2015RB048轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法證實(shí)評(píng)價(jià)指南--草案（征求意見稿）

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發(fā)  布擊此處添加   點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)  華人民共和國認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)   基因檢測(cè)方法 驗(yàn)證 評(píng)價(jià)指南  on of MO  4790  （ 草案 ）    布    施  中  華  人  民  共  和  國  國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局  目    次    前     言 .......................................................................................................................................基因檢測(cè)方法 驗(yàn)證 評(píng)價(jià)指南 ................................................................................................... 范圍 ........................................................................................................................................... 規(guī)范性引用文件 ....................................................................................................................... 術(shù)語和定義 ............................................................................................................................... 符號(hào)和縮略語 ........................................................................................................................... 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法 驗(yàn)證 評(píng)價(jià) .......................................................................................................錄 A （資料性附錄）  量對(duì)實(shí)際 影響  ...................................................... 11 附錄 B （資料性附錄）  對(duì) 取方法的評(píng)價(jià)（抑制試驗(yàn)）  ......................................錄 C （資料性附錄）  中間濃度 陽 性 對(duì)照 的生產(chǎn)  .............................................................錄 D （資料性附錄）  基于實(shí)時(shí) 轉(zhuǎn)基因含量平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的評(píng)估 .................................................................................................................     言  本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù) 準(zhǔn)化工作導(dǎo)則  第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》中的要求進(jìn)行編寫的。  本標(biāo)準(zhǔn)等同采用歐盟委員會(huì)聯(lián)合研究中心組織編寫的 4790  多個(gè)實(shí) 驗(yàn)室轉(zhuǎn)基因分析方法 驗(yàn)證 的驗(yàn)證方法 》  （ of MO 。  本 標(biāo)準(zhǔn) 由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出 并歸口 。  本 標(biāo)準(zhǔn) 起草單位： 中華人民共和國 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 。  