實(shí)驗(yàn)4-瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA.ppt

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實(shí)驗(yàn)四瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)，檢測上次實(shí)驗(yàn)課提取的質(zhì)粒DNA,二、實(shí)驗(yàn)原理,帶電物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為蛋白質(zhì)、核酸研究的首選標(biāo)準(zhǔn)方法泳動率是帶電顆粒在一定的電場強(qiáng)度下，單位時間內(nèi)在介質(zhì)中的遷移距離。泳動率與樣品分子所帶的電荷密度、電場中的電壓及電流成正比，與樣品的分子大小、介質(zhì)黏度及電阻成反比。不同大小的帶電分子具有不同的泳動率，在不同的介質(zhì)條件下又具有不同的分辨效率影響泳動率的因素包括樣品的物理性狀、支持物介質(zhì)、電場強(qiáng)度和緩沖液離子強(qiáng)度DNA的凝膠電泳常使用兩種支持介質(zhì)：瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠,關(guān)于電泳,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在堿性緩沖液中DNA分子帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型瓊脂糖凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子可以分離長度為100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系,質(zhì)粒DNA分子有三種構(gòu)型:CCDNA(共價閉合環(huán)狀DNA:兩條核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，DNA呈現(xiàn)超螺旋)、OCDNA(開環(huán)DNA：質(zhì)粒的一條鏈斷裂)LDNA(線形DNA：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂)，\這三種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的泳動率不同，因此電泳后呈三條帶，CCDNA泳動最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNA,,電泳方向,EB：即溴化乙錠，它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測?？梢詸z測10ng的DNA注意：EB是一種誘變劑，操作時一定要注意安全，必須戴塑料或乳膠手套,GoldView?:是一種可代替EB的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測DNA時，GoldView?與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的綠色熒光信號，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而且也可用于染RNA。,DNA的染料,線性DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨和加速劑TEMED的作用下聚合而成可以分離小片段（5～500bp）DNA分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用：蛋白質(zhì)分子的分離鑒定蛋白質(zhì)分子量的測定核酸的分析核酸序列測定,在pH值為8.0-8.3時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時向正極移動。采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。,實(shí)驗(yàn)原理,三、儀器、材料與試劑,微波爐瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)紫外線透射儀質(zhì)粒DNADNAmarker50TAE6凝膠加樣緩沖液瓊脂糖1％溴化乙錠溶液,,,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1.裝好制膠裝置[用膠帶將洗凈、干燥的制膠板兩端封好(一定封嚴(yán)，不能留縫隙),]使用水平儀，將膠板調(diào)至水平，插入適當(dāng)梳子2.將1g瓊脂糖加入100ml1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解（冷卻到60℃，加入5μl的1％EB，并搖勻），則為1％瓊脂糖凝膠液3.將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固4.充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中(注意：DNA樣品孔應(yīng)朝向負(fù)電極一端)，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠0.5cm,5.用移液器吸取質(zhì)粒樣品5μl于封口膜上，再加入1μl的6加樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔(記錄電樣的順序和電樣量)6.打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3～5V/cm，可見溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(注意DNA片段從負(fù)極向正極移動)7.當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳8.將凝膠置于紫外線透射儀上，打開紫外燈，DNA存在處顯出桔紅色熒光條帶（注意：紫外線對眼睛有傷害作用，應(yīng)戴上防護(hù)眼睛）,每班4組，約30人每組7人：1套瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（電泳槽、電泳儀、制膠板、有機(jī)玻璃槽、8孔梳子），20μL或10μL移液槍1支，冰盒1個，50mL錐形瓶1個（貼上EB標(biāo)簽）。每班配2臺電爐，線手套2副。,實(shí)驗(yàn)分組,五、思考題,EB的中文名稱是什么？使用EB時應(yīng)注意些什么？怎么制備一塊20mL體積1％瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠溶液終濃度0.5μg/mL）？什么是LoadingBuffer？LoadingBuffer中含有哪些成分？各組分的作用是什么？,1倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60℃，否則溫度太高會使制板變形2膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點(diǎn)樣孔3點(diǎn)樣時槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多4EB有毒，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境，膠勿亂扔5紫外線照射不要太久,注意,凝膠電泳槽,