在黑色素瘤中異常表達(dá)的MHCII類(lèi)受體.doc

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在惡性黑色素瘤中MHC II類(lèi)分子的異常表達(dá)吸引炎性腫瘤特異性CD4 + T-Cells并降低CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng) Aberrant Expression of MHC Class II in Melanoma Attracts Inflammatory Tumor-Specific CD4+ T-Cells, Which Dampen CD8+ T-cell Antitumor Reactivity 摘要 在不存在局部炎癥反應(yīng)情況下，MHC類(lèi)型Ⅱ分子表達(dá)主要限制在造血細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞。然而，某些腫瘤，如黑色素瘤，可能獲得MHC II類(lèi)的異常組成性表達(dá)。在一組初級(jí)黑素瘤細(xì)胞群體的和相應(yīng)地?cái)U(kuò)大了自體腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）中，我們將展示在具有高度MHC II類(lèi)分子特異性及腫瘤有特異性T細(xì)胞應(yīng)答的黑色素瘤細(xì)胞中， MHC II是如何表達(dá)的。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤特異性CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答是由TNF產(chǎn)生支配。在IFNγ豐富的環(huán)境中，TNF降低CD8+ T細(xì)胞激活類(lèi)似腫瘤部位的能力。相反，直接的CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)對(duì)無(wú)論是黑色素瘤細(xì)胞的增殖或活力無(wú)影響。總之，我們的結(jié)果表明了一種被MHC II類(lèi)分子的異常表達(dá)激活的新免疫逃離機(jī)制的存在，這種機(jī)制靠吸引腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞引發(fā)腫瘤壞死因子主導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)而去抑制CD8 +T細(xì)胞的反應(yīng)。Cancer Res; 75(18); 3747–59. 2015 AACR. 引言 在沒(méi)有局部的炎癥反應(yīng)的情況下，MHC II型表達(dá)主要限于造血細(xì)胞和胸腺上皮。然而，某些類(lèi)型的實(shí)體瘤，包括黑色素瘤亞單位，能從頭組成表達(dá)MHC II類(lèi)分子。另外，通過(guò)暴露于細(xì)胞因子例如IFNγ的方法，MHC II類(lèi)可在幾種細(xì)胞類(lèi)型(包括腫瘤細(xì)胞)中被誘導(dǎo)表達(dá)。 在黑色素瘤的MHC II類(lèi)表達(dá)先前已發(fā)現(xiàn)與較短和較長(zhǎng)的存活都相關(guān)聯(lián)。的確，MHC II類(lèi)表達(dá)可以使這些腫瘤被的腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞直接檢測(cè)。我們和其他人曾證明這種CD4+ T細(xì)胞能夠產(chǎn)生Th1應(yīng)答響應(yīng)于自體腫瘤抗原。與此相反，最近的研究提出，分別表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的MHC II類(lèi)分子與由淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG3）的接合，可能會(huì)觸發(fā)促存活信號(hào)和腫瘤細(xì)胞的抗細(xì)胞凋亡。此外，LAG3已被表征為免疫抑制性受體，并且其在T細(xì)胞上的接合可以在啟動(dòng)階段而不是在效應(yīng)階段介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)的下調(diào)。 為了闡明MHC II型表達(dá)與CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答和CD4+ T細(xì)胞的功能性模式在黑素瘤中的關(guān)聯(lián)，我們進(jìn)行了擴(kuò)大的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）的一種多功能分析直接識(shí)別了一組的38自體配對(duì)的晚期患者產(chǎn)生的黑色素瘤細(xì)胞系。我們的研究結(jié)果揭示了一個(gè)新機(jī)制，MHC II表達(dá)的黑色素瘤對(duì)炎性CD4+ T細(xì)胞存在吸引，并且通過(guò)IFNg-介導(dǎo)及TNF誘導(dǎo)免疫反應(yīng)局部擴(kuò)大來(lái)反作用CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，起到抑制作用。 材料和方法 病人和樣品 科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了在丹麥的首都地的所有的程序。根據(jù)赫爾辛基宣言在任何操作之前患者簽署書(shū)面知情同意書(shū)。所有患者都被診斷為組織學(xué)確診的晚期黑色素瘤，AJCCⅣ期（N32）或IIIB（N= 1，完全切除），IIIC（N5，其中兩種是完全切除）。 從ESTDAB得到（http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）原發(fā)黑素瘤的WM-115，F(xiàn)M-55-P，F(xiàn)M-55-M1，和FM-55-M2的腫瘤細(xì)胞系。 WM-115，WM-75，WM-793，和WM-266-4已被描述過(guò)特征。 用于流式細(xì)胞術(shù)的抗體 用流式細(xì)胞儀抗體小組分別為： - CD4 +和CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的多方面特性：CD4 QDOT 705（Life Technologies公司），CD8 QDOT605（Life Technologies公司），近紅外活/死可固定死細(xì)胞染色即（Life Technologies公司），MIP-1A FITC（eBioscience公司），MIP-1B PerCP-eFluor 710（eBioscience公司），CD107a Brilliant Violet 421，IFNG PE-Cy7，TNF-APC，IL2 Brilliant Violet 650（Biolegend公司），IL17A Brilliant Violet 510。 - 所有其他腫瘤的T細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：CD4 FITC，CD8PerCP，可固定活力染料eFluor 450（eBioscience公司），IFN PE Cy7，TNF-APC，CD107a PE。 - MHC I類(lèi)特性：抗HLA-ABC的APC，7-AAD - MHC II類(lèi)特性：抗HLA-DP，DR，DQ FITC，7-AAD TIL和黑色素瘤細(xì)胞系的制備 本研究使用的TIL是按照在其他研究中廣泛描述的實(shí)驗(yàn)過(guò)程得到的。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在無(wú)菌條件下將手術(shù)的切除黑色素瘤腫瘤切成1?2立方毫米小碎塊，將浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞從這些腫瘤中分離開(kāi)，并在高劑量的IL2（??6000 IU / mL的IL-2; Proleukin諾華）保持最低限度地?cái)U(kuò)增。當(dāng)獲得最少50X106腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞時(shí)（該產(chǎn)物在通常手術(shù)切除之后約14-28天此階段被命名為“微創(chuàng)培養(yǎng)的TIL”），擴(kuò)增是由標(biāo)準(zhǔn)的14天快速擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)（REP）進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)的，在其中的TIL在用200倍過(guò)量的同種異體的來(lái)自至少三個(gè)不同健康供體照射處理過(guò)的外周血單核細(xì)胞（PBMC）和30納克/毫升抗CD3抗體（OKT3，Janssen-Cilag or Miltenyi Biotec）非特異性地?cái)U(kuò)增。在本篇文章中，該TIL被命名為“擴(kuò)大的TIL（expanded TILs）”或“REP-TIL。”從一些病人的腫瘤碎片提取“未培養(yǎng)（或鮮）腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞”。腫瘤碎片用添加了1毫克/毫升膠原酶IV型（Sigma-Aldrich公司）和0.0125毫克/毫升dornase阿爾法（Pulmozyme，羅氏）的消化液消化過(guò)夜并立即冷凍保存。 