本 標(biāo)準(zhǔn) 主要起草人： 饒紅、 韓玥、 郭錚蕾、徐姍、李偉 。  本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。  轉(zhuǎn)基因檢測(cè) 方法 驗(yàn)證 評(píng)價(jià) 指南  1 范圍  本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因 檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室 方法 驗(yàn)證 評(píng) 價(jià) 的術(shù)語和定義、利用協(xié)同實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 和 /或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù) 進(jìn)行 方法 驗(yàn)證 評(píng)價(jià) 的程序、方法、報(bào)告與表示。  本標(biāo)準(zhǔn)適用于 轉(zhuǎn)基因檢測(cè) （如實(shí)時(shí)熒光 方法 驗(yàn)證 過程的評(píng) 價(jià) 、報(bào)告和表示。  2 規(guī)范性引用文件  下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。   基因產(chǎn)品檢測(cè)  通用要求和定義  3 術(shù)語和定義  下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。  方法 確認(rèn)   of 認(rèn)是 通過檢查并提供客觀證據(jù)，以證實(shí)某一特定預(yù)期用途的特定要求得到滿 足。 (7025 方法驗(yàn)證   of 證是通過 提供客觀證據(jù)，確認(rèn)特定要求得到滿足（ 000:2000 驗(yàn)證一個(gè)實(shí)驗(yàn)室能夠充分按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行操作需要實(shí)驗(yàn)室提供客觀證據(jù)，證明對(duì)于所用的樣品基質(zhì)，能滿足檢測(cè)方法規(guī)定的性能指標(biāo)。 通常，標(biāo)準(zhǔn)要求是 真實(shí)度 （ 一般用偏差形式表示 ） 和精確 度（一般為重復(fù)性和再現(xiàn)性），反映在測(cè)量不確定度中?？陀^證據(jù)是從 實(shí)驗(yàn)室實(shí)際數(shù)據(jù)中得到的真實(shí) 度和精確度。  可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差   可重復(fù)性（重現(xiàn)性）標(biāo)準(zhǔn)偏差是指在可重復(fù)性（重現(xiàn)性）條件下獲得的測(cè)試結(jié)果的散布的分布狀態(tài)的度量標(biāo)準(zhǔn)。相同地，“可重復(fù)性（重現(xiàn)性）變化”或“可重復(fù)性（重現(xiàn)性）變化系數(shù)”可以被定義或用于在可重復(fù)性（重現(xiàn)性）條件下獲得的測(cè)試結(jié)果的散布情況的度量標(biāo)準(zhǔn)。    實(shí)驗(yàn)室樣品  原始樣品經(jīng)過混合、縮分得到的一定數(shù)量樣品。用于制備試樣和存查樣品 。  分析樣品  驗(yàn)室通過研磨制備的樣品，必要時(shí)進(jìn)行混勻。  檢測(cè)部分  于檢測(cè)或分析的 樣品 ，其一次用于分析物提取的整體的量。  檢測(cè)結(jié)果  試結(jié)果是從     文中用到的） as in 從不同分析樣品的不同檢測(cè)部分得到的 本文中用到的 ) as in 用 對(duì) 工作溶液  續(xù)  定量 檢測(cè)低 限    定量分析過程的低限是指被檢測(cè)的樣品在合適的精確度水平上能被檢測(cè)出的最低含量或濃度，并且依據(jù) 727條款【 2】或【 3】，經(jīng)過合作實(shí)驗(yàn)的滿意證明或單一實(shí)驗(yàn)室的確認(rèn) 。  實(shí)際定量檢測(cè)低限    實(shí)際 定 /估計(jì)）目標(biāo)種類基因拷貝數(shù)的情況下，能定量到的可信的（如 ≥ 95%置信水平 ）最低相對(duì)目標(biāo)    檢測(cè)低限   定性方法的檢測(cè)限是指被檢測(cè)物能被可靠檢出的最低濃度或含量 。 但是不必進(jìn)行定量，并且已經(jīng)經(jīng)過合作實(shí)驗(yàn)的證明或單一實(shí)驗(yàn)室的確認(rèn)。  實(shí)際 檢測(cè)低限   實(shí)際 定 /估計(jì)） 目標(biāo)種類基因拷貝數(shù)的情況下，能檢測(cè)到的可信的（如 ≥ 95%置信水平 ）最低相對(duì)目標(biāo)  特異性  法只對(duì)特定特性或分析物有反應(yīng)的特點(diǎn)。  動(dòng)態(tài)范圍 —定量檢測(cè)范圍    of 合作實(shí)驗(yàn)室證明了分析過程內(nèi)的濃度間隔具有適當(dāng)水平的精確度和 真實(shí) 度。  