非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)的分類.doc

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非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)的分類 有三種常用的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native（CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。 在一個典型的native PAGE方法中，復(fù)合物被CN-PAGE或BN-PAGE分離。然后可以用其它分離方法如SDS-PAGE或等電聚焦做進一步分離。隨后切割凝膠，蛋白復(fù)合物每一個部分都被分開。蛋白的每個條帶可以消化后做肽鏈指紋圖譜或重新測序。這樣就可以提供一個蛋白復(fù)合物中單個蛋白的重要信息。 1. Blue Native PAGE Blue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技術(shù)。是以考馬斯亮藍作為電泳分離后蛋白質(zhì)鑒定染料的一種電泳方法。這種方法的缺點是：考馬斯亮藍與蛋白的結(jié)合起到了去垢劑的作用，可能導致復(fù)合物的分離；并對化學發(fā)光或蛋白質(zhì)輔基的熒光或熒光染料的標記具有潛在的猝滅作用。 Blue Native PAGE在分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及膜蛋白復(fù)合物方面有很大的優(yōu)勢，其分離范圍在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE過程中，最重要的化合物就是考馬斯亮藍，除了增溶作用以外，蛋白質(zhì)表面結(jié)合了大量的考馬斯亮藍染料而帶上負電荷，這會導致即使堿性蛋白在 pH7.5條件下也會向陰極遷移。但是，蛋白質(zhì)雖然帶有大量的負電荷，然而其分離依據(jù)的根本還是根據(jù)不連續(xù)的凝膠梯度-凝膠孔徑的逐漸減小，蛋白質(zhì)最終遷移到其自身大小與凝膠孔徑相近似的位置而停止。并且在分離膜蛋白的過程中，由于帶有負電荷，而不會引起蛋白聚合，與酸性染料的結(jié)合，膜蛋白也由疏水性變成親水性，溶解性大大提高。 1.2 Clear Native PAGE Clear Native PAGE是通過除染色以的其它方法如SLS鑒定蛋白的電泳技術(shù)。然而，這種方法最大的應(yīng)用還是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，特別是和質(zhì)譜聯(lián)用。 Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝膠中分離酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的電泳技術(shù)，分辨率通常比BN-PAGE低。遷移距離決定于蛋白的固有電荷和凝膠孔徑大小。因此，BN-PAGE比CN-PAGE應(yīng)用更廣泛。然而CN-PAGE在考馬斯染料分析天然混合物干擾進一步分析時存在著優(yōu)勢。如測定催化活性（例如線粒體ATP合酶）或分離用于熒光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更溫和，特別是使用洋地黃皂苷時，CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子組合體的結(jié)構(gòu)而BN-PAGE會導致分解。線粒體ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE檢出，但BN-PAGE無法檢出。 CN-PAGE起源于無色非變性PAGE，是BN- PAGE之后出現(xiàn)的技術(shù)。既然CN-PAGE中沒有帶電荷的染料，蛋白在電場中的遷移完全取決于這個蛋白的固有電荷。大分子和低聚蛋白必須有合適的物理參數(shù)才能在CN-PAGE中分開，特別是PI低于5.4，分辨率低。由此看來，CN-PAGE除了獲得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中沒有什么優(yōu)勢了。優(yōu)點是條件更溫和，在蛋白質(zhì)組學研究中具有更大優(yōu)勢。BN-PAGE和CN-PAGE的緩沖液和電泳條件一致，但是CN-PAGE的陰極緩沖液中不含考馬斯染料，而是將0.025%的洋地黃皂苷加入到凝膠中。 1.3 QPNC-PAGE QPNC-PAGE（quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis）是一種應(yīng)用于生物化學和生物有機化學的根據(jù)等電點分離蛋白的高分辨技術(shù)。這種凝膠電泳被生物學家應(yīng)用于獨立活性或天然金屬蛋白樣品或正確或非正確折疊的可溶性的與金屬輔助因子結(jié)合的蛋白混合物的鑒定。 