華東理工大學儀器分析色譜法引論.ppt

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色譜分析法Chromatography,第一章色譜法引論,一、概述問題問題1：什么是色譜法？問題2：為什么色譜法能將混合物分開？問題3：色譜法的分類？問題4：各種色譜法的應用范圍？,,1、什么是色譜法？,茨維特的實驗茨維特：俄國植物學家，主要從事植物色素的研究工作，在1906年發(fā)表的文章中，首次提出了色譜的概念。,茨維特的實驗,碳酸鈣,石油醚,什么是色譜法？,Chromatography色譜法是一種分離方法。特點：有兩相，一是固定相（stationaryphase），一是流動相（mobilephase），兩相作相向運動。將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。因此色譜分析是一種分離、分析法。,2、色譜法分離原理,當流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質和結構上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。,3、色譜法的分類,按流動相狀態(tài)的不同，可分為以下三類：氣相色譜法(GasChromatography,GC)液相色譜法(LiquidChromatography，LC)超臨界流體色譜(SupercriticalFluidChromatography，SFC),色譜分析儀器流程,流動相攜帶進樣裝置引入的混合試樣進入色譜柱混合試樣在色譜柱中進行分離各組分依次進入檢測器檢測檢測響應信號導入計算機得到色譜圖,什么是氣相色譜法？,以氣體為流動相的色譜法GasChromatogaphy，簡稱GC按固定相狀態(tài)的不同可分為：氣固色譜(GSC)氣液色譜(GLC),,應用范圍：用于分離分析易汽化（在-190℃-500℃范圍內有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易反應的樣品，特別適合用于同系物、同分異構體的分離。,什么是液相色譜法？,以液體為流動相的色譜法LiquidChromatography，簡稱LC應用范圍：用于分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。,其他分類方式,按固定相使用的形式可分為柱色譜（columnchromatography）將固定相裝在色譜柱內紙色譜（PaperChromatography）用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（ThinLayChromatography）固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上,,應用TLC:,123456789,BandsDescription1PseudoginsenosideF112AmericanGinseng3GinsenosideRg14GinsenosideRf5Ginseng6GinsenosideRc7GinsenosideRb18Notoginseng9NotoginsenosideR1,IdentificationofGinseng,AmericaginsengandNotoginseng,二、色譜法基本理論,擬解決的問題色譜相關術語色譜法理論的概況色譜中的動力學理論色譜分離情況的評價方法影響色譜分離的主要因素及條件選擇（從理論的角度加以判斷）,1、色譜相關術語,關于色譜峰關于保留值關于分配平衡,關于色譜峰的術語,,峰,峰高,基線,峰寬,半峰寬,峰面積,標準偏差σ,關于色譜峰的術語,峰底寬、半峰寬及標準偏差三者的關系為：W=4σ，Wh/2=2.354σ拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基線漂移基線噪聲譜帶擴張,關于保留值的術語,死時間（t0，tM）：無保留組分出峰時間保留時間（tR）：調整保留時間（t’R）：,,,,,關于保留值的術語,死體積（V0，VM）：保留體積（VR）：調整保留體積（V’R）：,關于保留值的術語,相對保留值（ri,s）：——相對保留值又稱為選擇性因子（?）——在氣相色譜中，相對保留值的大小僅與固定相種類和柱溫有關。,,,關于保留值的術語,保留指數(shù)（I）：又叫Kovats，它規(guī)定正構烷烴的保留指數(shù)是其碳數(shù)的100倍，其它物質的保留指數(shù)在實際色譜條件下測定。