真實(shí)度  量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值和 認(rèn)可參考值的一致性。  注：真實(shí)度（可信度）的量度標(biāo)準(zhǔn)通常是以斜率來表示的?？尚哦纫簿褪撬岬降摹捌骄档恼_度 ”。  精確度  規(guī)定條件下所獲得的獨(dú)立測(cè)試結(jié)果之間的一致性。  擴(kuò)增效率  個(gè)循環(huán)達(dá)到 100%效率時(shí)，使理論斜率達(dá)到 率（ %）可用以下公式計(jì)算：  效率 =(10(率 )× 100 R2 2是判定系數(shù)，是通過線性回歸分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（測(cè)量的 平方計(jì)算出的。    穩(wěn)健性   析方法的穩(wěn)健性是指在通常的使用情況下，檢測(cè)方 法不受微小、但有意的方法參數(shù)改變的影響，仍然能保持其測(cè)量可靠性的能力。  4 符號(hào)和 縮略語  下列符號(hào)和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。  CR to a  脫氧核糖核酸   MO 洲   盟    因改造    基因生物    際標(biāo)準(zhǔn)化組織     際電工委員會(huì)    of 測(cè)限     of 量檢測(cè)限    合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)  5 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法 驗(yàn)證 評(píng) 價(jià)  取和純化   質(zhì)量的 管這個(gè) 標(biāo)準(zhǔn) 關(guān)注的是 是 為  個(gè)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的方法、標(biāo)準(zhǔn)方法（如  /或其它可利用的方法。  步驟： 對(duì)于已經(jīng)確認(rèn)的 次分 2份至少 2次（推薦 3次）進(jìn)行 果可能 的話，不在同一天內(nèi)進(jìn)行，并且由不同的操作者操作。提取的 ，通過 控制 擴(kuò)增效率和 用 實(shí)時(shí)熒光 否存在 抑制劑 ， 見附錄 B）。適用于一種基質(zhì)的 上步驟需要針對(duì)不同基質(zhì)進(jìn)行。對(duì)于一個(gè) 試的基質(zhì)不能含有轉(zhuǎn)基因成分。  度  步驟：提取的  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：在驗(yàn)證過程中，當(dāng)用于 取的 取的方法應(yīng)該能產(chǎn)生出滿足檢測(cè)目的的 少達(dá)到所需的    如果 方法不能 從特定基質(zhì)上提取 滿足檢測(cè)目的的 實(shí)際的 錄A） 。  取物中不含抑制劑  步驟：每個(gè)  40L）。從這個(gè)工作溶液， 進(jìn)行 一系列稀釋，如 4個(gè)稀釋點(diǎn)被用來進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 個(gè)稀釋至少 2個(gè) 從 4個(gè)稀釋點(diǎn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。  檢測(cè)抑制劑的 ，特定分類基因參考系統(tǒng)）。工作溶液中總的日常檢測(cè)中 用的 ， 。  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)量 Δ該 < 測(cè)量 t)< 抑制劑曲線斜率在  抑制劑實(shí)驗(yàn)的例子見附錄 B. 如果提取的 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 對(duì)  異性  特異性應(yīng)該在方法確認(rèn)時(shí)就已經(jīng)研究過了。因此，在方法驗(yàn)證時(shí)不需要對(duì)特異性再進(jìn)行研究。在對(duì)幾種轉(zhuǎn)基因成分共有的基因要素做方法篩選時(shí)，方法在進(jìn)行應(yīng)用后，應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)（如果不具備方法確認(rèn)的數(shù)據(jù)）先進(jìn)行和市場(chǎng)上新的轉(zhuǎn)基 因物質(zhì)交叉反應(yīng)的檢測(cè)。這也只有在具備新轉(zhuǎn)基因成分的陽性對(duì)照樣品時(shí)才能進(jìn)行。  力范圍、 數(shù)、擴(kuò)增效率  步驟：動(dòng)力范圍、  真實(shí) 度和精確度時(shí)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以自動(dòng)得出。 應(yīng)采用至少兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的平均值 （見表 1）。  動(dòng)力范圍驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)力范圍必須覆蓋預(yù)期使用的值。