在REP之前，根據(jù)制造商的說(shuō)明利用陽(yáng)性磁力選擇（positive magnetical selection）分別使用CD8或CD4的磁珠（美天旎）篩選TIL，得到純CD8 +或CD4 + T細(xì)胞群。并得到設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中所要使用的分好類(lèi)的T細(xì)胞。隨后，分選亞群們分別進(jìn)行擴(kuò)增。只有CD8+或CD4 + T細(xì)胞的濃度達(dá)到95％以上的培養(yǎng)物被用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。 自體黑素瘤細(xì)胞系分別TIL從產(chǎn)生，無(wú)論是從腫瘤碎片或從運(yùn)輸培養(yǎng)基中懸浮回收細(xì)胞團(tuán)或從組織碎片中，如先前文獻(xiàn)所述（16，18）。 通過(guò)流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞應(yīng)答 如先前文獻(xiàn)所述（10，16），進(jìn)行T細(xì)胞反應(yīng)的測(cè)定。 簡(jiǎn)要地說(shuō)，TIL解凍，并在RPMI-1640（Life Technologies公司）靜置3天（用于REP的TIL的多官能表征），2天（最低限度培養(yǎng)的TIL），或過(guò)夜（在所有其它情況下）中補(bǔ)充有10％AB人血清（SigmaAldrich），之后洗滌兩次，與自體短期培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)。腫瘤反應(yīng)性通過(guò)評(píng)估先前門(mén)控為CD4或CD8 T細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子（IFNG和TNF）或CD107a 的表達(dá)量來(lái)評(píng)估。 為了篩選CD8 +和CD4 + T對(duì)自體腫瘤抗原的細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的自體腫瘤在100IU /毫升IFNG（Imukin，勃林格殷格翰）孵育72小時(shí)，然后充分洗滌，并添加到共培養(yǎng)物中。這樣做是為了能最大限度地檢測(cè)到低頻的與MHC表達(dá)下調(diào)的自體腫瘤與或沒(méi)有組成型MHC II類(lèi)表達(dá)抗腫瘤反應(yīng)。反應(yīng)被定義為在相對(duì)CD8 +或CD4 + T細(xì)胞亞群中，最少有0.5％的應(yīng)答細(xì)胞的存在（表達(dá)出下列T細(xì)胞功能中的至少一種：TNF，IFNG，或CD107a），最少50的陽(yáng)性事件發(fā)生和與背景（即，未刺激的樣品）相比至少三倍的T細(xì)胞的功能陽(yáng)性細(xì)胞的頻率。腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞在刺激的樣品中的頻??率中減去由未刺激樣品的。 0.5％作為判定顯著性的底限。 對(duì)于MHC II類(lèi)阻斷實(shí)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞37℃在20毫克/毫升抗HLA DR，DP，DQ抗體（克隆TU39，從Biolegend公司）溫育30分鐘，或在相關(guān)同種型對(duì)照中溫浴。然后，腫瘤細(xì)胞加入和沒(méi)有附加洗滌的TIL（最終濃度在T細(xì)胞刺中激雞尾酒約為0.5毫克/毫升）到共培養(yǎng)物中。進(jìn)行聚合四聚體（肽-MHC多聚體的PE綴合并在內(nèi)部產(chǎn)生HLA-A2限制性MART-1 / Melan-A衍生肽ELAGIGILTV）和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（CD107a聚乙烯是在此情況下與CD107a FITC替換）染色，評(píng)估MART-1特異性T細(xì)胞產(chǎn)生功能的反應(yīng)的頻率，如先前文獻(xiàn)所述（10）。 在多官能表征實(shí)驗(yàn)（7個(gè)T細(xì)胞功能表征），在共培養(yǎng)基中與自體腫瘤細(xì)胞的孵育時(shí)間被延長(zhǎng)至12個(gè)小時(shí)，以便能夠檢測(cè)早期和晚期的細(xì)胞因子產(chǎn)生。 那里要指出的是用1000UI/毫升的TNF（CellGenix）或100IU / mL的IFNG或兩者都處理72小時(shí)的癌癥細(xì)胞。由于由CD8 + T細(xì)胞的多個(gè)T細(xì)胞功能的同時(shí)陽(yáng)性評(píng)估的高靈敏度，要同時(shí)表達(dá)TNF，IFNG，和CD107a中的至少兩個(gè)功能（雙陽(yáng)性細(xì)胞）被選為總CD8腫瘤反應(yīng)性的量度，以評(píng)價(jià)腫瘤壞死因子（TNF）對(duì)CD8 + T細(xì)胞識(shí)別的影響。 T細(xì)胞反應(yīng)的多官能表征細(xì)胞使用BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀或用5 laser BD LSR II。流式細(xì)胞儀配備了FACS Diva的軟件6.3（BD）。 ELISPOT和細(xì)胞毒性試驗(yàn) 如先前文獻(xiàn)所述（16）進(jìn)行IFNγ ELISPOT實(shí)驗(yàn)。共有3104的TIL（分別是3104 CD8 + T細(xì)胞，3104 CD4 + T細(xì)胞，或1.5104 CD8 +加1.5104 CD4 + T細(xì)胞，使得腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的總量是在每一個(gè)孔相同）和3103癌細(xì)胞加入各孔。一式三份孔進(jìn)行了分析。結(jié)果為在受刺激的孔中IFNγ斑點(diǎn)減去背景。 對(duì)CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的常規(guī)的51 Cr釋放測(cè)定法進(jìn)行如別處（19）中所述。 癌細(xì)胞的分析 MHC表達(dá)分析。半定量測(cè)定癌細(xì)胞的MHC I類(lèi)或II類(lèi)表達(dá)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)染色鑒定，新鮮分離的腫瘤細(xì)胞與抗HLA-ABC或HLA-DP，DR，DQ抗體或同種型對(duì)照，洗滌，在采樣前5分鐘加入2mL的7-AAD到每個(gè)樣品中。用BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，并考慮到不同的自體熒光的個(gè)體細(xì)胞系的電壓參數(shù)，對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行了調(diào)整以獲得27515的APC平均熒光強(qiáng)度（MFI）和655的FITC MFI。 鑒于幾個(gè)腫瘤細(xì)胞株中的非均勻MHC II類(lèi)染色，當(dāng)所研究的抗體樣品染色的MFI超過(guò)同種型對(duì)照至少四倍染色，黑素瘤被確定為MHC II型陽(yáng)性。 細(xì)胞增殖分析 如先前所述（10）使用流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行了評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶消化后，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天（-1day），將黑色素瘤細(xì)胞接種在5至8104 /孔的24孔板中，生長(zhǎng)24小時(shí)后，加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。然后，培養(yǎng)基換成新鮮標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)從對(duì)應(yīng)的患者取得的活化的CD4 + T細(xì)胞上清液的稀釋液，從而使得0.5 mL的終濃度/孔?；€對(duì)照孔在0天用50毫升每孔胰蛋白酶溶液進(jìn)行胰蛋白酶處理，同時(shí)使用含0.05毫克/毫升碘化丙啶（PI; Sigma-Aldrich）250毫升標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基加入到每個(gè)孔中，以排除死細(xì)胞。所得懸浮液在BD的FACSCanto II流式細(xì)胞儀配備有BD FACS裝載機(jī)轉(zhuǎn)盤(pán)，標(biāo)準(zhǔn)的速率下計(jì)數(shù)一定時(shí)間（90秒，高流動(dòng)速率）。在藥物中暴露72小時(shí)后，將其他孔用胰蛋白酶處理和之后的基線對(duì)照孔在相同的工作條件的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。用下列公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制：（T72- T0）/（K72 -T0）100，其中T72是72小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)，T 0是在零時(shí)間對(duì)照的細(xì)胞數(shù)，K72是對(duì)照孔（培養(yǎng)基）72小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)。