動物墊料中β-溶血性鏈球菌檢測方法 編制說明

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DB15/T XXXXX—XXXX 編制說明 項目名稱：動物墊料中β-溶血性鏈球菌檢測方法 項目編號： 內(nèi)質(zhì)監(jiān)標函（2019）170號-1 編制單位： 呼和浩特海關 編制時間： 2019.5-2020.4 DB15/T XXXXX—XXXX 一、工作簡況 本標準根據(jù)《內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關于下達2019年第一批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項目計劃的通知》[內(nèi)市監(jiān)標準字（2019）170號]，本標準是由呼和浩特海關提出并歸口，項目計劃編號為1。呼和浩特海關牽頭成立由相關領域的專業(yè)技術人員和具有標準化專業(yè)知識的人員組成的標準起草組。起草組在充分調(diào)查研究、綜合分析和試驗驗證的基礎上，起草標準初稿和編制說明，并廣泛征求意見。對意見進行匯總整理，修改完善標準初稿，形成地方標準送審稿。 起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關。主要起草人：王海艷、趙治國、靳木子、郝廣福、敖威華、云華、崔強、陳林軍、延涵、陳宇飛、郭文秀。 二、標準制定的背景及意義 動物墊料與動物關系密切。近年來隨著生物科學研究的飛速發(fā)展，動物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國政府的重視和科學家的關注。墊料是為動物營造舒適的人工環(huán)境，進行環(huán)境控制的基礎條件和必要材料，是對動物產(chǎn)生直接作用和影響的環(huán)境因素。動物墊料與動物健康、福利息息相關，同時也對養(yǎng)殖業(yè)、動物及其相關科研方面甚至社會經(jīng)濟發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質(zhì)量評定與控制非常必要。 我國動物墊料標準化、商品化尚處于初級階段。歐美等發(fā)達國家早已實行墊料商品化生產(chǎn)，有專業(yè)的工廠，并且各道工序的質(zhì)量要求非常嚴格。但我國對動物墊料的研究還處于初級階段，與墊料相關的文獻報道甚少，墊料生產(chǎn)監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測標準缺乏。近年來我國政府及從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料中存在的問題，開始對墊料質(zhì)量評價方面的問題進行改進。因此要想使動物的質(zhì)量管理與國際接軌，動物墊料生產(chǎn)的標準化、商品化就變得至關重要。 我國動物墊料標準化和質(zhì)量管理相對滯后，影響相關行業(yè)發(fā)展。我國對動物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國家標準和實驗動物相關管理條例中，對動物墊料的標準化規(guī)定幾乎空白，稀數(shù)資料對于墊料的規(guī)定只有：應選用吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂的材料；須經(jīng)消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國動物墊料標準不能緊跟國際標準，同時限制了藥品、生物制品、動物等產(chǎn)品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關學科競爭力，就必須加強墊料標準化和質(zhì)量管理，從動物墊料微生物指標監(jiān)測入手。 我國動物墊料微生物檢測標準幾乎空白，亟待建立相關標準。近年來，我國政府及從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料對動物健康及下游產(chǎn)業(yè)的重大意義，墊料相關研究報道逐年增多，積累了一定的理論基礎。但目前，我國尚未對國內(nèi)墊料質(zhì)量建立統(tǒng)一評價體系、風險分析、國家標準及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物的含量對動物健康、福利和產(chǎn)品等影響重大，但目前動物墊料中微生物檢測標準屬于空白，亟待建立科學完善的動物墊料微生物檢測標準，該工作將對國內(nèi)墊料建立統(tǒng)一質(zhì)量評價體系、風險分析及產(chǎn)品標準等有力促進。 動物墊料中β-溶血性鏈球菌對動物的危害極大。β-溶血性鏈球菌是一種重要無芽胞的人畜共患病原菌，是影響動物健康國際公認的重要環(huán)境因素之一，廣泛分布于自然界，從水、空氣、塵埃、糞便、動物墊料及人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中均可檢出，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會對人類進行感染。上呼吸道感染患者、人畜化膿性感染部位常成為食品污染的污染源。β-溶血性鏈球菌常可引起皮膚、皮下組織的化膿性炎癥，呼吸道感染、流行性咽炎的暴發(fā)性流行以及新生兒敗血癥、細菌性心內(nèi)膜炎、猩紅熱、風濕熱、腎小球腎炎等變態(tài)反應。β-溶血性鏈球菌食物中毒潛伏期較短(5～12 h)，臨床癥狀表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉。目前常將鏈球菌屬按溶血能力分為甲型（α型）溶血性鏈球菌、乙型(β型)溶血性鏈球菌、丙型（γ型）溶血性鏈球菌3類，甲型鏈球菌致病力弱，為上呼吸道的正常寄生菌；丙型鏈球菌為口腔、鼻咽部及腸道的正常菌群，通常為非致病菌；乙型溶血性鏈球菌為鏈球菌感染中的主要致病菌。乙型(β型)溶血性鏈球菌可根據(jù)其細胞壁中特異性抗原(多糖體)的不同，分為A～H、K～T共18個族；又根據(jù)其表面蛋白質(zhì)M、K、T、S抗原的不同，將各族細菌分為若干個血清型。對人類有致病力者90％為A族，A族鏈球菌又稱化膿性鏈球菌，B、C、D、G族也偶致病。D族和O族鏈球菌和唾液型鏈球菌、輕型鏈球菌和糞鏈球菌（腸鏈球菌）等是亞急性細菌性心內(nèi)膜炎的致病因子。鏈球菌屬另一分類法按其細胞壁的碳水化合物分類,可將鏈球菌分為Lancefied A～H組和K～T組. A組β-溶血性鏈球菌(化膿性鏈球菌)是對人毒力最強的菌種,可引起咽峽炎,扁桃體炎,傷口和皮膚感染,敗血癥,猩紅熱,風濕熱和腎小球腎炎. B組β-溶血性鏈球菌也稱無乳鏈球菌,可引起嚴重感染,特別是新生兒敗血癥,產(chǎn)后敗血癥,心內(nèi)膜炎和細菌性關節(jié)炎。 C組和G組β-溶血性鏈球菌是化膿菌樣鏈球菌,根據(jù)它們的血清型和對桿菌肽的抗性可與別的細菌鑒別。β-溶血性鏈球菌的危害如此之大，使用β-溶血性鏈球菌污染的墊料容易引起動物發(fā)病，含有β-溶血性鏈球菌的動物產(chǎn)品又會導致公共衛(wèi)生事件的發(fā)生，因此檢測墊料中β-溶血性鏈球菌成為重中之重。 建立動物墊料β-溶血性鏈球菌檢測標準，保障動物健康急不可待。動物墊料與動物糞便直接接觸，容易滋生細菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被β-溶血性鏈球菌污染，從而威脅動物的健康與福利，并且對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國際間動物及產(chǎn)品貿(mào)易帶來巨大的影響，甚至威脅到人類社會的生產(chǎn)與生活。但是對于動物墊料β-溶血性鏈球菌檢測標準幾乎空白，還沒有統(tǒng)一的標準和方法，所以建立動物墊料β-溶血性鏈球菌檢測標準已刻不容緩。 本實驗室具有多年微生物檢測的經(jīng)驗，本方法的開發(fā)和應用，在檢測技術方面填補我區(qū)的空白、彌補了自治區(qū)沒有現(xiàn)行標準的不足，能夠使動物墊料中β-溶血性鏈球菌的檢測更加高效、準確、安全。本方法的開發(fā)和應用將會使我區(qū)在動物墊料中β-溶血性鏈球菌的檢測先進性方面達到國內(nèi)領先水平，為我區(qū)動物墊料質(zhì)量安全管理部門更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強動物墊料中β-溶血性鏈球菌的檢測對確保全區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。 三、主要起草過程 2019.05-2019.07 地標前期基礎工作：收集動物墊料樣本，查閱β-溶血性鏈球菌資料，檢索β-溶血性鏈球菌檢測的相關文獻及標準。 2019.08-2019.11 前期實驗條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對照，不同墊料中β-溶血性鏈球菌的檢出率，最終確定實驗方案，編寫編制說明。 2019.12-2020.02 編寫地標并定初稿并征求意見，驗證單位進行驗證。 2020.03 意見匯總并完善標準和編制說明，完成標準送審稿送審。 四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準的關系 本標準遵循GB/T 1.1-2009 《標準化工作導則 第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》和GB/T 20001.4-2015 《標準編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標準》的規(guī)則編寫。還參照相關國家標準編寫指南的要求。 在編制本標準的過程中參考了以下標準：GB 14925-2010《實驗動物環(huán)境及設施》、GB 4789.11-2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 β-溶血性鏈球菌檢驗》、GB/T 14926.16-2001 《實驗動物 乙型溶血性鏈球菌檢測方法》、GB/T.18204.3-2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法第3部分：空氣微生物》、GB/T 18204.4-2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物》、SN/T 2754.9-2011 《出口食品中致病菌環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）檢測方法 第9部分：溶血性鏈球菌》、SN/T 4624.5-2016《入境環(huán)保用微生物菌劑檢測方法 第5部分：β-溶血性鏈球菌》；綜合參考了現(xiàn)行β-溶血性鏈球菌檢測相關的檢測標準，力求該標準能夠高效準確的檢測墊料中β-溶血性鏈球菌，同時兼顧標準的廣泛應用。 本標準完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準相違背之處。相關強制性標準2項：GB 14925-2010 《實驗動物 環(huán)境及設施》，本標準規(guī)定了實驗動物及動物實驗設備和環(huán)境的技術要求及檢測方法，同時規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對墊料該標準僅規(guī)定了“墊料的材質(zhì)應符合動物的健康和福利要求，應滿足吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經(jīng)滅菌處理后方可使用” 。