選取與被測物相鄰的兩種正構烷烴做參照系，其中一種碳數(shù)為Z，另一種為Z+1，被測物的保留指數(shù)由下式計算：,,關于分配平衡,分配系數(shù)K（distributioncoefficient）,,關于分配平衡,分配比k：又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態(tài)時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。是衡量柱子對組分保留能力的重要參數(shù)。,,關于分配平衡,相比β：色譜柱內固定相和流動相體積之比是柱型及結構的重要特征。,,2、色譜基本理論概述,研究理論的目的解決色譜峰的分離問題三個色譜基本理論問題色譜熱力學問題——發(fā)展高選擇性色譜柱色譜動力學問題——發(fā)展高效能色譜柱分離條件的最優(yōu)化問題——分離條件優(yōu)化,3、色譜動力學理論,研究流出曲線展寬的本質及曲線形狀變化的影響因素塔板理論速率理論,塔板理論,塔板理論將色譜柱比作精餾塔，通過概率理論得到流出曲線方程：,塔板理論,當t=tR時，C=Cmax，峰高正比于進樣量W，是峰高定量的理論基礎。當n越大，柱效越大，Cmax/W越大。即保留時間一定時，塔板數(shù)越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留時間小的組分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留時間大的組分峰低且寬。,柱效,由流出曲線方程導出：H=L/n,,柱效,n是峰相對展寬的量度n是柱效的量度n是常數(shù)時，Y與tR成正比n越大，h越小，表明組分在柱中達到的分配平衡次數(shù)越多，對分離越有利，但還不能預言各組分有被分離的可能性。,塔板理論的貢獻,塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。導出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實驗現(xiàn)象相吻合。導出理論塔板數(shù)的計算公式，作為柱效的評價指標。,塔板理論的局限,塔板高度H是一個抽象的物理量，它的色譜本質是什么？它與哪些參變量有關，又怎樣影響峰的擴張？對實驗的指導意義有限。不能解釋流速對理論塔板數(shù)的影響。有些假設不合理，如沒有考慮縱向擴散對色譜分離的影響等。,4.色譜相關術語,關于色譜峰關于保留值關于分配平衡,關于色譜峰的術語,峰,峰高,基線,峰寬,半峰寬,峰面積,標準偏差σ,峰底寬、半峰寬及標準偏差三者的關系為：W=4σ，Wh/2=2.354σ拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基線漂移基線噪聲譜帶擴張,關于保留值的術語,死時間(tM):無保留組分出峰時間保留時間(tR):調整保留時間(t’R):死體積(VM):保留體積(VR):調整保留體積(V’R):,,,相對保留值(ri,s):保留指數(shù)(I)：又叫Kovats，它規(guī)定正構烷烴的保留指數(shù)是其碳數(shù)的100倍，其它物質的保留指數(shù)在實際色譜條件下測定。選取與被測物相鄰的兩種正構烷烴做參照系，其中一種碳數(shù)為Z，另一種為Z+1，被測物的保留指數(shù)由下式計算：,,關于分配平衡,分配系數(shù)K(distributioncoefficient)分配比k又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態(tài)時組分在固定相中的量與在流動相中的量之比值。是衡量柱子對組分保留能力的重要參數(shù)。,,相比β色譜柱內固定相和流動相體積之比是柱型及結構的重要特征。,,二、色譜分析法基本理論,研究理論的目的解決色譜峰的分離問題三個色譜基本理論問題色譜熱力學問題——發(fā)展高選擇性色譜柱色譜動力學問題——發(fā)展高效能色譜柱分離條件的最優(yōu)化問題——分離條件優(yōu)化,1、色譜動力學理論,研究流出曲線展寬的本質及曲線形狀變化的影響因素塔板理論速率理論,（1）塔板理論,推導塔板理論將色譜柱比作精餾塔，通過概率理論得到流出曲線方程：,?為標準偏差,當t=tR時，C=Cmax，峰高正比于進樣量C0，是峰高定量的理論基礎。當n越大，柱效越大，Cmax/C0越大。即保留時間一定時，塔板數(shù)越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留時間小的組分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留時間大的組分峰低且寬。,對色譜流出曲線方程的討論,柱效,由流出曲線方程導出：H=L/nn是峰相對展寬的量度n是柱效的量度n是常數(shù)時，Y與tR成正比n越大，h越小，表明組分在柱中達到的分配平衡次數(shù)越多，對分離越有利，但還不能預言各組分有被分離的可能性。