對(duì)照值被任意設(shè)定為100。低于0表示元細(xì)胞丟失而0到100之間的值表示生長(zhǎng)抑制。 要從激活CD4 + T細(xì)胞得到上清液： 在24孔板中，5106分類(lèi)后的從個(gè)體患者處得到的CD4 + T細(xì)胞和用5105自體IFNγ處理（72小時(shí)）的腫瘤細(xì)胞孵育，每孔總體積1毫升。 24小時(shí)后，收集上清液，用兩個(gè)離心步驟（1,500rpm / 5分鐘）將細(xì)胞洗出，隨后將上清液冷凍保存在-80℃，供以后使用。 RT-PCR技術(shù)。使用根據(jù)制造商的TRIzol試劑（Invitrogen）使用說(shuō)明從樣品中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）。實(shí)時(shí)PCR（qPCR;對(duì)于IDO-1，PDL-1，MLANA，TYR，PMEL，TAPBP，PSMB9，和GAPDH）分析利用了內(nèi)部設(shè)計(jì)的引物和LightCycler Nano instrument（Roche）。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 執(zhí)行了達(dá)戈斯蒂諾皮爾森正態(tài)性檢驗(yàn)檢查值的正態(tài)分布，還有F測(cè)試，以檢查方差齊性。視上面的測(cè)試結(jié)果再作出是否在相關(guān)的數(shù)據(jù)集執(zhí)行參數(shù)或非參數(shù)試驗(yàn)的決定。結(jié)果不同群體之間的比較采用雙側(cè)測(cè)試（或者配對(duì)t檢驗(yàn)，非配對(duì)t檢驗(yàn)，Mann-Whitney檢驗(yàn)，或魏氏配對(duì)測(cè)試）。對(duì)生存分析進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。定性數(shù)據(jù)與Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行了比較。 用對(duì)數(shù)變換的數(shù)據(jù)來(lái)比較組間的差異，用來(lái)分析相對(duì)定量的能力來(lái)表達(dá)單個(gè)T細(xì)胞的功能。對(duì)于qPCR的數(shù)據(jù)，靶基因的Ct被減去GAPDH Ct獲得△Ct。采用配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn)來(lái)比較IFNγ處理的細(xì)胞和培養(yǎng)基，TNF-γ，和TNF+IFNγ-處理細(xì)胞之間的差異。數(shù)據(jù)顯示為相對(duì)于IFNγ處理細(xì)胞(任意設(shè)置值為1)。 在多官能表征實(shí)驗(yàn)（7 T細(xì)胞功能表征），流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)用FlowJo 9（TreeStar Inc.）進(jìn)行初加工。使用順序選通策略直到識(shí)別了使用并行布爾門(mén)（門(mén)僅圍繞應(yīng)答細(xì)胞繪制）分類(lèi)的CD4 +和CD8 + T細(xì)胞細(xì)胞。根據(jù)pestle說(shuō)明，數(shù)據(jù)導(dǎo)出到pestle 1.7并正確格式化。使用SPICE 5.2版本（從http://exon.niaid.nih.gov（20）下載）進(jìn)行分析和介紹結(jié)果。在REP TIL和最低限度的TIL培養(yǎng)的分析中，根據(jù)制造商的說(shuō)明，用Pestle1.7進(jìn)行未刺激樣品減去背景。與此相反，在未培養(yǎng)的TIL的分析中，背景樣品不能被減去，因?yàn)槟[瘤消化不可避免也含有未培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞可以在12小時(shí)的培養(yǎng)中刺激TIL（數(shù)據(jù)未顯示）。至少1％應(yīng)答細(xì)胞在CD4 +或CD8 + T細(xì)胞亞群的閾被接受，這樣背景T細(xì)胞功能的表達(dá)噪聲的影響不會(huì)超過(guò)約30％至40％（從young TIL或REP TIL樣本背景染色中估計(jì)）。雖然有這些閾值，背景事件對(duì)總響應(yīng)的貢獻(xiàn)也許會(huì)相對(duì)高（尤其是對(duì)于CD107a+細(xì)胞，觀察了未刺激的樣品中在最低限度培養(yǎng)的TIL和REP TIL陽(yáng)性細(xì)胞的比例）。分析可能僅在這些情況下進(jìn)行，因?yàn)樵谖磁囵B(yǎng)的TIL中腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞的頻率普遍較低（在5個(gè)病例樣本中分析，11，15，19，24，和25，CD4 + T細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞的平均頻率是2.2％ 1.6％，CD8 + T細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞的平均頻率是5.3％5.1％）。 在SPICE，REP TIL的分析閾值設(shè)定在0.1，而在所有其他的分析中，閾值設(shè)定為0.02。如先前所描述（20），使用Student t檢驗(yàn)和的局部置換檢驗(yàn)進(jìn)行分布的比較。其他統(tǒng)計(jì)分析均采用的GraphPad Prism 5（GraphPad軟件）。 結(jié)果 篩選與自體腫瘤抗原的細(xì)胞反應(yīng)的CD8 +和CD4 + T細(xì)胞 盡管事實(shí)上，體內(nèi)腫瘤的異質(zhì)性可能不能完全通過(guò)短期培養(yǎng)的自體黑素瘤細(xì)胞系體現(xiàn)，但如果能認(rèn)為T(mén)細(xì)胞應(yīng)答直接作用于大多，可能不是全部，可能病人的對(duì)應(yīng)腫瘤抗原，TILs/自體腫瘤細(xì)胞系的共培養(yǎng)能表現(xiàn)出一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)。為了獲得最大的T細(xì)胞反應(yīng)，自體腫瘤用低劑量IFNγ預(yù)處理，我們以前已經(jīng)展示過(guò)這會(huì)增加TIL識(shí)別和反應(yīng)性。此后，腫瘤被暴露在自體腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（10）。 分別在34（89％）和18（53％）患者（圖1A; P = 0.001）中篩選38種體外擴(kuò)大TILs /自體腫瘤，且該腫瘤與特定可檢測(cè)的直接的CD8 +和CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)成堆出現(xiàn)。細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度作為測(cè)量表達(dá)腫瘤壞死因子，IFNG，或CD107a的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）頻率的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度，CD8 +T細(xì)胞中 18％18％（平均值，中位數(shù)為10％），CD4 + T細(xì)胞中4.0％ 9％（平均值，中位數(shù)為0.66％）（圖1B，P <0.0001）。因此，CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答二者比CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答更頻繁而且強(qiáng)烈地出現(xiàn)。 在6個(gè)被分析的樣品中，有6個(gè)樣品腫瘤細(xì)胞上MHC II類(lèi)的的封鎖顯著降低CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)（樣品取自6個(gè)高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答患者），證實(shí)II類(lèi)依賴識(shí)別（圖1C和D）。 高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的存在（14例，確定在整個(gè)CD4 + T細(xì)胞亞群具有至少2％的細(xì)胞響應(yīng)自體腫瘤）不與TIL中的CD4 + T細(xì)胞的較高頻率有關(guān)（圖1E）。這可能表明，在體內(nèi)CD4 + T細(xì)胞浸潤(rùn)的量值，這很可能反映在擴(kuò)增TIL細(xì)胞中的CD4 / CD8 T細(xì)胞比率，并不與CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答存在有關(guān)，而是與大多數(shù)代表非腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞的CD4+ TIL有關(guān)。值得注意的是，我們以前已經(jīng)表明，非腫瘤相關(guān)病毒特異性CD8 + T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境（21）的高頻存在。 