綿羊和山羊源性成分同步檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法 編制說明

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編制說明 項(xiàng)目名稱： 綿羊和山羊源性成分同步檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法 項(xiàng)目編號： 內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號 編制單位： 錫林郭勒職業(yè)學(xué)院 一、工作簡況 本項(xiàng)目來源于2018年第3批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目（內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號）。起草單位為錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，協(xié)作單位為錫林郭勒食品檢驗(yàn)檢測和風(fēng)險(xiǎn)評估中心。主要起草人：郭梁、劉國強(qiáng)、于園、徐偉良、羅建興、李春冬。 二、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義 來源于綿羊和山羊的肉制品深受消費(fèi)者的喜愛，是農(nóng)畜產(chǎn)品市場中重要組成部分。市場中存在用低價(jià)肉冒充綿羊和山羊肉等高價(jià)肉的欺詐違法行為，亟需制定針對肉乳制品的綿羊和山羊源性成分同步檢測方法。目前，已經(jīng)存在六項(xiàng)羊源性檢測方法標(biāo)準(zhǔn)：飼料中牛羊源性成分的定性檢測 定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法（GB/T 20190-2006）；明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法（GB/T 25165-2010）；動(dòng)物源性飼料中反芻動(dòng)物源性成分(牛,羊,鹿)定性檢測方法 PCR方法（GB/T 21104-2007）；飼料中牛羊源性成分檢測 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法（NY/T 1946-2010）；食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)PCR法（SN/T 2051-2008）；動(dòng)物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法（SN/T 2980-2011）。在采用上述檢測標(biāo)準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)：目前缺乏基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的綿羊和山羊源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)是基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的綿羊和山羊源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，具有快速、高通量以及去除假陰性等特征。 三、主要起草過程 本標(biāo)準(zhǔn)制定工作從2018年10月開始，組織成立了標(biāo)準(zhǔn)起草團(tuán)隊(duì)。起草團(tuán)隊(duì)首先進(jìn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、專利以及論文的收集和整理工作，制定了基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的動(dòng)物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的研發(fā)目標(biāo)，計(jì)劃形成綿羊（Ovis aries）、山羊（Capra hircus）、馬（Equus caballus）、黃牛（Bos taurus）、水牛（Bubalus bubalis）、牦牛（Bos grunniens）、豬（Sus scrofa）、驢（Equus asinus）、雙峰駝（Camelus bactrianus）、梅花鹿（Cervus nippon）、雞（Gallus gallus）、鴨（Anas platyrhynchos）及鵝（Anser anser）等13個(gè)物種、針對肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）的常見動(dòng)物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)體系。 具體實(shí)驗(yàn)過程如下： （一） 在NCBI中下載不同物種（綿羊、山羊、馬、牛、水牛、牦牛、豬、驢、雙峰駝、梅花鹿、雞、鴨及鵝等13個(gè)物種）的線粒體序列。為了保證引物和探針的物種適用性，每個(gè)物種下載5-20個(gè)品種或品系的線粒體序列；利用生物信息學(xué)軟件（Clustal X或MAGE 5）對所下載的線粒體序列進(jìn)行比對。篩選物種間特異品種間保守的序列為目標(biāo)靶向區(qū)域（5-10個(gè)），針對目標(biāo)靶向區(qū)域設(shè)計(jì)5組引物和探針組合。上游引物的3’端距離探針的5’端為1-20 bp，探針的5’端避免出現(xiàn)G，探針Tm要高于引物Tm值10℃左右；不同物種的探針用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記（FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探針Tm值和引物Tm值接近，探針3’端可以選擇MGB基團(tuán)； （二） 收集各種來源于不同動(dòng)物的肉（鮮肉、肉干及香腸）。利用改良CTAB法提取樣品的DNA（A260 nm/A280 nm≈1.8，瓊脂糖凝膠電泳主帶無拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性較高）； （三） 特異性分析：利用實(shí)時(shí)熒光PCR對5組引物和探針進(jìn)行檢測，有典型擴(kuò)增曲線且Ct值≤35計(jì)為檢出。