可以用轉(zhuǎn)基因成分 %或 拷貝 數(shù)范圍表示。  例：   標(biāo)轉(zhuǎn)基因濃度或當(dāng)目標(biāo)為 500拷貝時(shí)的 50和 2500基因組拷貝  擴(kuò)增效率的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)定性和定量方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的平均值在 相當(dāng)于擴(kuò)增效率在 90   實(shí) 度  步驟：真實(shí) 度應(yīng)該接近規(guī)定值（如 值），或根據(jù)方法的預(yù)期使用需要，而且至少在接近 實(shí) 度的測(cè)量可以用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)（ 至少 2個(gè)濃度（如  1%），可能的話，用在動(dòng)力范圍之上的 第 3個(gè) 濃度（如 5%）?；蛘?，用一個(gè)更高比例的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)制成參考樣品（如 1%）。附錄  檢測(cè)條件（反應(yīng)量、 該和日常檢測(cè)一致。至少要得到 16個(gè) 測(cè)的設(shè)計(jì)實(shí)例見表 1、 圖 2和圖 3. 附錄 關(guān)或不相關(guān)的轉(zhuǎn)基因成分平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算方法。    如果沒有標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)進(jìn)行真實(shí) 度的評(píng)估，可以用能力驗(yàn)證材料或能力 驗(yàn)證 的 。  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：真實(shí) 度在可接受參考值的± 25%內(nèi)，或 2之間。  對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（  步驟：重復(fù)性的評(píng)估和真實(shí) 度的 評(píng)估 方法相似。是在重復(fù)條件下通過 復(fù)性適用于所有轉(zhuǎn)基因水平的測(cè)試。  檢測(cè)條件（反應(yīng)量、 該和日常檢測(cè)一致。至少要得到 16個(gè)獨(dú)立測(cè)量結(jié)果。檢 測(cè)的設(shè)計(jì)實(shí)例見表 1、圖 2和圖 3. 附錄 關(guān)或不相關(guān)的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算方法。  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：相對(duì)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng) ≤25%，在方法的動(dòng)力學(xué)范圍之上。  量限（ 評(píng)估  可 以確定相對(duì) %）和 /或絕對(duì) 拷貝 數(shù)）。  相對(duì) 驟： 陽性對(duì)照樣品可以用目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的 10次 0次平行進(jìn)行分析。 5%。為了建立準(zhǔn)確的 要用低濃度的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)配制溶液。  絕對(duì) 驟： 1%的 已 知陽性對(duì)照樣品的一系列稀釋可以用 10次  80， 60，40， 20， 10， 5和 1）。 量的 5%。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該覆蓋  概率分布建議 1個(gè)拷貝應(yīng)該給出大約 30%的陰性結(jié)果。因此，為了驗(yàn)證稀釋系列的拷貝數(shù)大致正確，1個(gè)拷貝的稀釋液至少一個(gè)平行結(jié)果得是陰性的。  10次 要標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足 效率的要求。其它的標(biāo)準(zhǔn)曲線只需要在每個(gè)點(diǎn)做 2個(gè)  驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng) 有確認(rèn)數(shù)據(jù)時(shí)， 或 好于）那些數(shù)據(jù)。  測(cè)限（ 評(píng)估  可以確定相對(duì) %）和 /或絕對(duì) 拷貝 數(shù)）。  相對(duì) 驟：一個(gè)低轉(zhuǎn)基因濃度的陽性對(duì)照樣品可以用 10次 果所有平行的結(jié)果都是陽性，這表示  絕對(duì) 驟：計(jì)算一個(gè)方法 95%置信水平的 要 每個(gè) 濃度進(jìn)行 60個(gè) 于此方法并不實(shí)用，建議計(jì)算少量平行，如 10次平行的假陰性率。