dá)各個(gè)培養(yǎng)小體被分隔，氣相仍到達(dá)各個(gè)培養(yǎng)小室；室；(c)向下放平，封閉入口，或向下放平，封閉入口，或者連接到者連接到5CO2通氣管上通氣管上（4）微載體培養(yǎng)）微載體培養(yǎng)微載體（微載體（Microcarrier）：是直）：是直徑徑60-250m的的適用于貼壁依賴型適用于貼壁依賴型細(xì)胞生長(zhǎng)的微粒細(xì)胞生長(zhǎng)的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各種合一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。成的聚合物組成。 微載體培養(yǎng)是在培養(yǎng)容器內(nèi)加入培養(yǎng)液及

43、對(duì)細(xì)微載體培養(yǎng)是在培養(yǎng)容器內(nèi)加入培養(yǎng)液及對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒胞無(wú)害的顆粒微載體，作為載體，使微載體，作為載體，使細(xì)胞在微細(xì)胞在微載體表面附著并呈單層生長(zhǎng)繁殖載體表面附著并呈單層生長(zhǎng)繁殖，通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使，通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)微載體始終保持懸浮狀態(tài)的培養(yǎng)方法。的培養(yǎng)方法。 微載體使利用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模微載體使利用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能培養(yǎng)成為可能，既能滿足動(dòng)物細(xì)胞的貼壁要求滿足動(dòng)物細(xì)胞的貼壁要求，又，又能充分能充分利用生物反應(yīng)器的內(nèi)部空間利用生物反應(yīng)器的內(nèi)部空間。良好微載體的特點(diǎn)：良好微載體的特點(diǎn)：1、好的生物相容性：無(wú)毒無(wú)害；、好的生物相容性：無(wú)毒

44、無(wú)害；2、好的黏附性：適于細(xì)胞附著、伸展和增殖，一般、好的黏附性：適于細(xì)胞附著、伸展和增殖，一般帶正電荷；帶正電荷；3、大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一；、大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一； 4、良好的傳質(zhì)性能；、良好的傳質(zhì)性能；5、強(qiáng)的機(jī)械性能：保護(hù)細(xì)胞、重復(fù)利用；、強(qiáng)的機(jī)械性能：保護(hù)細(xì)胞、重復(fù)利用；6、好的熱穩(wěn)定性：適合高壓蒸汽滅菌。、好的熱穩(wěn)定性：適合高壓蒸汽滅菌。動(dòng)物細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的主要環(huán)節(jié)有哪些？動(dòng)物細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的主要環(huán)節(jié)有哪些？1、潛伏期潛伏期：（1）游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈）游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)懸浮狀態(tài)。（2）吸附期：不同類(lèi)型的細(xì)胞）吸附期：不同類(lèi)型的細(xì)胞貼

45、壁貼壁時(shí)間有所差異。時(shí)間有所差異。2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過(guò)一段停滯后開(kāi)：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過(guò)一段停滯后開(kāi)始分裂。隨著始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量增多細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞間開(kāi)始接觸并，細(xì)胞間開(kāi)始接觸并連接成片，出現(xiàn)連接成片，出現(xiàn)接觸性抑制接觸性抑制。3、停滯期停滯期：細(xì)胞長(zhǎng)滿載體表面，隨著營(yíng)養(yǎng)物消耗和：細(xì)胞長(zhǎng)滿載體表面，隨著營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝物積累，代謝物積累，密度抑制現(xiàn)象密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細(xì)胞開(kāi)始退化。出現(xiàn)，細(xì)胞開(kāi)始退化。如不如不及時(shí)傳代培養(yǎng)及時(shí)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞脫落死亡。，細(xì)胞脫落死亡。知識(shí)點(diǎn)回顧知識(shí)點(diǎn)回顧微載體培養(yǎng)的操作過(guò)程：微載體培養(yǎng)的操作過(guò)程： 微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞也經(jīng)過(guò)以上四步。大致