,,塔板理論的貢獻,塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。導出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實驗現(xiàn)象相吻合。導出理論塔板數(shù)的計算公式，作為柱效的評價指標。,塔板理論的局限,塔板高度H是一個抽象的物理量，它的色譜本質是什么？它與哪些參變量有關，又怎樣影響峰的擴張？對實驗的指導意義有限。不能解釋流速對理論塔板數(shù)的影響。有些假設不合理，如沒有考慮縱向擴散對色譜分離的影響等。,速率理論,速率理論是1956年荷蘭學者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程運用流體分子規(guī)律研究色譜過程中產生色譜峰擴展的因素，導出了理論塔板高度與流動相線速度的關系，揭示了影響塔板高度的動力學因素,速率方程的導出,根據(jù)塔板計算公式：n=5.54(tR/Y1/2)2速率理論討論的是色譜峰展寬原因，即影響塔板數(shù)n的因素，也就是影響塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu,渦流擴散項,A=2λdp,渦流擴散項,均勻性因子,粒徑,渦流擴散項,渦流擴散項A：由不等路徑造成的色譜峰擴展。由于柱填料粒徑大小不同，粒度分布范圍不一致及填充的不均勻，形成寬窄、長短不同的路徑，因此流動相沿柱內各路徑形成紊亂的渦流運動，有些溶質分子沿較窄且直的路徑運行，以較快的速度通過色譜柱，發(fā)生分子超前，反之，有些分子發(fā)生滯后，從而使色譜峰產生擴散。,分子擴散項,B/uB=2γDg,彎曲因子,擴散系數(shù),分子擴散項,分子擴散項：由于分子的縱向擴散造成的色譜峰擴展。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運動著的分子產生縱向擴散，引起色譜峰擴展,傳質阻力項,,氣相傳質阻力項,氣相傳質阻力項Cg：試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程中，由于質量交換過程需要一定時間（即傳質阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子隨流動相向前運動，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。,氣相傳質阻力項表達式,CguCg=,容量因子,液相傳質阻力項,液相傳質阻力項CL：試樣組分從固定相表面移動到固定相內部的過程中，由于質量交換過程需要一定時間（即傳質阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子先離開固定相表面，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴展。,液相傳質阻力相表達式,CLuCL=,液膜厚度,液相擴散系數(shù),氣相色譜中的速率方程,,,,速率方程給我們的什么啟示,為柱型的研究和發(fā)展提供理論依據(jù)為操作條件的選擇提供理論指導為色譜柱的填充提供理論指導,對柱型研究和發(fā)展的影響,A=0?Golay1957年提出毛細管柱的概念（opentube）毛細管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分離能力大大提高,對柱型研究和發(fā)展的影響,B=0?溶質在液體中的擴散系數(shù)DL≈10-5cm2/s溶質在氣體中的擴散系數(shù)Dg≈10-1cm2/sDL《Dg當采用液體作流動相時B→0液體作流動相時可用更細的固定相，A↓HPLC柱效比GC要高2~3個數(shù)量級,操作條件對柱效的影響,,載氣線速度（流速）的影響,最佳流速：u=(B/C)1/2實用最佳流速：比最佳流速更快A與流速無關B/u：當流速小時，對H的大小起主導作用Cu：當流速大時，對H的大小起主導作用,容量因子k的影響,不同組分k不同，測出的柱效不同在氣相傳質阻力相中，k↑，Cg↑理論上說k越小柱效越高，實際不可取在液相傳質阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓當k=1時，最大。希望k在一個合適的范圍內，通過改變柱溫，固定相，柱型參數(shù)等可實現(xiàn)。,柱溫的影響,間接影響、十分復雜對k影響，對擴散系數(shù)影響，從而對柱效產生影響，但影響情況難以判斷,對色譜柱的填充提供理論指導,柱徑：根據(jù)速率方程，柱徑越小，柱效越高，但柱徑越小，固定相越難填充均勻。