假陰性率要低于 5%（如， 10個(gè) 這個(gè)方法可以進(jìn)行  假陰性率是指一個(gè)已知陽性樣品被檢測(cè)成陰性的可能性。當(dāng)分析物的量接近方法的 會(huì)出現(xiàn)假陰性率的增加。選取稀釋的系列，使其能代表基于對(duì)方法性能的認(rèn)知的高于和低于預(yù)期  20、 10、 5和 1拷貝）。 10個(gè)平行都是陽性的最低濃度是 率分布建議 1個(gè)拷貝應(yīng)該有大約 30%的陰性結(jié)果。因此，為了驗(yàn)證稀釋 系列正確的拷貝數(shù)，至少 1個(gè)拷貝稀釋的一個(gè)平行需要是陰性的。見表 1. 驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)有確認(rèn)數(shù)據(jù)時(shí)，    實(shí)際 出了本文的范圍，因?yàn)?要取決于樣品而不是 方法。但是應(yīng)該對(duì)每個(gè)樣品確定  健性  在對(duì)方法進(jìn)行協(xié)作實(shí)驗(yàn)前，在方法開發(fā)或優(yōu)化時(shí)就應(yīng)該對(duì)穩(wěn)健性進(jìn)行研究， 因此，在驗(yàn)證研究中不用對(duì)穩(wěn)健性再進(jìn)行評(píng)估。  關(guān)樣品  當(dāng)有新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品出現(xiàn)在市場(chǎng)上時(shí)，實(shí)驗(yàn)室希望得到檢測(cè)方法的通知。但是，在方法驗(yàn)證階段通常只有有證 參考 物質(zhì)。因此，通常使用有證 參考 物質(zhì) 進(jìn)行驗(yàn)證 。如果沒有 有證 參考 物質(zhì)，可以用其它的轉(zhuǎn)基因陽性 樣品 。也可以對(duì)日常樣品 或添加參考物質(zhì)的日常樣品進(jìn)行額外 檢測(cè)。  表 法的驗(yàn)證設(shè)置實(shí)例   預(yù)實(shí)驗(yàn)確定 合適濃度  在 范圍里至少測(cè)試 3 個(gè)目標(biāo)濃度（取決于植物物種）  如， 300米 應(yīng)大約 110000 內(nèi)源性 基因拷貝， 應(yīng)大約 37 拷貝。  數(shù)和擴(kuò)增效率  例 1： 2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低要求  每個(gè)曲線用 5 個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，做 3 個(gè) 行（× 3）  所有斜率都應(yīng)該在  間，所有 應(yīng)該≥  2： 4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線  每個(gè)曲線用 5 個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，做 2 個(gè) 行（× 2）  用 4 個(gè)斜率和 平均值進(jìn)行 驗(yàn)證 。  例 3： 2 個(gè)校準(zhǔn)曲線  每個(gè)曲線用 8 個(gè)點(diǎn)，做 5 個(gè) 行 （ × 5） ，覆蓋  最低濃度。用所有 上部分的斜率和 平均值 進(jìn)行 驗(yàn)證 。  ，精確度， 少兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水平（一個(gè)近似于標(biāo)簽閾值，一個(gè)近似于 薦將動(dòng)力范圍的上限作為第三個(gè)水平）  例 1：每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平做兩個(gè) 取的平行，每個(gè)提取 /板做 2 個(gè) 行，4 個(gè)板得到 16 個(gè)測(cè)量結(jié)果，每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平得 到 8 個(gè)評(píng)估 *（圖 2）  例 2：每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平做兩個(gè) 取的平行，每個(gè)提取 /板做 4 個(gè) 行，2 個(gè)板得到 16 個(gè)測(cè)量結(jié)果，每個(gè)轉(zhuǎn)基因水平的到 4 個(gè)評(píng)估 *（圖 3）  為了評(píng)估中間精密度，由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)員在兩天里分別進(jìn)行 驗(yàn)，如果可能，由兩名實(shí)驗(yàn)員實(shí)驗(yàn)。  一個(gè)低濃度的 10 個(gè) 行（如 80、 60、 40、 20、 10、 5 和 1 個(gè)拷貝）。當(dāng)拷貝數(shù)測(cè)量 的 于 25%并且標(biāo)準(zhǔn)曲線覆蓋了這個(gè)點(diǎn)的一系列濃度中的最低濃度。  一個(gè)低濃度的 10個(gè)  20、 10、 5和 1個(gè)拷貝）。  *如果基于經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室能夠證 明兩個(gè)經(jīng)驗(yàn)豐富的操作者的平行和一個(gè)操作者的平行是一樣的，就無需兩個(gè)操作者 完成重復(fù) 了。  注意： 也可 同時(shí)評(píng)估表 1 中的參數(shù)。  注意：針對(duì)一次實(shí)驗(yàn) ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品要在同一個(gè)板上。兩次實(shí)驗(yàn)（如內(nèi) 源 基因 和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)）可以在兩個(gè)不同板上進(jìn)行，每個(gè)板使用相同的樣品稀釋液和同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。    圖 2：精確度 /真實(shí) 度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（例 1）  圖 3：精確度 /真實(shí) 度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（例 :2）  附  錄  A （資料性附錄）  量對(duì)實(shí)際 影響    如表 2所示，在 基因樣品中， 目標(biāo)分類單元特定序列 的拷貝數(shù)是目標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分的 1000倍以上。這表示，對(duì)于 10個(gè)拷貝的絕對(duì) 要將 10000個(gè) 目標(biāo)分類單元特定序列 的拷貝進(jìn)行 實(shí)際 果絕對(duì) 0個(gè)拷貝，用 1000000個(gè)拷貝進(jìn)行 么實(shí)際 見表 2）。應(yīng)該對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行實(shí)際  表 量對(duì)實(shí)際 響的例子  因拷貝數(shù)  絕對(duì) 標(biāo)轉(zhuǎn)基因  復(fù)制數(shù) ) 實(shí)際 %）  100,000  10 0,000 10 000 10 1   A  B  附  錄  B （資料性附錄）  對(duì) 取方法的評(píng)價(jià)（抑制試驗(yàn)）  景  已知的抑制 擾 而影響目標(biāo) 是，一個(gè)樣品中抑制劑的最終的量取決于樣品的性質(zhì)。樣品被加工的程度越深， 物 生 代謝物如多酚、脂類和能夠與 可以通過子洗滌劑、乙醇、異丙醇和苯酚。  為了在 以采取不同的措施。這個(gè)附錄說明了 率和 以及檢測(cè)用于  抑制的作用基本上取決于抑制物的濃度。當(dāng) 制物的效果通常會(huì)在 連續(xù)稀釋樣品的反應(yīng)效率的評(píng)價(jià)和對(duì)不含抑制劑的未稀釋樣品的理論 界循環(huán)次數(shù)）和測(cè)量 可以 得到 果只有最高 濃度 是這會(huì)影響實(shí)際的  但是，在特定情況下連接在 樣就會(huì)導(dǎo)致可以擴(kuò)增的  驟  以通過用 目標(biāo)分類單元特定序列 系統(tǒng)，每個(gè) 制運(yùn)行）的連續(xù) 4倍稀釋（ 1:4、 1:16、 1:64和 1:256）的 4個(gè)點(diǎn)分析 2個(gè) 達(dá)到 接下來的  關(guān)的水平的 做“未稀釋”樣品（工作稀釋）。從這個(gè)濃度開始準(zhǔn)備四倍稀釋液（從 1:4到 1:256）。為了評(píng)估抑制劑的存在， 4個(gè)按系列稀釋的樣品的 用線性回歸計(jì)算得到一個(gè)等式。從線性回歸推算出的“未稀釋”樣品的 被接受的 三個(gè)條件：回歸線的斜率在 定系數(shù)（ 于或高于 測(cè)量  于  每個(gè)稀釋得出的兩個(gè)   下圖藍(lán)色格的“工作稀釋”反映了“未稀釋樣品”。  例 A：可接受 足所有標(biāo)準(zhǔn)    例 B： 制。 盡管 ?超過 限制 (盡管 接近這個(gè)值 )， 未稀釋的樣本和 1:4 稀釋樣品 發(fā)生了 延遲反應(yīng)  (說明 量不佳 。 后者對(duì)斜率的 影響 表現(xiàn)為 斜 率 比可接受的 (坦 。  例如 C:制。這是另一 種 取 物質(zhì)量低 的情況 。 連續(xù)稀釋 的斜率在可接受范圍內(nèi) ,然而 ,基于四點(diǎn)直線的 未稀釋樣本的 推斷 應(yīng)低于測(cè)量 (23)。 未稀釋樣本顯示出上升的延遲，以至于不如后來的 1:4 稀釋樣本 明顯 。 因此 ,當(dāng)線性回歸的斜率 落在 范圍 明 混 合物 的提取物 抑制 增。  例 D:在這個(gè)例子中 ,回歸直線的斜率 在 受 標(biāo)準(zhǔn) 之外 (- 然而 , 與 例子 B 相反 , 未稀釋樣本和第一 個(gè)梯度稀釋 樣本沒有出現(xiàn) 遲 。 ―?列顯示后續(xù) 梯度稀釋 樣品的 測(cè)量 間的 區(qū)別。這些值總是大于 反應(yīng)效率 100%時(shí)的 期望值 2?；旧?,稀釋列 表現(xiàn)的 好像 稀釋 樣品 中的  計(jì)算 的少。 因此 ,我們不希望把這 些 樣本歸為受 抑制 化合物 影響的樣本 。