46、可微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞也經(jīng)過(guò)以上四步。大致可以分為五個(gè)階段，即以分為五個(gè)階段，即培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、維持培養(yǎng)階段、細(xì)胞收獲階段、微載體培養(yǎng)的放大維持培養(yǎng)階段、細(xì)胞收獲階段、微載體培養(yǎng)的放大階段階段。培養(yǎng)初期階段：培養(yǎng)初期階段：保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的p和和溫度，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至溫度，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至1/3體積的培養(yǎng)基中。體積的培養(yǎng)基中。黏附貼壁階段：黏附貼壁階段：緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，增加攪拌緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。速度保證完全均質(zhì)混合。維持培養(yǎng)階段：維持培養(yǎng)階段：隨細(xì)胞增殖，微球變重

47、，增加攪拌速率。隨細(xì)胞增殖，微球變重，增加攪拌速率。經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)3天左右，培養(yǎng)液呈酸性，需換液。天左右，培養(yǎng)液呈酸性，需換液。細(xì)胞收獲階段：細(xì)胞收獲階段：排干培養(yǎng)液，緩沖液漂洗排干培養(yǎng)液，緩沖液漂洗1次，加入酶，次，加入酶，快速攪拌，解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品?？焖贁嚢?，解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)的放大階段：微載體培養(yǎng)的放大階段：增加微載體的含量或培養(yǎng)體積增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。進(jìn)行放大。微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：1、表面積體積大、表面積體積大 ，單位體積培養(yǎng)液的，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高細(xì)胞產(chǎn)率高。2、把、把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合， 兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)。

48、兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)。3、可用簡(jiǎn)單的顯微鏡、可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞觀察細(xì)胞在微珠表面的在微珠表面的生長(zhǎng)情況生長(zhǎng)情況。4、培養(yǎng)系統(tǒng)、培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小占地面積和空間??；勞動(dòng)強(qiáng)度小勞動(dòng)強(qiáng)度??；放大容放大容易易，使大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞成為可能。，使大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞成為可能。5、接種與收獲方便接種與收獲方便，可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，培養(yǎng)培養(yǎng)基基利用率較高利用率較高。微載體培養(yǎng)的缺點(diǎn)：微載體培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 細(xì)胞生長(zhǎng)在微載體表面，培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)攪拌細(xì)胞生長(zhǎng)在微載體表面，培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)攪拌會(huì)會(huì)損傷微載體表面的細(xì)胞損傷微載體表面的細(xì)胞，而且培養(yǎng)后期，而且培養(yǎng)后期細(xì)胞容易細(xì)胞容易從微載體

49、上脫落下來(lái)從微載體上脫落下來(lái)。 為克服傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的不足，現(xiàn)開(kāi)發(fā)出為克服傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的不足，現(xiàn)開(kāi)發(fā)出大大孔微載體孔微載體。大孔微載體內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，。大孔微載體內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，細(xì)胞在其內(nèi)部生長(zhǎng)，保證細(xì)胞充分的生長(zhǎng)空間，使細(xì)胞在其內(nèi)部生長(zhǎng)，保證細(xì)胞充分的生長(zhǎng)空間，使細(xì)胞免受機(jī)械損傷，增加細(xì)胞貼壁的穩(wěn)定性。細(xì)胞免受機(jī)械損傷，增加細(xì)胞貼壁的穩(wěn)定性。3 3、固定化培養(yǎng)、固定化培養(yǎng) 將將動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞與與水不溶性載體水不溶性載體結(jié)合起來(lái)再進(jìn)行培養(yǎng)結(jié)合起來(lái)再進(jìn)行培養(yǎng)的方法。的方法。 具有具有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易與

50、產(chǎn)物分開(kāi)，有等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易與產(chǎn)物分開(kāi)，有利于產(chǎn)物分離純化利于產(chǎn)物分離純化。 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如法，如吸附培養(yǎng)法、包埋培養(yǎng)法和微囊培養(yǎng)法吸附培養(yǎng)法、包埋培養(yǎng)法和微囊培養(yǎng)法。（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式1、分批式培養(yǎng)、分批式培養(yǎng)2、流加式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng)3、半連續(xù)式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng)4、連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng) 5、灌注式培養(yǎng)灌注式培養(yǎng)1、分批式培養(yǎng)、分批式培養(yǎng) 將細(xì)胞和培養(yǎng)液將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)，培養(yǎng)轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)程中過(guò)程中體積不變體積不變，不添加其他成分，待細(xì)胞