在陽性對照檢出、陰性對照未檢出、對5組引物和探針進(jìn)行特異性的分析評價(jià)。反應(yīng)體系（20 μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL（北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物各1 μL，探針各0.5 μL，模板DNA 1 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件：94℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；94℃、5 s，60℃、31 s，40個(gè)循環(huán)； （四） 絕對靈敏度分析：以來源于不同肉乳制品的高質(zhì)量DNA為模板母液，用滅菌ddH2O稀釋模板母液，共稀釋10個(gè)梯度，稀釋后質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001 ng/μL。以不同稀釋濃度的DNA為模板對5組引物和探針進(jìn)行檢測，根據(jù)PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對于不同濃度模板DNA的檢測靈敏度。檢出限（LOD）統(tǒng)計(jì)分析參照Probit analysis。比較5組引物和探針的絕對靈敏度，分析引物和探針的特異性和保守性與絕對靈敏度之間的相關(guān)性； （五） 摻假檢出限（相對靈敏度）分析：首先，制備模擬摻假混合樣品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述摻假組為模板對5組引物和探針進(jìn)行檢測，根據(jù)PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對于不同濃度摻假的摻假檢出限。檢出限（LOD）統(tǒng)計(jì)分析參照Probit analysis。比較5組引物和探針的摻假檢出限（相對靈敏度），分析引物和探針的特異性和保守性與摻假檢出限之間的相關(guān)性； （六） 定量分析：以模板質(zhì)量濃度和摻假濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和摻假定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析引物和探針的特異性和保守性與擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)的相關(guān)性；利用已知濃度的盲樣驗(yàn)證定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的適用性，通過擴(kuò)增效率（90%-110%）、相關(guān)系數(shù)R2（≥0.99）以及回收率（90%-110%）評價(jià)5組引物和探針的定量分析能力，分析引物和探針的特異性和保守性與定量分析能力之間的關(guān)系； （七） 相關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)進(jìn)行論文投稿以及專利申請。目前發(fā)表SCI論文2篇，在投稿SCI論文3篇，中文核心論文8篇，申請國家發(fā)明專利8項(xiàng)（授權(quán)1項(xiàng)）。 最終通過上述實(shí)驗(yàn)確定綿羊和山羊源性成分同步檢測的引物和探針以及絕對靈敏度（1 pg）和相對靈敏度（0.1-1%）。此方法具有綿羊和山羊源性的特異性，來源于綿羊和山羊的肉乳樣品均出現(xiàn)相應(yīng)探針的典型擴(kuò)增曲線，且特異性探針Ct值≤35.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0；來源于非綿羊和山羊的肉乳樣品均沒有出現(xiàn)相應(yīng)探針的典型擴(kuò)增曲線，或特異性探針Ct值≥40.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證試驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)，起草了標(biāo)準(zhǔn)討論稿，現(xiàn)面向?qū)＜艺髑笠庖姟? 四、制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 （一）總體原則 1.合法性。嚴(yán)格遵循《食品安全法》等法律法規(guī)的有關(guān)規(guī)定。 2.科學(xué)性。按照有關(guān)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)和在開展指標(biāo)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，科學(xué)、合理制定該地方標(biāo)準(zhǔn)。 3.真實(shí)性。堅(jiān)持公開透明，從標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)、專家論證、征求意見等方面向社會(huì)公開征求意見和建議。 （二）編制原則：堅(jiān)持先進(jìn)性、實(shí)用性、可操作性、規(guī)范性、公開透明的原則。 五、主要條款的說明，主要技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、試驗(yàn)驗(yàn)證的論述 本標(biāo)準(zhǔn)是基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的綿羊和山羊源性成分同步檢測方法。方法具有特異性，絕對靈敏度和相對靈敏度可以達(dá)到1 pg和0.1-1%。此方法具有綿羊和山羊源性的特異性，來源于綿羊和山羊的肉乳樣品均出現(xiàn)相應(yīng)探針的典型擴(kuò)增曲線，且特異性探針Ct值≤35.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0；來源于非綿羊和山羊的肉乳樣品均沒有出現(xiàn)相應(yīng)探針的典型擴(kuò)增曲線，或特異性探針Ct值≥40.0，質(zhì)控探針Ct值≤35.0。試驗(yàn)驗(yàn)證過程參考上述具體實(shí)驗(yàn)過程以及相關(guān)發(fā)表論文材料與方法。經(jīng)過特異性分析、絕對靈敏度分析、摻假檢出限以及定量分析，檢出限（LOD）統(tǒng)計(jì)分析參照Probit analysis，此方法的各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)（特異性、靈敏度、檢出限）均達(dá)到編制標(biāo)準(zhǔn)的要求。 