然而 ,如果排除技術(shù)錯(cuò)誤  (移液錯(cuò)誤 ),也 沒有其他 能明確識(shí)別 的 原因 , 不應(yīng)該排除對(duì)附含目標(biāo) 制劑可能性的推測(cè) 。      B  C  附  錄  C （資料性附錄）  中間濃度 陽性 對(duì)照 的生產(chǎn)  一些參考 物質(zhì) 只在一個(gè)或幾個(gè)有限的 轉(zhuǎn)基因 濃度 可用 ?？赡苄枰獙?陽性 材料與非轉(zhuǎn)基因材料 混合生產(chǎn)其他 轉(zhuǎn)基因 濃度 ， 如確定相對(duì) 以通過測(cè)量 同一板子上同一標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性轉(zhuǎn)基因和陰性轉(zhuǎn)基因 的參考基因 來完成。 這兩個(gè)  稀釋因子可以使用以下公式計(jì)算 : X = (A/B)*(1 X =實(shí)際稀釋系數(shù) (轉(zhuǎn)基因材料必須 被稀釋 多少 以抵消 濃度 的差異 ) A =陽性轉(zhuǎn)基因  參考基因拷貝 數(shù)  B =陰性 轉(zhuǎn)基因  參考基因拷貝數(shù)  Y =理論稀釋因子 ，如 從 10%轉(zhuǎn)基因到 基因 =100x 例子：   = 100%  = 0% 的每個(gè) μL  參考基因校準(zhǔn)曲線 上 量化未知樣品  結(jié)果：  A (來自 ): 10 拷貝 /5μL B (來自  ): 8 拷貝 /5μL 從 100%轉(zhuǎn)基因生產(chǎn) 10%轉(zhuǎn)基因 相當(dāng)于 10倍稀釋 (理論上 Y=10)。  X 必須像 Y 一 樣 用 于 計(jì) 算 混 合 的 體 積 。  如果 X=那么 實(shí)際稀釋 因子 X ：(10/8)*(101=((10/8)*9) +1= 90/8 + 1 = = 所以  1μL A 需要與 混合。  在將這兩個(gè) 到一起后， 全 混合。  混合物的純度可以通過 100%的混合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 分別在 3天 以 3個(gè)平行 分析 3個(gè)樣品 。    C  D  附  錄  D （資料性附錄）  基于實(shí)時(shí) 轉(zhuǎn)基因含量平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的評(píng)估  大部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已經(jīng)寫明如何從 用兩種方法計(jì)算出的平均值再通過兩個(gè)步驟相加 。 下 面詳述 從目標(biāo)基因和參考基因拷貝數(shù)測(cè)量值 開始 的過程。通過 這些測(cè)試結(jié)果 , 計(jì)算 轉(zhuǎn) 基因 含量的 估計(jì) 值 和標(biāo)準(zhǔn)偏差。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)過程提供幾個(gè)這樣的 轉(zhuǎn)基因含量和標(biāo)準(zhǔn)偏差 值 (例如 , 在相同或不同的板 子上 運(yùn)行 )。需要和適當(dāng) 時(shí) ,這些 評(píng)估 可以 通過 標(biāo)準(zhǔn)方式 相加 ,例如通過轉(zhuǎn)基因含量計(jì)算 算術(shù)平均 值 。   目標(biāo)和參考基因拷貝數(shù)估計(jì) 轉(zhuǎn)基因含量   估計(jì) 轉(zhuǎn)基因 分比需要 用到 兩個(gè) 實(shí)驗(yàn) :一個(gè)試驗(yàn)是用來檢測(cè)目標(biāo) 轉(zhuǎn)基因 X)， 另一種是用于確定內(nèi) 源 參考基因 Y)。 轉(zhuǎn)基因 分比的估計(jì) 通常 使用以下的 比率法：  .          (1) 都是隨機(jī) 變 量 1。 1 一個(gè)隨機(jī)變量可以被認(rèn)為是一個(gè) 值 不固定值 的量 ，但可以根據(jù)概率分布取不同的值 (例如，可能是由測(cè)量不確定度決定的 )。 通常 使用大寫字母 表示一個(gè) 隨機(jī)變量 (即 ，  ，使用 小字母 表示實(shí)際值 ， 即測(cè)量結(jié)果。  標(biāo)準(zhǔn)的做法是 將 目標(biāo)和參考基因 一式兩份或 一式三份等 來進(jìn)行試驗(yàn) 。 這樣將分別得到 2到 3個(gè)轉(zhuǎn)基因目標(biāo) 到 3個(gè) 參考基因 著需要根據(jù)這兩組檢測(cè)結(jié)果計(jì)算轉(zhuǎn)基因百分比 的平均值。 然而 沒有計(jì)算 隨機(jī)變量 比率 的均值和方差 的 準(zhǔn)確公式 ， 但存在近似 值。平均值， 用 獨(dú)立隨機(jī)變量 比率 的方差 接近于  (2) 和  (3) 其中 是目標(biāo)轉(zhuǎn)基因  是參考  這些近似 值 假設(shè) 之間 不 相關(guān) 。 標(biāo)準(zhǔn)偏差 用 表示。標(biāo)準(zhǔn)偏差組分中的相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差 后用標(biāo)準(zhǔn)偏差的分量計(jì)算 ； 以下示例給出了 算方法 。  