DBS61 0012-2016 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜中16種激素殘留的測定 液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜法.docx

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DBS61 陜西省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) DBS61/0012—2016 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜中16種激素殘留的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 陜西省衛(wèi)生和計劃生育委員會 發(fā)布 2016-07-01實施 2016-06-01發(fā)布 DBS61/0012—2016 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1給出的規(guī)則起草。 本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國陜西出入境檢驗檢疫局提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國陜西出入境檢驗檢疫局負(fù)責(zé)起草。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張璐，李瑩，何強(qiáng)，王菡，孔祥虹，鄒陽，付騁宇。 本標(biāo)準(zhǔn)屬首次發(fā)布。 13 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜中16種激素殘留的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蜂蜜中16種激素殘留的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）的檢測方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于蜂蜜中糖皮質(zhì)激素（曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸潑尼松）、雄性激素（甲睪酮、睪酮）、孕激素（孕酮）、腎上腺皮質(zhì)激素（羥基醋酸去皮質(zhì)酮）16種激素殘留定性和定量測定。 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 1.1 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 3 原理 試樣經(jīng)酶解，用乙腈提取目標(biāo)化合物后，經(jīng)固相萃取富集凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。 4 試劑與材料 除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682中規(guī)定的一級水。 4.1 乙腈：色譜純。 4.2 甲醇：色譜純。 4.3 甲酸：色譜純。 4.4 二氯甲烷。 4.5 乙酸銨。 4.6 乙酸。 4.7 b-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶（b-glucuronidase/arylsufastase）：含有b-葡萄糖醛苷酶134600 U/mL，芳基硫酸酯酶5200 U/mL。 4.8 無水硫酸鈉：650 ℃灼燒4 h，在干燥器中冷卻至室溫，貯于密封瓶中備用。 4.9 乙酸銨溶液（0.2 mol/L）：稱取15.4 g乙酸銨，加入1000 mL水溶解，用乙酸調(diào)節(jié)pH到5.2。 4.10 二氯甲烷-甲醇（6+4，體積比）：60 mL二氯己烷和40 mL甲醇混合。 4.11 0.1 %甲酸水溶液：準(zhǔn)確量取1 mL甲酸加水稀釋至1000 mL。 4.12 乙腈-水溶液（1+9，體積比）：10 mL乙腈和90 mL水混合。 4.13 標(biāo)準(zhǔn)品：曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸潑尼松龍、甲睪酮、睪酮、孕酮、醋酸去氧皮質(zhì)酮，純度均大于97 %，物質(zhì)英文名稱及CAS號見附錄A。 4.14 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）：分別準(zhǔn)確稱10.0 mg各標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，搖勻，-18 ℃避光保存，可保存12個月。 4.15 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1 mg/mL）：分別準(zhǔn)確量取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液各0.025 mL，于25 mL容量瓶中，用水溶解，0 ℃～4 ℃避光保存，可保存6個月。 4.16 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：根據(jù)需要，臨時吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.15）用水稀釋，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0 ℃～4 ℃避光保存，可保存6個月。 4.17 HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）：使用前依次用6 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）、6 mL甲醇、6 mL水活化。 4.18 氨基固相萃取柱（60 mg，3 mL）：使用前用6 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）活化。 5 儀器與設(shè)備 5.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。 5.2 分析天平：感量0.01 mg。 5.3 天平：感量0.01 g。 5.4 振蕩器 5.5 渦旋混勻器 5.6 高速離心機(jī) 5.7 固相萃取裝置 5.8 氮吹儀 5.9 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 5.10 離心管：50 mL。 5.11 有機(jī)系濾膜：0.22 mm。 6 試樣制備與保存 對無結(jié)晶的實驗室樣品，將其攪拌均勻。對有結(jié)晶的樣品，在封閉情況下，置于不超過60℃的水浴中溫?zé)?，震蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5 kg作為試樣，制備好的樣品置于樣品瓶中，密封，并做上標(biāo)記。 7 測定步驟 7.1 提取 準(zhǔn)確稱取試樣5 g（精確至0.01 g），于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2 mol/L乙酸銨溶液（4.9），渦旋混合，再加入b-葡萄糖醛苷酶/芳香基硫酸酯酶100 mL，于37 ℃±1℃震蕩酶解12 h。取出冷卻至室溫，加入20 mL乙腈震蕩提取15 min，4500 r/min下離心5 min，取乙腈層過無水硫酸鈉漏斗。再加入15 mL乙腈，重復(fù)上述提取過程。合并乙腈層， 40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用10 mL 0.2 mol/L乙酸銨溶液（4.9）溶解，待凈化。 