另外，高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)的患者的CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的特性與無(wú)或低CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的患者（圖1F和補(bǔ)充圖S1）并沒(méi)有顯著不同。 高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)（利用流式細(xì)胞儀）的患者的在擴(kuò)增的TIL上FoxP3的表達(dá)的分析顯示，在解凍后立即染色TIL CD4 +和CD8 +都相對(duì)較高的組分，呈陽(yáng)性。不過(guò)，在IL2缺失的培養(yǎng)基7天后FoxP3的表達(dá)完全喪失（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，我們將此FoxP3的臨時(shí)表達(dá)解釋為體外培養(yǎng)條件所引起的高T細(xì)胞活化的作用，而不是與經(jīng)典的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能相關(guān)聯(lián)。 圖1：對(duì)黑色素瘤CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)。A，具有對(duì)自體黑色素瘤細(xì)胞系CD4+或CD8+ TIL細(xì)胞應(yīng)答患者的頻率。B，對(duì)自體黑色素瘤細(xì)胞系有CD8+或CD4+ 腫瘤應(yīng)答的TIL的頻率。腫瘤細(xì)胞在與TIL共培養(yǎng)前用100 IU/mL IFNγ預(yù)處理，在材料和方法說(shuō)明過(guò)。腫瘤應(yīng)答細(xì)胞表達(dá)以下至少一個(gè)T細(xì)胞的功能：TNF，IFNγ，或CD107a。線條顯示中值。C和D，MHC II類(lèi)對(duì)腫瘤靶細(xì)胞阻斷后CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF。C，在六個(gè)類(lèi)似的結(jié)果中一個(gè)代表性的樣本，CD4+ T細(xì)胞門(mén)控。線在D中顯示中位值。E，高或無(wú)/低CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)的患者的CD4+ T細(xì)胞的在所有TIL細(xì)胞中的頻率。線顯示平均值。F，在高或無(wú)/低CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)的患者中，腫瘤應(yīng)答CD8+ T細(xì)胞的頻率。線顯示平均值。 MHC II類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞株中的表達(dá) 之前的研究表明，在43%黑色素瘤細(xì)胞株MHC II類(lèi)分子組成型表達(dá)，而且絕大多數(shù)暴露在IFN-γ-a細(xì)胞因子的黑色素瘤（> 70%）表達(dá)II類(lèi)，而在腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ-a細(xì)胞因子可能是高水平，與CD8+ T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)密切相關(guān)（1）。 38例黑色素瘤中19例（50%）組成表達(dá)MHC II類(lèi)分子（表1和圖2A）。在IFNγ處理后，的MHC II型陽(yáng)性和陰性腫瘤的MHC II類(lèi)表達(dá)相對(duì)倍（數(shù)據(jù)未顯示）和高或無(wú)/低CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)的MHC II類(lèi)表達(dá)相對(duì)倍（補(bǔ)充圖S2A）是相似。在19個(gè)組成II類(lèi)陰性腫瘤只有3個(gè)IFNγ處理后在不表達(dá)MHC II類(lèi)分子。 為了弄清MHC II類(lèi)的異常表達(dá)是否轉(zhuǎn)移性黑素瘤的特異事件，兩種來(lái)自原發(fā)黑素瘤（WM-115和FM-55-P）細(xì)胞系進(jìn)行MHC表達(dá)特征檢測(cè)。兩種細(xì)胞系MHC I類(lèi)表達(dá)都表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)移性起源細(xì)胞相比類(lèi)似的模式（組成性表達(dá)，IFNγ處理后表達(dá)增強(qiáng)）。 WM-115 MHC II類(lèi)組成性陽(yáng)性，而FM-55-P為陰性，并且暴露于IFNγ之后兩個(gè)染色后為陽(yáng)性（WM-115具有增加的表達(dá)）（數(shù)據(jù)未顯示）。對(duì)兩個(gè)附加的細(xì)胞系，來(lái)自同一患者FM-55的單獨(dú)的轉(zhuǎn)移灶（FM-55-P代表原發(fā)黑素瘤），即FM-55-M1和FM-55-M2，進(jìn)行了分析。都顯示沒(méi)有MHC II類(lèi)組成型表達(dá)（但在IFNγ處理后有），正像他們的對(duì)應(yīng)起源。 為了擴(kuò)展分析和證實(shí)我們的結(jié)果，對(duì)ESTDAB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）進(jìn)行了檢查。事實(shí)上，我們對(duì)WM-115和FM-55-P組成型表達(dá)的數(shù)據(jù)匹配ESTDAB的報(bào)告。此外，據(jù)報(bào)道在兩個(gè)自于初級(jí)黑素瘤（WM-75和WM-793）其它細(xì)胞系中有兩個(gè)組成型表達(dá)至少一種II類(lèi)MHC同種型，正如WM-266-4一樣，是一個(gè)起源于我們分析的一個(gè)患者的一個(gè)轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞系，這個(gè)患者的轉(zhuǎn)移灶在建立初級(jí)細(xì)胞系（WM-115）的18個(gè)月后診斷出。這些結(jié)果證實(shí)了以前布洛克爾和他的同事（22）的原位數(shù)據(jù)，并表明活化MHC II類(lèi)的組成型表達(dá)可能在黑素瘤是非常早期的事件。 CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答和MHC II類(lèi)的組成型表達(dá)的關(guān)聯(lián) 為了表征MHC II類(lèi)的組成型腫瘤表達(dá)是否與在TIL中CD4 +腫瘤特異性T細(xì)胞增加的頻率相關(guān)聯(lián)，我們?cè)谄ヅ涞臉颖荆〝U(kuò)增的TIL）中檢查CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答。 在腫瘤組成表達(dá)MHC II類(lèi)中的TIL中檢測(cè)到較高的腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答頻率（II類(lèi)組成型陽(yáng)性：平均7.5％11％ vs. II類(lèi)組成陰性1％1％；P = 0.002；高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)在12/ 19 II類(lèi)組成型陽(yáng)性腫瘤vs. 2/19 II類(lèi)組成型陰性的腫瘤；P = 0.002；圖2B；表1）。在所有的情況下，腫瘤識(shí)別實(shí)驗(yàn)在IFNγ預(yù)處理后進(jìn)行，如果腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞存在，使得最終能檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)，因?yàn)榻^大部分腫瘤高水平表達(dá)MHCII分子無(wú)論MHCII分子組成性陽(yáng)性（如上）。 這些數(shù)據(jù)表明，II型表達(dá)是一個(gè)早期事件經(jīng)常隨后出現(xiàn)腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞的浸潤(rùn)。然而，這不是一個(gè)絕對(duì)的要求，因?yàn)樵谀承┙M成型II類(lèi)表達(dá)的黑素瘤中沒(méi)有強(qiáng)CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答出現(xiàn)（7/19; 37％）表明，這是不夠的，并且在沒(méi)有組成型II類(lèi)表達(dá)的兩種黑素瘤高頻中存在CD4 +T細(xì)胞反應(yīng)（Pt.24和Pt. 25; 2/19; 10.5％）表明這不是強(qiáng)制性的。 特別令人感興趣的，我們的隊(duì)列中兩個(gè)樣品（Pt.30和Pt.35）由來(lái)自同一患者（表1）但不同時(shí)間。第一次轉(zhuǎn)移（命名為Pt.30）切除后進(jìn)行TIL試驗(yàn)（clinicaltrials.gov identifier：NCT00937625）。不久之后，病人被注入擴(kuò)增的TIL，此治療導(dǎo)致> 80％所有先在腫瘤病灶的的復(fù)原，但有新的轉(zhuǎn)移病灶出現(xiàn)在第一評(píng)價(jià)（數(shù)據(jù)未顯示）。這種病變繼續(xù)增長(zhǎng)，在輸液TIL 約6個(gè)月后，切除（命名為Pt.35）。