1.3.1電泳緩沖液 QPNC-PAGE是在特殊的裝置里進行的分離生物活性分子的電泳過程。在特殊的電泳緩沖系統(tǒng)（基于Tris-HCl和NaN3）中，一個生物系統(tǒng)中的大多數(shù)蛋白都會帶電荷，在電場的正負極之間遷移。 盡管PH（10.00）的電泳緩沖液并不與細胞或組織中的生理PH相符，但是在生理PH（8.00）的緩沖體系下蛋白會連續(xù)洗脫并分成不同的部分。分離系統(tǒng)包括電泳槽和分部收集器，這些裝置要置于冰箱中。 1.3.2凝膠特征 為了得到一個PAGE所需的聚合完全的凝膠，聚丙烯酰胺凝膠需要在室溫下凝聚69hr。最后，得到均質(zhì)的含機械穩(wěn)定和自由的單體或原子。凝膠的孔徑很大，因此分子篩作用在電泳分離中最小化。基于上述原因，凝膠和活性分子之間的相互作用可以忽略。待分離的金屬蛋白（如金屬分子伴侶，蛋白酶感染性初級因子，金屬運輸?shù)鞍?，淀粉狀蛋白，金屬酶，金屬肽等）不會分解成脫輔蛋白和金屬輔助因子。孤立蛋白的生物活性結(jié)構(gòu)（天然或3D構(gòu)象）在QPNC-PAGE后不會發(fā)生構(gòu)象變化。所以，金屬蛋白和蛋白異構(gòu)體在PAGE中被定量的分成高純度的部分。QPNC與其它電泳技術(shù)如SDS-PAGE，2-DE，等速電泳和CN- PAGE等相比被稱為“突破性的方法”。 1.3.3 實驗方法 （1）儲備液 1）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室溫 2）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室溫 3）40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺2.67C，4℃（新鮮） （2）電泳緩沖液 20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除氣），4℃ 電泳槽上部：500ml電泳緩沖液 電泳槽下部：2000ml電泳緩沖液 （3）洗脫液 20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除氣），4℃ 洗脫室：700ml洗脫緩沖液 （4）分離膠 丙烯酰胺4%T 體積40ml 成分： 4ml40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺2.67C 4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00 32 mL H2O 200 μL 10% APS 20 μL TEMED APS和TEMED最后加入。輕輕攪拌燒瓶中的混合物，注意不能產(chǎn)生氣泡。然后把溶液移入內(nèi)徑為28mm，長為40mm有刻度的玻璃柱中。加入3ml正丙醇。60分鐘聚合后用電泳緩沖液沖洗凝膠，然后用4ml電泳緩沖液覆蓋凝膠表面。在室溫下凝集69小時。 （5）樣品的準備和收集 保持樣品（生物液體）溫度為4℃。0.3ml甘油和2.7ml樣品在分離前混合5分鐘。然后把處理好的樣品加入到電泳緩沖液的上層。這些蛋白在此電泳緩沖液中不是帶負電（PI<10.0）就是帶負電（PI>10.0），因此在電場中不是從正極遷移到負極就是從負極遷移到正極。已分離的蛋白分子用特殊的生理洗脫液連續(xù)洗脫，并用分部收集器收集。整個分離系統(tǒng)必須在4℃冰箱中進行。 純化的，半純化的和未處理的樣品都可以用于QPNC。樣品分離純化中應(yīng)該避免類似于蛋白質(zhì)沉淀等過程以防止蛋白變性?；瘜W穩(wěn)定的金屬蛋白可以用非變性的凝膠滲透層析來進行進一步純化。 1.3.4 定量和鑒定 Fe， Cu， Zn， Ni， Mo， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd和其它金屬輔因子可以通過ICP-MS（Inductively coupled plasma mass spectroscopy，電感耦合等離子體質(zhì)譜）來定性和定量。因為PAGE條帶的高純度和選擇性凝集，相關(guān)的結(jié)構(gòu)可以用非變性條件下的NMR來分析。 1.3.5 應(yīng)用 QPNC的應(yīng)用對象為分子量6-200kDa的酸性、堿性和中性金屬蛋白。在測定血液或其它臨床樣品中獨立的金屬蛋白結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系方面具有重要應(yīng)用，因為不正確的金屬陪伴蛋白的折疊。例如超氧化物歧化酶（SOD）的銅陪伴蛋白出現(xiàn)在這些基質(zhì)中或許預(yù)示著神經(jīng)病變疾病如肌萎側(cè)索硬化病等。QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技術(shù)的連用可以得到病人或潛在的病人液體基質(zhì)中相關(guān)金屬蛋白的生理狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。這一技術(shù)可以提高蛋白錯折疊相關(guān)疾病的診斷和治療水平。