凝膠電泳緩沖液及配制.doc

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　2．測(cè)序凝膠加樣緩沖液 　　98%去離子甲酰胺 　　10mol/L EDTA(pH8.0) 　　0.025%二甲苯青FF 　　0.025%溴酚藍(lán) 　　甲酰胺：許多批號(hào)的試劑級(jí)甲酰胺，其純度符合使用要求，無須再進(jìn)行處理。不過，一旦略呈黃色，則應(yīng)用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時(shí)進(jìn)行去離子處理，并用Whatman 1號(hào)濾紙過濾2次，去離子甲酰胺分裝成小份，充氮存于-70℃。 3．常用的電泳緩沖液 緩沖液 使用液 濃貯存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1：0.04mol/L Tris-乙酸 50：242g Tris堿 　 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 　 　 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1:0.09mol/L Tris-磷酸 10:10g Tris堿 　 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 　 　 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.50.045mol/L Tris-硼酸 5：54g Tris堿 　 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸 　 　 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 堿性緩沖液b 1:50mmol/L NaOH 1:5ml 10mol/L NaOH 　 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1:25mmol/L Tris 5:15.1g Tris 　 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（電泳級(jí)）（pH8.3） 　 0.1% SDS 50ml 10% SDS(電泳級(jí)) 　　說明： 　?、賂BE溶液長(zhǎng)時(shí)間存放后會(huì)形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5溶液，出現(xiàn)沉淀后則予以廢棄。 　　以片都以1TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯液）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。 　　進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小， 故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用1TBE以提供足夠的緩沖容量。 　?、趬A性電泳緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。 　　③Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 4．2SDS凝膠加樣緩沖液 　　100mmol/L TrisHCl(6.8) 　　200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT） 　　4%SDS（電泳級(jí)） 　　0.2%溴酚藍(lán) 　　20%甘油 　　不含DTT的2SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應(yīng)在臨用前取1mol/L貯存液現(xiàn)加于上述緩沖液中。 　　5．凝膠加樣緩沖液 緩沖液類型 6緩沖液 貯存溫度 Ⅰ 0.25%溴酚藍(lán) 4℃ 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25溴酚藍(lán) 室溫 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚藍(lán) 4℃ 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚藍(lán) 4℃ 40%(W/V)蔗糖水溶液 　 堿性加樣緩沖液: 　 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4℃ 0.15%溴甲酚綠 0.25%二甲苯青FF 　　使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽(yáng)極泳動(dòng)的染料。溴酚藍(lán)在瓊脂糖中移動(dòng)的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。以0.5TBF作電泳液時(shí)，溴酚藍(lán)在瓊脂糖中的泳動(dòng)速率約與長(zhǎng)300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動(dòng)則與長(zhǎng)4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%～1.4%的范圍內(nèi)，這些對(duì)應(yīng)關(guān)系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。 　　選用哪一種加樣染料純屬個(gè)人喜惡。但是，對(duì)于堿性凝膠應(yīng)當(dāng)使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因?yàn)樵趬A性pH條件下其顯色較溴酚更藍(lán)為鮮明。