如表1中所示，這兩種細(xì)胞系均組成表達(dá)MHC II類(lèi)，但只有難以治療的和漸進(jìn)轉(zhuǎn)移性病灶被腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞浸潤(rùn)，并且高頻出現(xiàn)（表1）。這是一個(gè)有趣的觀察軼事，表明腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的浸潤(rùn)，可以進(jìn)行時(shí)空動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，并且與腫瘤細(xì)胞中無(wú)明顯MHC II類(lèi)表達(dá)變化的疾病進(jìn)展有關(guān)。 圖2：在黑色素瘤細(xì)胞MHC I類(lèi)和II類(lèi)表達(dá)和與CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的相關(guān)性。 A，在兩個(gè)具有代表性的患者（組成型II類(lèi)陽(yáng)性或MHC組成陰性的黑素瘤）的MHC II類(lèi)分子（HLA DP，DR，DQ）表達(dá)在任何一個(gè)第二類(lèi)陽(yáng)性黑素瘤一個(gè)。虛線，同型控制；灰色實(shí)線，組成型表達(dá)；黑色實(shí)線，預(yù)處理IFNγ100IU / mL的72小時(shí)后的表達(dá)。B，MHC II類(lèi)分子的組成性表達(dá)腫瘤響應(yīng)CD4 + T細(xì)胞的患者的的頻率。線顯示中值。 C和D中，高或無(wú)/低CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的患者黑色素瘤細(xì)胞系的相對(duì)組成型或IFNγ誘導(dǎo)的I類(lèi)表達(dá)。線表示平均值。 CD4 +和CD8 + T細(xì)胞對(duì)黑素瘤反應(yīng)的多官能表征 為了確定CD4 +和CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的潛在功能模式，我們從8例中選擇在兩個(gè)亞群中都有強(qiáng)應(yīng)答（>2％ CD4 +或CD8 +門(mén)控的TIL同時(shí)表達(dá)TNF和IFNG，和至少10％的CD4 +和/或CD8 + T細(xì)胞亞群頻率；從Pts.1，5，11，15，18，19，24，和25）的TIL，并進(jìn)行基于七個(gè)不同的已知抗腫瘤活性的多官能的效應(yīng)器功能分析，為了確定相關(guān)的T細(xì)胞亞群的反應(yīng)病人自身的變異性。 為了確定表達(dá)T細(xì)胞功能的相對(duì)定量的能力，我們比較了腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞的MFI。利用CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的嚴(yán)格的選通策略，僅通過(guò)有反應(yīng)的T 細(xì)胞（T 細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性）對(duì)腫瘤活性的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 圖3: 對(duì)黑素瘤CD4 +和CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的多官能表征。A. 來(lái)自腫瘤反應(yīng)性CD4 +和CD8 + T細(xì)胞七個(gè)個(gè)體 T細(xì)胞的功能的表達(dá)的半定量比較，對(duì)于任何單獨(dú)的T細(xì)胞的功能，在條形圖顯示出相對(duì)表達(dá)值用下述式得到：100 / [（全部CD4 + T細(xì)胞表達(dá)的刺激樣品中的單個(gè)功能的MFI /未刺激的CD4 + T細(xì)胞的MFI） /（全部CD8 + T細(xì)胞表達(dá)的各個(gè)功能的刺激樣品中的MFI /未刺激的CD8 + T細(xì)胞的MFI）。值超過(guò)1，所述個(gè)體的T細(xì)胞的功能主要是由CD8 + T細(xì)胞表達(dá)（例如，在細(xì)胞因子的情況下，產(chǎn)生細(xì)胞因子的單細(xì)胞水平CD8 + T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子比產(chǎn)生細(xì)胞因子的CD4 + T細(xì)胞更多）。 值低于1的，所述個(gè)體的T細(xì)胞的功能主要由CD4 + T細(xì)胞表達(dá)。 B，CD4或CD8 T細(xì)胞亞群的細(xì)胞依據(jù)表達(dá)的分析七T細(xì)胞功能中的至少一個(gè)進(jìn)行門(mén)控，和細(xì)胞表達(dá)的任何的七個(gè)細(xì)胞功能的頻率進(jìn)行了評(píng)估。圖表明，絕大多數(shù)的腫瘤響應(yīng)的CD4 + T細(xì)胞（即，表達(dá)的7種 T細(xì)胞功能中的至少一種）也產(chǎn)生TNF。柱表示平均值誤差線。 C和D，SPICE的T細(xì)胞的功能分析細(xì)胞表達(dá)的7 種T細(xì)胞功能中的至少一個(gè)的分析表明CD4 +和CD8 + T細(xì)胞非常不同的功能模式。 ＃，P <0.05。 這些分析顯示了在單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上， CD4 + T細(xì)胞能更多產(chǎn)生TNF（補(bǔ)充圖S3）和IL2的固有能力，但是相對(duì)于IFNγ，MIP-1α和MIP-1β的生產(chǎn)（圖3A）的。另一方面，從僅1例CD4 + T細(xì)胞群中檢測(cè)到IL17A產(chǎn)生，CD8 + T細(xì)胞中沒(méi)有，而CD107a動(dòng)員與CD8 + T細(xì)胞活性（圖3A）更加相關(guān)聯(lián)。概括地說(shuō)，單個(gè)產(chǎn)生TNF的 CD4 + T細(xì)胞平均產(chǎn)生的TNF，比單個(gè)產(chǎn)生TNF CD8 + T細(xì)胞得多。IL2的生產(chǎn)量也類(lèi)似，但如預(yù)期的， CD107a動(dòng)員的結(jié)果與之相反。 隨后，至少產(chǎn)生七個(gè)T細(xì)胞功能中一種的細(xì)胞的相對(duì)比例的選擇性分析顯示CD4 + T細(xì)胞向產(chǎn)生陽(yáng)性腫瘤壞死因子（TNF）（圖3B）顯著歪斜。的確，85％C的至少產(chǎn)生一種D4 + T細(xì)胞功能的細(xì)胞都表達(dá)出TNF生產(chǎn)。因此， TNF的產(chǎn)生似乎是CD4 + T細(xì)胞必須滿足的一個(gè)必要條件，以對(duì)黑素瘤產(chǎn)生直接響應(yīng)。這與過(guò)去在相同的TIL產(chǎn)品中被觀察到的CD8 + T細(xì)胞有很大不同，只有約50％的應(yīng)答細(xì)胞產(chǎn)生陽(yáng)性腫瘤壞死因子TNF（圖3B）。其他T細(xì)胞的功能，除了CD8 + T細(xì)胞IFNγ生產(chǎn)（僅觀察到趨勢(shì)），反映了定量表達(dá)評(píng)估的結(jié)果。的確，我們觀察到MIP-1A-和MIP-1b產(chǎn)生細(xì)胞的相似頻率，CD4 + T細(xì)胞表達(dá)IL-2的比例略高，但十分顯著的是，更多CD8 + T細(xì)胞動(dòng)員CD107a（圖3B）。在全球范圍內(nèi)，這些結(jié)果表明，無(wú)論CD4 + T細(xì)胞表達(dá)哪種功能，TNF的產(chǎn)生似乎是普遍的。 SPICE（Simplified Presentation of Incredibly Complex Evaluations）是一種新型的生物信息學(xué)工具，通過(guò)組合布爾門(mén)控和復(fù)雜算法的數(shù)據(jù)分析（20，23），允許在眾多不同的細(xì)胞群（未被經(jīng)典順序選通策略證明）中T細(xì)胞效應(yīng)子功能的多樣“模式”的深度檢測(cè)，。為此目的，我們已經(jīng)利用SPICE T細(xì)胞應(yīng)答的質(zhì)量監(jiān)督進(jìn)行了樣品分析。 復(fù)雜功能模式分析表明擴(kuò)增CD4 +和CD8 + T細(xì)胞對(duì)自體黑色素瘤的反應(yīng)之間有強(qiáng)烈的病人自身差異（P = 0.0006）。再次確認(rèn)了CD4 + T細(xì)胞顯著向TNF生產(chǎn)傾斜，特別是超過(guò)50％產(chǎn)生可檢測(cè)的響應(yīng)的CD4 + T細(xì)胞的僅產(chǎn)生TNF，而CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)出現(xiàn)更復(fù)雜，多功能，且大多是基于IFNγ生產(chǎn)或CD107a動(dòng)員（圖3C和D）。補(bǔ)充圖S4表示SPICE數(shù)據(jù)分析的圖形，以條形圖表示的T細(xì)胞功能（n=128）中的所有可能的組合（補(bǔ)充圖S4A），CD4 +的（補(bǔ)充圖S4B），或CD8 +（補(bǔ)充圖S4C）T細(xì)胞的NPLot或CoolPlot（補(bǔ)充圖S4D） 由于技術(shù)的復(fù)雜性和所需的描述的實(shí)驗(yàn)大量TIL樣品的可用性，擴(kuò)增的TIL如前面所說(shuō)被用于實(shí)驗(yàn)。然而，我們不知道在幾次對(duì)數(shù)擴(kuò)增中觀察到的功能的模式被是否保持。