柱長L：柱長增加，總塔板數(shù)增加，但柱長增加，分離時間將增加。固定相粒徑dp：根據(jù)速率方程，粒徑減小，A項減小，C項減小，柱效增加。但粒徑太小，不易填充，同時A項增大。,對色譜柱的填充提供理論指導,液膜厚度df：從柱效角度考慮，液膜越薄，柱效越高（根據(jù)速率方程），但允許的進樣量減小。固定液與擔體的配比一般在5:100-25:100之間，但現(xiàn)在更低配比的固定相也應用廣泛。更重要的是：不同沸點的物質，應采用不同配比的固定相。,影響譜帶擴張的其他因素,非線性分配色譜載體表面活性吸附中心造成的拖尾柱外效應色譜柱外引起色譜峰擴展的因素：如進樣系統(tǒng)及進樣方式、系統(tǒng)連接管、檢測器死體積，檢測器響應時間常數(shù)等因素引起的譜帶寬展。,速率理論方程式的偶合式,H=(1/A+1/Cgu)-1+B/u+CluA’=(1/A+1/Cgu)-1為偶合項已被普遍接受,,,2.色譜分離基本方程,對于常規(guī)分析工作，一般選用：選擇性系數(shù)α（相對保留值）與保留指數(shù)I來評價固定液有效塔板數(shù)N有效來評價色譜柱與分離條件以分離度R作為柱的總分離效能指標,（1）幾個概念——選擇性系數(shù)α,定義與相對保留值(ri,s)基本相同不同之處在于選擇性系數(shù)是兩個相鄰峰的調整保留值之比（后峰比前峰，α≥1），而不是被測物與標準物質的調整保留值之比（可小于1）它是評價固定液選擇性的指標。選擇性系數(shù)越大，該柱對此相鄰峰的分離越好。,幾個概念——有效塔板數(shù)N有效,在氣相色譜中，通常用有效塔板數(shù)N有效和有效塔板高度H有效來評價柱子的分離效能，它扣除了死體積對分離的影響，更好地反映了柱子的實際分離效能。柱效越高，該柱的分離能力越好。,幾個概念——分離度R,,R越大，說明兩組分分離得越好。由于該定義綜合了色譜動力學和熱力學因素，可作為色譜柱的總分離效能指標。,(2)色譜分離基本方程（Purnell方程）,公式推導,（3）色譜分離基本方程的啟示,要改善物質對的分離（提高R），即提高兩相鄰物質的分離度，可以采取以下措施：提高柱效N提高選擇性系數(shù)α增大容量因子k,,N的影響，如何提高N？,分離度R與理論塔板數(shù)N的平方根成正比關系，增加塔板數(shù)，有利于提高分離度。增加柱長可增加N，改善分離，但分析時間將大大延長，峰產生擴展。減小塔板高度H：根據(jù)速率方程的啟示制備一根性能優(yōu)良的色譜柱是十分重要的。根據(jù)速率方程選擇合適的色譜條件同樣有效。,K的影響，如何改變k？,分離度與容量因子有關，容量因子越大，分離越好。k135791113∞k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1100℃程序升溫,具體的,汽化溫度,一般進樣方法下，汽化溫度比柱溫高30-70℃。進樣量大時高一些好，保證瞬間汽化。保證不可超過試樣的分解溫度。其它氣化溫度與具體進樣方式有關。,檢測器溫度,一般大于或等于柱溫，具體與檢測器種類有關。,進樣量,液體試樣一般進樣量0.1-5μl。氣體試樣一般進樣量為0.1-10ml。具體視柱類型，固定液含量（不能超過柱容量）、進樣方式、檢測器的靈敏度和線性范圍等確定。,流動相（載氣）種類,流動相的種類要視檢測器種類確定。常用的有氫氣（熱導用）、氮氣（氫火焰用）、氦氣（均可用，但價格較高）。氫氣和氦氣適合于快速分析。氮氣做載氣峰型較好，柱效較高。,三、色譜定性與定量方法,人參藥材的HPLC圖譜,5,1,,,,人參皂苷標準品的HPLC色譜圖,Rg1,Rb1,Re,丙二酰基人參皂苷Rb1,面積歸一：Rg1=1.0%,Rb1=3.5%外標法：Rg1=0.2%,Rb1=0.5%,（1）色譜定性分析,利用保留值及其規(guī)律定性各物質在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標。利用純物對照定性利用文獻值對照定性,純物質對照定性,實現(xiàn)方法利用保留時間和保留體積定性,用相對保留值定性用已知物增加峰高法定性,應用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質的情況。優(yōu)點：應用簡便，不需要其他儀器。缺點：定性結果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性,文獻值對照定性分析（GC）,實現(xiàn)方法測定相對保留值ri,s測定保留指數(shù)I優(yōu)點：無需純物質；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)性和精密度；只與固定相和柱溫有關。