本地標適用于墊料中β-溶血性鏈球菌檢測，明確規(guī)定了不同類別墊料取樣方法，標準中β-溶血性鏈球菌鑒定過程增加了新的鑒定手段，確保檢測結(jié)果更加準確。 5、 主要內(nèi)容及檢測方法的確定 5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化 根據(jù)動物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。 5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法 國內(nèi)外食品和飼料中β-溶血性鏈球菌檢測法中常用的取樣方法為稱取法，本標準中針對顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱取25 g的方法進行取樣。 5.1.2 平面墊料樣品取樣方法 針對平面墊料（膠墊、托盤等）采用表面涂抹取樣法，無菌操作將涂抹25 cm2～100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL～100 mL無菌0.85 %生理鹽水，混勻作為原液。 5.2 培養(yǎng)基的選擇 5.2.1 選擇性增菌培養(yǎng)基 國內(nèi)外標準和資料中用到的選擇性增菌培養(yǎng)基主要有：改良胰蛋白胨大豆肉湯 （mTSB）、葡萄糖肉浸液肉湯和匹克氏肉湯。其中葡萄糖肉浸液肉湯增菌液無選擇性，導致雜菌不能夠抑制；匹克氏肉湯有雖然有一定抑制效果，但制備繁瑣復雜；而改良胰蛋白胨大豆肉湯 （mTSB）既具有選擇性又操作簡單，且目前已經(jīng)成為廣泛使用的商品化試劑被許多標準采用，因此本標準選擇使用改良胰蛋白胨大豆肉湯 （mTSB）進行選擇性增菌。 5.2.2 分離培養(yǎng)基 本標準選用的β-溶血性鏈球菌分離培養(yǎng)基為現(xiàn)行標準中比較認可的哥倫比亞 CNA 血瓊脂，同國家標準GB 4789.11所用培養(yǎng)基相同，保證檢測結(jié)果的同時，兼顧不同標準所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實驗室成本。 5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標準對典型或可疑菌落的鑒定過程，參考了國內(nèi)外β-溶血性鏈球菌檢測標準等成熟做法，綜合了生化反應等必要鑒定過程，并囊括了全自動微生物檢測系統(tǒng)快速方法，增加了飛行時間質(zhì)譜檢測方法，做到了與國際接軌，縮短檢測時間，增加檢測通量，減少檢測人員工作量。 5.4 培養(yǎng)時間和溫度 我國常用的β-溶血性鏈球菌培養(yǎng)溫度為36℃1℃，也在這一范圍內(nèi)，本標準將繼續(xù)采用我國常用的36℃1℃對β-溶血性鏈球菌進行檢測培養(yǎng)。本標準各種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間也與國內(nèi)外標準常用時間相統(tǒng)一。 5.5 其他 本標準增加了β-溶血性鏈球菌檢測常用培養(yǎng)基保存期限與保存方式，對檢測人員具有實際指導意義，確保檢測結(jié)果質(zhì)量。 六、方法驗證 為驗證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測機構(gòu)對本方法進行驗證，驗證內(nèi)容為方法的適用性、準確度、檢出率及相關樣品的檢測，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關要求。 七、結(jié)論 綜上所述，本標準在制定過程中所涉及到的各項技術指標均經(jīng)過方法學的驗證，并切實可行，完全達到了編制標準的要求。 八、重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果 未發(fā)生。 九、國內(nèi)外情況簡要說明 國內(nèi)尚沒有建立統(tǒng)一的標準檢測方法。檢索國家標準1項和地方標準2項：GB 14925-2010 《實驗動物 環(huán)境及設施》、江蘇省地方標準DB32/T 2129-2012 《實驗動物 墊料》、北京市地方標準DB11/T 1126-2014《實驗動物 墊料》。 根據(jù)文獻報道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關單位從事這項研究。 10、 標準草稿征求意見情況匯總表 序號 意見 提出單位/專家 采納 不采納（說明原因） 1 建議在標準適當位置增加檢測流程圖 包頭海關技術中心（原包頭出入境檢驗檢疫局技術中心）/張鵬翔 采納 2 建議將附錄A培養(yǎng)基和試劑配制中每種成分的數(shù)量單位靠后對齊。 赤峰海關技術中心（原赤峰出入境檢驗檢疫局技術中心）/曹旭 采納 3 建議文中數(shù)量和單位之間空一格 蘭州海關技術中心（原甘肅出入境檢驗檢疫局技術中心）/張宇霞 采納 4 建議按照《標準編寫規(guī)則》的要求修改標準格式。 二連浩特海關技術中心（原二連浩特出入境檢驗檢疫局技術中心）/楊帆 采納 5 無修改建議。 滿洲里海關技術中心（原滿洲里出入境檢驗檢疫局技術中心）/楊東來 參考文獻： [1] GB/T 1.1-2009, 標準化工作導則 第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則[S]. 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