因此，我們進(jìn)行了最小擴(kuò)增的TIL以及未培養(yǎng)的TIL類(lèi)似分析，和與來(lái)自相同的病人的擴(kuò)增TIL的結(jié)果比較。我們進(jìn)行了7種T細(xì)胞的功能的實(shí)驗(yàn)，但如具有擴(kuò)增的TIL，只有少數(shù)的T細(xì)胞表達(dá)IL2，IL17A，MIP-1α，或MIP-1β（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，只分析了三個(gè)功能（TNF，IFNG，和CD107a）。 記住在未培養(yǎng)的TIL的分析中潛在的技術(shù)缺陷（參見(jiàn)材料和方法/統(tǒng)計(jì)分析），該分析顯示出所有TIL分析中觀察到的類(lèi)似模式。密切的相似性與以往擴(kuò)增的TIL多功能結(jié)果。實(shí)際上，當(dāng)在每個(gè)類(lèi)型的TIL培養(yǎng)物中CD8 + T與CD4 + T細(xì)胞亞群相比較時(shí)，觀察到在CD4 + T細(xì)胞中TNF產(chǎn)生細(xì)胞的比例較高（補(bǔ)充圖S5A）。此外，CD4 + T細(xì)胞和CD8 + T細(xì)胞的模式是不同類(lèi)型的TIL培養(yǎng)的（補(bǔ)充圖S5A和S5B），補(bǔ)充圖S6顯示了每個(gè)單獨(dú)患者T細(xì)胞功能模式，再次示出不同類(lèi)型的TIL culture之間密切的病人自身相似之處. 這樣，我們的結(jié)論是，在體外在擴(kuò)增的TIL中觀察的CD4 +和CD8 + T細(xì)胞亞群之間的主要功能差異在體內(nèi)擴(kuò)增時(shí)是穩(wěn)定的，從而反映在腫瘤微環(huán)境的T細(xì)胞反應(yīng)。 在一個(gè)不同的說(shuō)明，似乎比例較高CD107a細(xì)胞隨著IFNg細(xì)胞的比例較低存在于未培養(yǎng)TIL（補(bǔ)充圖S5A和S5B）。然而，考慮到進(jìn)行分析的患者數(shù)少，以及在未培養(yǎng)的TIL的分析技術(shù)問(wèn)題（參見(jiàn)材料和方法/統(tǒng)計(jì)分析），這偶然觀察到的事件需要進(jìn)一步的調(diào)查，但它不改變整體的結(jié)論，即CD4 + T細(xì)胞產(chǎn)生更多的腫瘤壞死因子，未培養(yǎng)的TIL也相同。 TNF對(duì)CD8 + T細(xì)胞識(shí)別的影響 因?yàn)槲覀兊臄?shù)據(jù)表明，腫瘤壞死因子的產(chǎn)量為黑素瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的主要效應(yīng)器功能，所以我們想知道自身黑素瘤暴露于TNF是否可以影響被擴(kuò)增的CD8 TIL所識(shí)別。為此，用TNF，IFNG，或兩者TNF和IFNG同時(shí)處理黑素瘤細(xì)胞。為了再現(xiàn)一個(gè)具有較強(qiáng)的CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答，CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答或兩者的腫瘤微環(huán)境，在先前的SPICE分析的基礎(chǔ)上這個(gè)被選擇。 圖4: 細(xì)胞因子對(duì)腫瘤識(shí)別的CD4 +和CD8 +腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的影響。 A，腫瘤壞死因子減少腫瘤的識(shí)別MART-1特異性CD8 +腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞沒(méi)有顯著改變腫瘤識(shí)別其他特定的CD8 +腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。 FACS圖細(xì)胞因子表達(dá)從三個(gè)具有相似結(jié)果測(cè)試的代表性患者示于該圖。 B，暴露于IFNγ，TNF或TNF和IFNG同時(shí)對(duì)腫瘤的識(shí)別大量CD8 +腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的影響。線顯示CD8 +的TIL的頻率同時(shí)表達(dá)TNF，IFNγ，和CD107a中的至少兩個(gè)功能的平均值。 C和D，IFNγ，TNF或TNF及IFNγ對(duì)腫瘤識(shí)別大量CD4 +的TIL同時(shí)暴露的影響。線顯示平均值，P <0.05，P <0.01。 蘭茨貝格和他的同事（24）先前已經(jīng)證明，腫瘤壞死因子誘導(dǎo)黑素瘤可逆去分化并減少了T細(xì)胞識(shí)別黑色素瘤分化抗原（MDA）。T細(xì)胞應(yīng)答的分析顯示，如預(yù)期，腫瘤壞死因子顯著降低MDAs的識(shí)別（圖4A和補(bǔ)充圖的S7-數(shù)字代表不同患者，實(shí)驗(yàn)使用來(lái)自三個(gè)不同患者樣品并獲得類(lèi)似的結(jié)果；數(shù)據(jù)未示出）。然而，TNF沒(méi)有顯著影響球型CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)性（圖4A和B）。正如所料，IFNγ并不顯著增加球型CD8 +和CD4 + T細(xì)胞的反應(yīng)性（圖4B-D和補(bǔ)充圖S8），如先前由我們的組（10）所證明的。值得注意的是，它也同樣被證明，IFNγ既不增加也不減少由MDA-特定細(xì)胞進(jìn)行的自體或異體腫瘤識(shí)別，如CD8 + T細(xì)胞識(shí)別MART-1EAA或GP-100YLE肽（10） - 盡管在這種情況下，因?yàn)镮FNγ誘導(dǎo)從蛋白酶到免疫蛋白酶轉(zhuǎn)變（25，26），所以仍然未完全闡明，這種影響是否是抗原類(lèi)特定的或肽特異性，。 令人驚奇的是，暴露于TNF顯著降低IFNγ介導(dǎo)的CD8 + T對(duì)黑素瘤細(xì)胞反應(yīng)的增加（圖4B和補(bǔ)充圖S8）。另一方面，TNF與未經(jīng)處理的腫瘤（圖4C和D）相比能增加（盡管不是顯著）CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答。 這些數(shù)據(jù)表明，一方面TNF趨于依照正反饋機(jī)制略微擴(kuò)增本身（暴露于TNF的腫瘤增加從CD4 + T細(xì)胞的TNF產(chǎn)生），但在另一方面，它抑制了在IFNγ富腫瘤微環(huán)境中CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)性，并且這種抑制與強(qiáng)CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)的存在同時(shí)發(fā)生。 TIL對(duì)黑色素瘤細(xì)胞基因表達(dá)的影響 為了闡明所觀察到對(duì)CD8 + T細(xì)胞對(duì)腫瘤識(shí)別的影響是否與基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)，對(duì)與免疫識(shí)別有關(guān)的一組基因通過(guò)qPCR在八個(gè)細(xì)胞系中進(jìn)行分析（來(lái)自Pt. 1，5，11，13，15 ，17，18，和19）。除了眾所周知的IFNγ對(duì)免疫抑制基因表達(dá)的有增加影響，也能提高TNF提高表達(dá)基因的表達(dá)，例如吲哚胺2,3雙加氧酶-1（IDO-1）或程序??性死亡配體 - 1（PD-L1）約5至10倍（補(bǔ)充圖S9A）。此外，MDAs的表達(dá)下降趨勢(shì)被證實(shí)（補(bǔ)充圖S9B）。另一方面，在加入TNF到2至5倍觀察到MHC I類(lèi)處理和呈遞途徑的表達(dá)趨勢(shì)傾向增加，但尤其是IFNγ本身相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)增加約10 f倍（補(bǔ)充圖S9C）。 這些數(shù)據(jù)可能表明，在IFNγ富含腫瘤微環(huán)境中，腫瘤壞死因子通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫能力的增強(qiáng)降低黑素瘤免疫敏感性。 圖5: 腫瘤響應(yīng)CD4 + T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞或CD8 IFNγ應(yīng)答的影響。A，來(lái)自對(duì)自體增殖的黑色素瘤細(xì)胞高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的患者的活化CD4 + T細(xì)胞的上清液的的影響。點(diǎn)為有誤差棒的平均值。 B，來(lái)自高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答患者的CD8 +或CD4 +腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的自體腫瘤細(xì)胞毒性。 CD4 + T細(xì)胞培養(yǎng)物中顯示灰色，CD8 + T細(xì)胞以黑色顯示。 C和D，分選后的 CD8 +，CD4 +或CD8 +和CD4 +合并的TIL的IFNG ELISPOT分析。 C和D，從個(gè)別患者的結(jié)果（平均一式三份的觀察及誤差棒的; C）中，而D顯示來(lái)自一個(gè)有代表性的患者的ELISPOT孔中。 