缺點：對結構復雜的物質，缺乏數(shù)據(jù)。適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質。,與其它儀器或化學方法聯(lián)合定性,離線聯(lián)用方式化學法儀器法在線聯(lián)用方式化學法儀器法,離線聯(lián)用方式,收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷卻后收集應用范圍：無標準物時，可對較為復雜的混合物進行定性分析缺點：麻煩,在線聯(lián)用方式,用化學方法輔助定性柱前反應：在色譜柱前裝上預處理柱，帶有某些官能團的化合物在預柱中發(fā)生物理化學變化，其色譜峰會消失或移動，與反應前色譜圖比較，可初步判斷試樣中含那些官能團。柱后反應：在色譜柱后裝上Ｔ型毛細管分流器，將各組分導入官能團試劑反應管，利用官能團反應對組分進行定性。,與其它儀器聯(lián)用定性混合物經色譜分離后，將各組分直接由接口導入其它儀器中進行定性。常用的聯(lián)用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……其它儀器相當于色譜儀的檢測器。使用范圍：復雜樣品的定性。優(yōu)點：不需要標準物，定性結果可信度高，操作方便。缺點：需要特殊儀器或設備。,GC-MS,（2）色譜定量分析,定量基礎色譜定量分析是基于被測物質的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：,,定量要解決的問題,峰面積的測量和計算校正因子的測量與計算色譜定量方法及其應用,峰面積的測量與計算,積分儀或色譜工作站簡便、速度快，精度高，可達0.2-2%，對小峰及不對稱峰的結果準確，是色譜發(fā)展趨勢。手動測量與計算,峰高乘半峰寬法：適于對稱峰峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰峰高乘平均峰寬法：適于不對稱峰峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析。,重疊峰的測量,切線分峰垂線分峰,連線分峰計算機擬合分峰,校正因子的測量與計算,相對校正因子由于絕對校正因子與儀器的靈敏度有關，又由于靈敏度與實驗條件相關，且每一檢測器的靈敏度都是不同的，它不容易測量準確，亦無通用性，所以實際工作中使用相對校正因子。,相對校正因子的表達式,質量校正因子摩爾校正因子相對響應值,,,被測組分的質量,標準物質量,分子量,相對校正因子的測量,理論上相對校正因子與試樣、標準物質、檢測器類型、載氣類型有關，與其它色譜條件無關。無純物質時或對結果準確度要求不高時，相對校正因子可通過查表得。即無純物，手冊上又無數(shù)據(jù)時，可用一些計算方法估算這些物質的相對校正因子。,定量方法,校正歸一化法——含歸一化內標法——含內標標準曲線法外標法——含單點校正,校正歸一化法,,,推導：,應用范圍：當試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測器上均有響應，各組分峰沒有重疊時，可用此法。優(yōu)點：簡便、準確，當操作條件如進樣量等變化時，對定量結果影響很小，該法適合于常量物質的定量。缺點：對該法的苛刻要求限制了它的使用。,歸一化法,若各組分的定量校正因子相近或相同，則上式可簡化為：,內標法,推導將一定量的純物質作為內標物，加入到準確稱量的試樣中。,,,適用范圍：當只需測定試樣中某幾個組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時可用。優(yōu)點：受操作條件的影響較小，定量結果較準確，使用上不象歸一化法那樣受到限制，此法適合于微量物質的分析。缺點：每次分析必須準確稱量被測物和內標物，不適合于快速分析。,內標標準曲線法,fi,sms/m為常數(shù)K，此時Ci%=K(Ai/As)，以Ci%對Ai/As作標準曲線。優(yōu)點：不必測校正因子，消除了某些操作條件的影響，方法簡便，適合液體試樣的常規(guī)分析。如白酒分析國標中采用此法。,外標法（標準曲線法）,用于常規(guī)分析優(yōu)點：操作簡單，計算方便。缺點：結果的準確度取決于進樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進樣。,單點校正,當被測試樣中各組分的濃度變化范圍不大時而用單點校正法。即配制一個與被測組分含量十分接近的標準溶液，定量進樣，計算被測物的含量。,定量中的誤差問題,樣品的代表性（樣品的前處理）進樣系統(tǒng)的影響柱系統(tǒng)的影響測量誤差定量結果的誤差分析,習題課Page61-6221,33,