六、 重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果 無 七、采用國際標(biāo)準(zhǔn)或國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的，說明采標(biāo)程度，以及國內(nèi)外同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對比情況 目前，已經(jīng)存在六項(xiàng)羊源性檢測方法標(biāo)準(zhǔn)：飼料中牛羊源性成分的定性檢測 定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法（GB/T 20190-2006）；明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法（GB/T 25165-2010）；動(dòng)物源性飼料中反芻動(dòng)物源性成分(牛,羊,鹿)定性檢測方法 PCR方法（GB/T 21104-2007）；飼料中牛羊源性成分檢測 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法（NY/T 1946-2010）；食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)PCR法（SN/T 2051-2008）；動(dòng)物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法（SN/T 2980-2011）。在采用上述檢測標(biāo)準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)：目前缺乏基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉制品的綿羊和山羊源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)是基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的綿羊和山羊源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，具有快速、高通量以及去除假陰性等特征。 八、其他應(yīng)說明的事項(xiàng) 無 九、標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見情況匯總表 序號 意見 提出單位/專家 采納 不采納（說明原因） 1 1. 原理要針對本標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，具體的研發(fā)過程在編制說明中體現(xiàn)； 2. 所用試劑應(yīng)該體現(xiàn)配制方法，體現(xiàn)可操作性和可重復(fù)性； 3. PCR混合液要寫出配方； 4. 兼并引物要用相應(yīng)字母代替； 5. 目的基因（線粒體12S rRNA）的寫法有待商榷； 6. 儀器不能寫在一大段中，每個(gè)儀器設(shè)備是一段； 7. DNA提取實(shí)驗(yàn)步驟要具體，比如樣品的起始質(zhì)量； 8. 每個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)需要兩個(gè)平行； 9. 反應(yīng)程序不完整，修改格式以及增加收集熒光部分； 10. 缺乏PCR擴(kuò)增序列信息； 11. 質(zhì)量控制中內(nèi)容應(yīng)該修正為無熒光對數(shù)增長或Ct值≥40.0。 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（呼和浩特）/任超 采納 2 1. 試樣制備，可添加試樣制備時(shí)的取樣方法：如固體樣品的取樣點(diǎn)數(shù)、總樣品的四分法，保證樣品的均一性與代表性；每份樣品應(yīng)制備2個(gè)測試樣本提取DNA，即設(shè)立雙平行； 2. 各引物、探針可注明序列長度；擴(kuò)增后的目的片段也可注明序列長度； 3. 擴(kuò)增體系表中可注明模板的濃度； 4. CTAB法提取基因組，是否需要蛋白酶K，使得降解更加快速徹底； 5. 可增加附錄，使得使用者更方便配制各類溶液； 6. CTAB提取液中各成分標(biāo)示應(yīng)統(tǒng)一單位； 7. 5.1.3中，可標(biāo)明各成分使用量，方便使用者可選擇自行配制或購買預(yù)成品試劑。 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗(yàn)檢測中心/張彥斌 采納 3 1. 標(biāo)準(zhǔn)中“4原理”部分：凝練對所制定標(biāo)準(zhǔn)物種源性的原理描述，其中“定性分析”描述不準(zhǔn)確； 2. 標(biāo)準(zhǔn)中“5.1試劑與材料”部分：應(yīng)添加“除特別說明外，試劑配制所用溶劑都為重蒸餾水”； 3. 標(biāo)準(zhǔn)中“5.1.1、5.1.2”部分：所用試劑部分應(yīng)分開列明信息； 4. 標(biāo)準(zhǔn)中“5.1.3”部分：“實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液購買于具有資質(zhì)的試劑公司”宜改為“市售實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液” 5. 標(biāo)準(zhǔn)中“5.2儀器設(shè)備”部分：標(biāo)注微量移液器與pH計(jì)的精度； 6. 標(biāo)準(zhǔn)中“5.3.1試樣制備”部分：試樣制備中“明顯脂肪”、“復(fù)原乳”“固狀”等詞用法有待商榷； 7. 標(biāo)準(zhǔn)中“5.3.2 DNA提取”部分：實(shí)驗(yàn)具體操作步驟描述不符合標(biāo)準(zhǔn)制定要求，例如“消化”、“75%乙醇洗滌一次，晾干”、“上清與上清液”、“中間層”等； 8. 標(biāo)準(zhǔn)中“5.3.4.1 表2”部分：表2中體積“μL”可統(tǒng)一標(biāo)注于“體積（μL）”； 9. 編制說明中應(yīng)添加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，闡明所設(shè)計(jì)方法的有效性和可靠性。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)/田瑞華 采納