瘤特異性CD4 + T細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和生存力或?qū)Χ唐诘腃D8 IFNγ反應(yīng)的腫的影響 為了表征CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答是否會(huì)影響黑色素瘤細(xì)胞的增殖或存活，我們進(jìn)行了附加的增殖和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 自體腫瘤與來(lái)自6例上述（與自體腫瘤同時(shí)激活）的高水平CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)性（Pts.1，5，11，15，18，和19）患者的分好類(lèi)的CD4 + T細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液培養(yǎng)72小時(shí)，并如前述以標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞增殖（10）。只有2個(gè)6黑色素瘤細(xì)胞系中有意義的CD4 + T細(xì)胞的上清液增殖（圖5A）是明顯的。 CD4 + T細(xì)胞對(duì)黑色素瘤的直接細(xì)胞毒活性已在先前小鼠實(shí)驗(yàn)中證明。為了評(píng)估是否腫瘤細(xì)胞毒性CD4 + T細(xì)胞可在人類(lèi)中被檢測(cè)到，對(duì)分類(lèi)后的CD4 +或CD8 + T細(xì)胞來(lái)自5名高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)患者（Pts. 1，5，11，15，和19）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。在4/5的案例中CD8 + T細(xì)胞顯示殺死自體腫瘤的能力，而CD4 + T細(xì)胞在任何情況下沒(méi)有顯示出（圖5B）。 這些結(jié)果表明，在免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)似乎不具有直接強(qiáng)烈的抗腫瘤活性。 評(píng)估CD4 +和CD8 + T細(xì)胞生產(chǎn)IFNγ是否其他細(xì)胞亞群的存在的影響和/或CD4 + T細(xì)胞的存在是否可以增強(qiáng)的CD8應(yīng)答，進(jìn)行來(lái)自6個(gè)高CD4 + T細(xì)胞的反應(yīng)性患者（Pts.1，5，11，15，18，和19）的CD8 + T細(xì)胞加入CD4 +，CD8 +或CD4 +和CD8 +一起的ELISPOT分析。添加兩種細(xì)胞亞群獲得IFNγ特定斑點(diǎn)的數(shù)目與單獨(dú)的任一CD4 +或CD8 + T細(xì)胞獲得的斑點(diǎn)數(shù)的平均值是大概一致的，和沒(méi)有觀察到增加效應(yīng)（圖5C和D）。因此，我們的結(jié)論是，在短期測(cè)定法中關(guān)于腫瘤識(shí)別和相對(duì)IFNγ生產(chǎn)CD4 +和CD8 + T細(xì)胞似乎不相互作用或影響彼此。 組成型和高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)患者的結(jié)果 最后，我們?cè)噲D評(píng)估在擴(kuò)增的TIL是否高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答，組成型II類(lèi)陽(yáng)性，或高CD4 /的CD8 T細(xì)胞比率（后者具有較多病例）的存在與已知的黑色素瘤或患者的生存預(yù)后相關(guān)聯(lián)因素。血漿乳酸脫氫酶（LDH）被選擇用于實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗壳按碓谵D(zhuǎn)移性黑色素瘤的最準(zhǔn)確的預(yù)后循環(huán)標(biāo)記物的。 并沒(méi)有觀察到血漿LDH水平巨大差異（補(bǔ)充圖S10A和S10E），除了在較高的LDH值、無(wú)MHC II類(lèi)組成腫瘤患者（補(bǔ)充圖S10C）。在患者組（補(bǔ)充圖S10B，S10D，與S10F）之間，總生存期無(wú)顯著差異。同時(shí)考慮到數(shù)量相對(duì)較少的患者，這些數(shù)據(jù)表明，檢查的因素不是黑色素瘤強(qiáng)有力的獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。 討論 有在人類(lèi)轉(zhuǎn)移性黑素瘤中由CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答介導(dǎo)的腫瘤消退軼事的病例被報(bào)告（8，9，27）。然而，很少有人知道在腫瘤微環(huán)境，如何生成天然效應(yīng)子CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答，CD4 + T細(xì)胞是如何影響CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)。 MHC II類(lèi)的組成型表達(dá)通常僅限于專(zhuān)業(yè)抗原提呈細(xì)胞（APC;參考28）。然而，以往的研究表明，MHC II類(lèi)的黑色素瘤的組成型表達(dá)通過(guò)II類(lèi)反式（CIITA）的異常轉(zhuǎn)錄可能不是一個(gè)隨機(jī)事件，而是與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)（29）。 CIITA活化本身并沒(méi)有參與腫瘤發(fā)展（30），這表明它的異常誘導(dǎo)是靠一個(gè)依賴于MHC II類(lèi)表達(dá)的更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)發(fā)起和維持。 在這項(xiàng)研究中，我們已經(jīng)表明，盡管不是必要的或足夠的，在黑色素瘤細(xì)胞MHC II類(lèi)的從頭組成型表達(dá)是一個(gè)功能強(qiáng)大的刺激，以促進(jìn)腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的積累。我們的數(shù)據(jù)表明，據(jù)推測(cè)，局部黑素瘤已經(jīng)發(fā)生在早期階段。 CD4 + T細(xì)胞直接識(shí)別黑素瘤的表面上呈現(xiàn)相關(guān)聯(lián)地MHC II類(lèi)分子的腫瘤抗原，并執(zhí)行由TNF產(chǎn)生支配效應(yīng)子功能。事實(shí)上，內(nèi)源性蛋白可以通過(guò)自噬和/或非經(jīng)典的抗原加工（31，32）被呈現(xiàn)在II類(lèi)。 我們已經(jīng)表明，通過(guò)腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)子功能不顯著影響黑素瘤增殖或生存力，與CD8 + T細(xì)胞的同時(shí)有效的細(xì)胞毒性。這意味著，細(xì)胞擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)條件下，至少在大多數(shù)情況下，腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的直接的抗腫瘤活性不是很有效地限制黑素瘤的體外生。這可能反映了體內(nèi)大多數(shù)腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞這個(gè)條件是不能夠介導(dǎo)直接的有力的抗腫瘤作用。 以前的研究表明黑素瘤腫瘤的長(zhǎng)期暴露于TNF的有害作用。蘭茨貝格和他的同事（24）已經(jīng)表明，以下的TNF-豐富的炎性環(huán)境可以降低免疫原性和通過(guò)誘導(dǎo)可逆的去分化促進(jìn)黑色素的免疫逃逸。在這項(xiàng)研究中，我們已經(jīng)證實(shí)，黑色素瘤在局部的TNF的慢性暴露下調(diào)MDA-特異性CD8 + T細(xì)胞的識(shí)別。然而，使用批量TIL培養(yǎng)的時(shí)候，非常有趣的是，暴露前腫瘤壞死因子并沒(méi)有顯著影響CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)。這可能表明，MDA??特異性T細(xì)胞對(duì)總CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)性的貢獻(xiàn)比較小。 與此相反，暴露于TNF能顯著降低眾所周知IFNγ介導(dǎo)增加的CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)對(duì)黑素瘤的。這表明，在一個(gè)IFNγ豐富的環(huán)境，例如含IFNγ產(chǎn)生CD8 + T細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境，來(lái)自腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞（或其他來(lái)源）的TNF可能降低CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)性，并通過(guò)正反饋的T細(xì)胞反應(yīng)同步增加CD4 +，從而擴(kuò)增本地TNF信號(hào)。 嘗試表征導(dǎo)致所觀察到的現(xiàn)象的分子事件，我們分析一組能夠通過(guò)影響對(duì)黑素瘤免疫敏感性的基因的表達(dá)。