所有這些計(jì)算可以 用   子    在這些例子中 ,我們使用  些例子對(duì)應(yīng)表 1中給出的示例 并 詳細(xì)演示 了 一個(gè) 板子所 需 的 計(jì)算 ， 然后描述 如何 計(jì)算幾個(gè) 板子 結(jié)果的總和。  示例 1:兩個(gè) 每個(gè)提取 的轉(zhuǎn)基因 目標(biāo)和參考基因都在四個(gè) 板子上通過 兩個(gè) 行測(cè)試  這個(gè)設(shè)計(jì) 針對(duì)每個(gè)板子 提供了兩種 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)偏差  ， 因此 總共有 8個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值( 8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差 (這 8個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)差 都得自 使用方程 (1)和 (2)計(jì)算 兩個(gè) 測(cè)試結(jié)果 中目標(biāo)基因拷貝數(shù)和參考基因拷貝數(shù)。如果 得到 所有 8個(gè) 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 的平均值 ， 這個(gè)平均價(jià)值取決于 16個(gè) 目標(biāo)基因的拷貝數(shù)和 16個(gè)參考基因的拷貝數(shù) 的 測(cè)試結(jié)果 ， 這當(dāng)然也適用于組合標(biāo)準(zhǔn)差。  提取 1: 因此， 163977， x) = y) = 104227922。 將適當(dāng)?shù)闹捣湃敕匠?2)得出一個(gè)平均值  使用方程 (3)和上述 值 開方 得到 標(biāo)準(zhǔn)差  提取 2：  這 里，   166498， x) = y) = 62518562。 將適當(dāng)?shù)闹捣湃敕匠?(2)得出一個(gè)平均值  使用方程 (3)和上述 值 開方得到 標(biāo)準(zhǔn)差  結(jié)合板 子：  在四個(gè)不同的板 子重復(fù) 整個(gè)過程 ，除了  還得到 平均值  , 標(biāo)準(zhǔn)差  ,  樣本 轉(zhuǎn)基因 的總體 平均值 可以通過  術(shù)平均 值 計(jì)算 。 使用 個(gè)提取的 平行 數(shù) (在這個(gè)例子中 n = 2)，用 量  (這里 k = 8)， 整體平均 的標(biāo)準(zhǔn)差  ；在這個(gè)示例中分母的區(qū)間是 16 –  8 = 8。相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差 。  示例 2： 兩個(gè) 為每個(gè)提取 的轉(zhuǎn)基因 目標(biāo)和參考基因都在 兩 個(gè) 板子上通過 四 個(gè) 行測(cè)試  這個(gè)設(shè)計(jì) 針對(duì)每個(gè)板子 提供了兩種 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)偏差  ， 因此 總共有 4個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值( 4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差 (這 4個(gè)轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 和標(biāo)準(zhǔn)差 都得自 使用方程 (1)和 (2)計(jì)算四 個(gè)測(cè)試結(jié)果 中目標(biāo)基因拷貝數(shù)和參考基因拷貝數(shù)。如果 得到 所有 4個(gè) 轉(zhuǎn)基因估計(jì)值 的平均值 ， 平均 值取決于 如上述示例 1中的 16個(gè) 目標(biāo)基因的拷貝數(shù)和 16個(gè)參考基因的拷貝數(shù) 的 測(cè)試結(jié)果 ， 這當(dāng)然也適用于組合標(biāo)準(zhǔn)差。    提取 1: 因此，  x) =1433394， y) = 57700642。應(yīng)用方程 (2)得出一個(gè)平均值 使用方程 (3)和上述值 開方 得到標(biāo)準(zhǔn)差  提取 2：  這里，  14187，  157308， x) = 747515， y) = 89272181。應(yīng)用方程 (2)得出一個(gè)平均值 使用方程 (3)和上述值 開方 得到標(biāo)準(zhǔn)差  結(jié)合板 子：  在兩個(gè)不同的板子重復(fù)整個(gè)過程，除了  還得到 平均值  樣本轉(zhuǎn)基因的總體平均值 可以通過  術(shù)平均值 計(jì)算 。使用 行 數(shù) (在這個(gè)例子中 n = 4)，用 (這里 k = 4)， 整體平均的標(biāo)準(zhǔn)差  ；在這個(gè)示例中分母的區(qū)間是 16 – 4 = 12。相對(duì)可重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差  。