7.2 凈化 提取液（7.1）以1.5 mL/min的速度上樣于活化過的HLB固相萃取柱（4.17）。將小柱減壓抽干。再將活化過的氨基柱（4.18）串聯(lián)在HLB固相萃取柱下方。用8 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗脫并收集洗脫液，取下HLB小柱，再用2 mL二氯甲烷-甲醇（4.10）洗氨基柱，合并洗脫液，于40℃氮?dú)獯蹈?，? mL乙腈-水（4.12）溶解殘渣，渦旋混勻，濾膜（5.11）過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。 7.4 測定 7.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD aQ （2.1×100 mm，3.0 mm）, 或相當(dāng)者； 柱溫：40℃； 流速：0.3 mL/min； 進(jìn)樣量：10.0 mL; 流動相：乙腈-0.1 %甲酸水，梯度洗脫，洗脫條件參見附錄B； 7.4.2 糖皮質(zhì)激素質(zhì)譜條件 a）電離源：電噴霧離子源； b）離子化方式：負(fù)離子模式； c）檢測模式：選擇離子反應(yīng)監(jiān)測； d）噴霧電壓：2500 V； e）氣化溫度：300 ℃； f）鞘氣（N2）：0.525 L/min； g）輔助氣（N2）: 4.5 L/min； h）離子傳輸管溫度：300 ℃； i）去簇電壓：2.0 V； j）碰撞氣（Ar）：199.9 Mpa。 k）特征離子參見附錄C.1。 7.4.3 雄性激素、孕激素、腎上腺皮質(zhì)激素質(zhì)譜條件 a）電離源：電噴霧離子源； b）離子化方式：正離子模式； c）檢測模式：選擇離子反應(yīng)監(jiān)測； d）噴霧電壓：3300 V； e）氣化溫度：300 ℃； f）鞘氣（N2）：0.525 L/min； g）輔助氣（N2）: 4.5 L/min； h）離子傳輸管溫度：300 ℃； i）去簇電壓：2.0 V； j）碰撞氣（Ar）：199.9 Mpa k）特征離子參數(shù)見附錄C. 2。 7.4.4 測定法 7.4.4.1 定性測定 通過試樣色譜圖的保留時間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、各色譜峰的特征離子與響應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各色譜峰的特征離子相對照定性，試樣與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的相對偏差不大于5 %；試樣特征離子的相對豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過表1的規(guī)定，則可判斷試樣中存在相應(yīng)的被測物。 表1 試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍 相對豐度（%） ＞50 ＞ 20～50 ＞10～20 ≤10 允許偏差（%） ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.4.2 定量測定 根據(jù)試樣中被測樣液的含量情況，按外標(biāo)法，以峰面積定量。選取待測物的響應(yīng)值在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)的濃度進(jìn)行測定，如果超出儀器線性響應(yīng)范圍應(yīng)進(jìn)行稀釋。在上述條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液中各目標(biāo)化合物的特征離子流色譜圖見附錄D。 7.5 平行試驗 按照7.1至7.4所述的測定條件和步驟對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定。 7.6 空白試驗 除不稱取試樣外，均按7.1至7.4所述的測定條件和步驟進(jìn)行。 8 結(jié)果計算和表達(dá) 試樣中各目標(biāo)化合物殘留量（mg/kg）：按式（1）計算： ………………………………(1) 式中： X—供試試樣中各目標(biāo)化合物殘留量，單位為微克每千克（mg/kg）； A—試樣溶液中各目標(biāo)化合物的峰面積； Cs—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各目標(biāo)化合物的濃度，單位為微克每升（mg/L）； V—樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）； As—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各目標(biāo)化合物的濃度，單位為微克每升（mg/L）； m—試樣質(zhì)量，單位為克（g）。 注：計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留兩位有效數(shù)字。 9 定量限、回收率和精密度 9.1 檢出限 本方法曲安西龍、潑尼松龍、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、氟米松、曲安奈德、醋酸氟氫松、氟氫可的松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、甲睪酮、睪酮、孕酮、醋酸去氧皮質(zhì)酮檢出限均為1.0 mg /kg，醋酸潑尼松檢出限為2.0 mg /kg。 9.2 回收率 蜂蜜中各種激素的回收率試驗數(shù)據(jù)見附錄E，在1.0~5.0 mg/kg添加水平上的回收率范圍為68.2 %~102.2 %。 9.3 精密度 本方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15 %。  附 錄 A （規(guī)范性附錄） 16種激素物質(zhì)的CAS號、分子式、分子量及英文名稱 A.1 16種激素物質(zhì)的CAS號、分子式、分子量及英文名稱 應(yīng)符合表A.1的規(guī)定。 表 A.1 化合物 CAS號 分子式 分子量 醋酸潑尼松龍Prednisolone Acetate 52-21-1 C23H30O6 402.48 醋酸可的松Cortisone Acetate 50-04-4 C23H30O6 402.48 潑尼松龍Prednisolone 50-24-8 C21H28O5 360.44 氫化可的松Hydrocortisone 50-23-7 C21H30O5 362.47 甲基潑尼松龍Methylprednisolone 83-43-2 C22H30O5? 374.47 醋酸地塞米松Dexamethasone Acetate 55812-90-3 C24H31FO7 434.5 地塞米松Dexamethasone 50-02-2 C22H29FO5 392.46 曲安西龍Triamcinolone 124-94-7 C21H27FO6 394.44 氟米松Flumethasone 2135-17-3 C22H28F2O5 410.45 氟氫可的松Fludrocortisone 127-31-1? C21H29FO5 380.45 曲安奈德Triamcinolone Acetonide 76-25-5 C24H31FO6 434.49 醋酸氟氫松Fluocinolone Acetonide 67-73-2 ?C24H30F2O6 452.49 睪酮Testosterone 58-22-0 C19H28O2 288.42 甲睪酮Methyltestosterone 58-18-4 C20H30O2 302.45 孕酮Progesterone 57-83-0 C21H30O2 314.46 醋酸去氧皮質(zhì)酮21-Hydroxyprogesterone-21-acetate 56-47-3 C23H32O4 372.