雖然IDO-1和PD-L1的誘導(dǎo)證明了進(jìn)一步增加腫瘤細(xì)胞的免疫抑制能力，并且TNF的加入降低MDA基因的表達(dá)，與MHC I類(lèi)抗原加工和呈遞途徑相關(guān)聯(lián)的其他基因似乎也被誘導(dǎo)。盡管困難量化不同免疫活化/免疫抑制途徑的相對(duì)貢獻(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的增加的免疫抑制能力可能解釋了在實(shí)驗(yàn)中觀察到的免疫靈敏度減少。 有趣的是，這些數(shù)據(jù)支持一個(gè)腫瘤進(jìn)展模型: 為了逃避有效的CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)，一些黑色素瘤激活CIITA因此組成型表達(dá)MHC II類(lèi)。反過(guò)來(lái)在腫瘤微環(huán)境募集了通過(guò)TNF的產(chǎn)生抑制CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞。 值得注意的是，MHC II類(lèi)與其他腫瘤相關(guān)的免疫抑制分子有幾個(gè)共同的特點(diǎn)，例如，氧酶和PD-L1上。事實(shí)上，如本和幾個(gè)其他研究中，MHC II類(lèi)的異常在某些黑素瘤被激活，并完全和IDO和PD-L1相同（33，34），它是由IFNγ介導(dǎo)的免疫應(yīng)答上調(diào)的。因此，在黑色素瘤原位檢測(cè)的MHC II類(lèi)的可表示在黑色素瘤細(xì)胞組成型表達(dá)或被誘導(dǎo)IFNγ分泌細(xì)胞（例如，腫瘤抗原特異性CD8 + T細(xì)胞），或兩者??的存在。 迄今許多其它逃避CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制已被表征（35）。 CD8 + T細(xì)胞識(shí)別與MHC I類(lèi)分子表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的表面上的相關(guān)聯(lián)的腫瘤抗原。因此，在I類(lèi)抗原加工和呈遞途徑的缺陷，以及I類(lèi)MHC分子下調(diào)可能本身抑制CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答。事實(shí)上，幾個(gè)研究已經(jīng)證明，I類(lèi)分子表達(dá)的下調(diào)與幾種預(yù)后較差的實(shí)體腫瘤相關(guān)聯(lián)，包括黑色素瘤（5）。 有趣的是，在這項(xiàng)研究中的那些未吸引強(qiáng)CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的黑素瘤響應(yīng)于IFNγ顯示MHC I類(lèi)的一個(gè)有缺陷的上調(diào)。這確實(shí)可能被解釋為額外的免疫逃逸機(jī)制，從而暗示腫瘤兩個(gè)不同亞群的存在：（i）高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答（在大多數(shù)情況下，由第II類(lèi)的從頭組成性表達(dá)引起）和正常 I類(lèi)黑素瘤接觸IFNγ后上調(diào); （ⅱ）有響應(yīng)于IFNγ缺陷的I類(lèi)上調(diào)的黑素瘤不吸引強(qiáng)CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答。根據(jù)這個(gè)模型，二者黑素瘤答要么間接地通過(guò)炎性CD4 + T細(xì)胞的吸引力（黑素瘤亞群i）中，或直接通過(guò)I類(lèi)MHC（黑素瘤亞群ⅱ）的有缺陷的上調(diào)有效地下調(diào)CD8 + T細(xì)胞應(yīng)。 作為這一理論的間接確認(rèn)，強(qiáng)CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答（或具有組成型MH C II類(lèi)陽(yáng)性的腫瘤）患者似乎沒(méi)有比無(wú)CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)的患者具有更差的預(yù)后。后者表達(dá)一個(gè)普遍有缺陷的上調(diào)的MHC I類(lèi)分子。 在我們的研究中，絕大多數(shù)病人（85％）被確診為AJCCⅣ期黑色素瘤（向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。然而，我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈的CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)在有3/6例早期疾病階段（IIIB / IIIC）。如由最近的一項(xiàng)研究（36），在執(zhí)行及時(shí)完整切除局部黑色素瘤的情況下，局部免疫反應(yīng)的影響則與臨床結(jié)果無(wú)關(guān)。相比之下腫瘤固有特征可能決定了患者是否很快會(huì)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，更可能的是我們的觀察可以被應(yīng)用到完全切除是不可行的疾病階段。 應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，盡管CD4 + T細(xì)胞天然對(duì)黑素瘤原位的響應(yīng)和相關(guān)慢性暴露于TNF可以減少在大多數(shù)情況下（即，大多數(shù)腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞）的抗腫瘤CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)，如最近由Tran和他的同事（37）在膽管癌中（即，多官能性突變的抗原特異性CD4 + T細(xì)胞）或由以前單一的病例報(bào)告（9，27），這不排除選擇CD4 + T細(xì)胞亞群的潛在有益作用，或者利用這些應(yīng)答原理的治療的可能性的。關(guān)于這一點(diǎn)，最近，Linnemann和他的同事（11）在黑色素瘤發(fā)現(xiàn)特征變異（新 - ）抗原特異性CD4 + T細(xì)胞。在他們的研究中，作者描述了在4/5例患者（相對(duì)）小的CD4 + T細(xì)胞亞群在接觸新抗原后產(chǎn)生IFNγ，而不是其他細(xì)胞因子。這是特別有趣的，因?yàn)槲覀兊臄?shù)據(jù)顯示，黑色素瘤中腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞絕大多數(shù)產(chǎn)生TNF和而不是IFNγ，也表明黑素瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的一個(gè)非常小的亞群只產(chǎn)生IFNγ（圖3C和D）。無(wú)論如何這難以得出確切的結(jié)論，因?yàn)長(zhǎng)innemann和他的同事的大多數(shù)的T細(xì)胞識(shí)別分析（11），使用自體B細(xì)胞（呈新抗原）為靶，而不是腫瘤細(xì)胞。確實(shí)以前的研究得出，一些因素可能影響T細(xì)胞的功能，包括抗原密度（38，39）可能在肽負(fù)載的APC和腫瘤細(xì)胞不同。未來(lái)的研究將確定功能差異是否在不同的類(lèi)腫瘤抗原的CD4 + T細(xì)胞亞群之間存在。 此外，腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞的作用當(dāng)然不限于直接識(shí)別的腫瘤細(xì)胞。例如，腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞通過(guò)可抗原呈遞細(xì)胞（40）的CD40的配體介導(dǎo)的激活促進(jìn)腫瘤抗原特異性CD8 + T細(xì)胞的交叉激活的。最近，出乎意料的是，在三個(gè)獨(dú)立的小鼠模型結(jié)果表明，大部分的免疫原性mutanome是由CD4 + T細(xì)胞識(shí)別（41）。如果由CD4 + T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤抗原的是癌癥如此普遍，可以推測(cè)，在腫瘤進(jìn)展，癌細(xì)胞利用（或至少不影響）這些免疫系統(tǒng)的特征成形。我們的結(jié)果表明，這可能通過(guò)局部條件的產(chǎn)生（例如，MHC II類(lèi)的異常表達(dá)）來(lái)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)例如CD4 + T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境積聚來(lái)支持，而不是抑制，腫瘤的生長(zhǎng)。 總之，免疫逃逸的幾個(gè)機(jī)制已經(jīng)確定，在臨床上這些戰(zhàn)略在抵消腫瘤免疫抑制表現(xiàn)出不俗的成績(jī)（42-45）。在這項(xiàng)研究中，我們已經(jīng)確定了黑色素瘤中從頭MHC II類(lèi)上的異常表達(dá)可通過(guò)招募炎癥腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞對(duì)腫瘤逃逸起作用的潛在機(jī)制。然而，在起始和維持的免疫反應(yīng)中的MHC II類(lèi)分子的基本作用不會(huì)立即保證策略直接抵消這一途徑，未來(lái)的研究會(huì)解決這個(gè)問(wèn)題。