51、增長(zhǎng)和，不添加其他成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基物、培養(yǎng)基。 周期為周期為35d，細(xì)胞經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度達(dá)到最細(xì)胞經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡或代謝產(chǎn)物累積，細(xì)胞高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡或代謝產(chǎn)物累積，細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。進(jìn)入衰亡期。收獲產(chǎn)物在細(xì)胞快要死亡或已經(jīng)死亡收獲產(chǎn)物在細(xì)胞快要死亡或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。后進(jìn)行。 2、流加式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng) 將將終體積終體積1/31/2的培養(yǎng)液裝入反的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器中，適宜條件下接種細(xì)胞，培養(yǎng)應(yīng)器中，適宜條件下接種細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中過(guò)程中流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或

52、培養(yǎng)液流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)液，使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高密度較高密度、目標(biāo)產(chǎn)、目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到品達(dá)到較高水平較高水平。 采用采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。壁細(xì)胞。 2、流加式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng) 關(guān)鍵技術(shù)是在關(guān)鍵技術(shù)是在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)入衰退期之前細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)入衰退期之前添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可添加一次，也可多次。添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可添加一次，也可多次?？傮w原則是總體原則是維持相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境維持相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)成，營(yíng)養(yǎng)成分既不因過(guò)剩產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營(yíng)養(yǎng)利

53、用分既不因過(guò)剩產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營(yíng)養(yǎng)利用率下降，也不因缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制或死亡。率下降，也不因缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制或死亡。3、半連續(xù)式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng) 也稱為重復(fù)批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在細(xì)胞增長(zhǎng)也稱為重復(fù)批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間取出部分培養(yǎng)取出部分培養(yǎng)物物，再用，再用新培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積新培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，維持反應(yīng)器內(nèi)，維持反應(yīng)器內(nèi)總體積不變?？傮w積不變。特點(diǎn)特點(diǎn)：（：（1）培養(yǎng)物的體積逐步增加；）培養(yǎng)物的體積逐步增加； （2）可進(jìn)行多次收獲；）可進(jìn)行多次收獲； （3）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，保持產(chǎn)物和細(xì)胞

54、）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，保持產(chǎn)物和細(xì)胞在較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。在較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。4、連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng) 將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)最大密將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以度之前，以一定速度連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基一定速度連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)含，同時(shí)含有細(xì)胞的有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積恒定。以保持培養(yǎng)體積恒定。 細(xì)胞可在細(xì)胞可在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)，環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、濃度、產(chǎn)物濃度、pH可恒定，可可恒定，可有效延長(zhǎng)細(xì)胞

55、的對(duì)有效延長(zhǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期數(shù)生長(zhǎng)期。5、灌注式培養(yǎng)、灌注式培養(yǎng) 細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷將產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷將部分培養(yǎng)基取出部分培養(yǎng)基取出，同時(shí)連，同時(shí)連續(xù)續(xù)不斷地灌注新培養(yǎng)基不斷地灌注新培養(yǎng)基。取出部分培養(yǎng)基時(shí)，。取出部分培養(yǎng)基時(shí)，絕大絕大部分細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞截流裝置保留在反應(yīng)器內(nèi)部分細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞截流裝置保留在反應(yīng)器內(nèi)。 灌注培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)1、細(xì)胞截流系統(tǒng)使細(xì)胞留在、細(xì)胞截流系統(tǒng)使細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高細(xì)胞密反應(yīng)器內(nèi)，維持較高細(xì)胞密度，提高產(chǎn)品的產(chǎn)量；度，提高產(chǎn)品的產(chǎn)量；2、細(xì)胞穩(wěn)定處在好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)、細(xì)胞穩(wěn)定處在好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝物積累少；境中，有害代謝物積累少；3、反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)、反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；4、可連續(xù)性收獲產(chǎn)品。、可連續(xù)性收獲產(chǎn)品。本章小結(jié)1、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程主要包括、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程主要包括哪些步驟？哪些步驟？2、微載體的選擇有何要求？、微載體的選擇有何要求？3、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種操作方式？各、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種操作方式？各自具有哪些特點(diǎn)？自具有哪些特點(diǎn)？