微生物學(xué)檢驗(yàn)課稿ppt課件

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第十章 食品微生物學(xué)檢驗(yàn),1,主要內(nèi)容,第一節(jié) 采樣 第二節(jié) 顯微鏡檢驗(yàn) 第三節(jié) 培養(yǎng)檢查 第四節(jié) 生化試驗(yàn) 第五節(jié) 血清學(xué)檢驗(yàn) 第六節(jié) 動(dòng)物試驗(yàn) 第七節(jié) 菌落總數(shù)測(cè)定 第八節(jié) 大腸菌群測(cè)定,2,第一節(jié) 采樣,一、采樣 采樣是從待鑒定的一大批食品中抽取小部分用于檢驗(yàn)的過(guò)程。采樣必須具有代表性。 （一）固體樣品,3,（二）液體樣品 原包裝瓶樣品取整瓶，散裝樣品可用無(wú)菌吸管或匙采取。冷凍液體食品，采取原包裝，放入隔熱容器內(nèi)。 （三）罐頭 根據(jù)廠別、商標(biāo)、品種來(lái)源等分類進(jìn)行采取原包裝樣品。,4,（四）注意事項(xiàng) 采樣時(shí)，首先要了解采樣食品的來(lái)源、生產(chǎn)時(shí)間、批號(hào)、加工、貯藏、包裝、運(yùn)輸?shù)惹闆r； 采樣的器械和容器須滅菌后才可使用。采樣時(shí)嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作； 不得加防腐劑； 液體食品需攪拌均勻后采取，固體樣品要在不同部位采取，使樣品盡量具有代表性； 取樣后，應(yīng)及時(shí)送檢，最多不得超過(guò)4h。,5,二、處理,（一）固體樣品 用無(wú)菌刀、剪或鑷子稱取不同部位樣品10g，剪碎，放入無(wú)菌容器內(nèi)，加定量水，制成1：10混懸液，進(jìn)行檢驗(yàn)。 （二）液體樣品 1.原包裝樣品 用點(diǎn)燃的酒精棉秋消毒瓶口，再用消毒過(guò)的紗布將瓶口蓋上，開(kāi)啟后，用無(wú)菌吸管直接吸取。,6,2.含二氧化碳的液體樣品 同上方法開(kāi)啟后，使氣體逸出后進(jìn)行檢驗(yàn)。 3.冷凍食品 融化后檢驗(yàn)。 （三）罐頭 1.密閉試驗(yàn) 2.膨脹試驗(yàn) 3.微生物檢驗(yàn),7,目的：觀察微生物細(xì)胞在生活時(shí)期原有的形狀、大小和確定細(xì)胞能否運(yùn)動(dòng)等。,第二節(jié) 顯微鏡檢驗(yàn),一、不染色標(biāo)本檢驗(yàn),在載玻片上滴一滴生理鹽水，再滴加少許要觀察的含菌液體或少量要觀察的固體培養(yǎng)物，使菌體均勻分布，蓋上蓋玻片即可鏡檢。,將待觀察的含菌液體滴在蓋玻片上，然后將其翻身，放置在凹孔載玻片上，使液滴懸掛在凹孔室內(nèi)。在進(jìn)行不染色標(biāo)本檢驗(yàn)時(shí)，一般用普通光學(xué)顯微鏡直接觀察。,8,二、染色標(biāo)本檢查,染色標(biāo)本能顯示微生物的形態(tài)、排列、一定的構(gòu)造及某些細(xì)胞成分的性質(zhì)及其分布的位置，可區(qū)別活菌與死菌，可鑒別微生物的種類等。,三、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法,,比例計(jì)數(shù)法：將已知顆粒濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，然后求出未知菌液的細(xì)胞濃度。,血球計(jì)數(shù)板法：用來(lái)測(cè)定一定容積中菌 數(shù)的常規(guī)方法。,9,一、培養(yǎng)基的種類,培養(yǎng)基是適合于微生物生長(zhǎng)發(fā)育需要的各種營(yíng)養(yǎng)成分配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，可供微生物在其中生長(zhǎng)繁殖。,第三節(jié) 培養(yǎng)檢查,10,二、微生物接種與培養(yǎng),（一）微生物接種,（二）微生物的培養(yǎng),常用方法：涂布法、劃線法、傾注法、點(diǎn)植法、穿刺法和浸洗法等。,,11,三、培養(yǎng)結(jié)果觀察,,（一）固體培養(yǎng)基上菌落形狀觀察,大小 形狀 邊緣 表面 隆起度 顏色及透明度,12,（二）液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)形狀的觀察,混濁度 沉淀 表面 培養(yǎng)液的顏色以及是否產(chǎn)氣等,（三）半固體培養(yǎng)基中菌落培養(yǎng)特性的觀察 主要觀察微生物需養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)情況。,13,四、培養(yǎng)計(jì)數(shù)法,（一）液體稀釋法 對(duì)未知菌樣作連續(xù)的10倍系列稀釋。選擇在適宜的3個(gè)連續(xù)的稀釋液中歌曲5ml試樣，接種到3組共15支裝有培養(yǎng)液的試管中。經(jīng)培養(yǎng)后，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查MPN表，再根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)即可計(jì)算出活菌含量。 （二）平板菌落計(jì)數(shù)法 取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在其凝固前混合均勻，或涂布已凝固的固體培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，從平板上（內(nèi)）出現(xiàn)的菌落數(shù)乘上菌液的稀釋倍度，即可計(jì)算出原菌液的含菌數(shù)。,14,五、一些新技術(shù)新方法,免疫擴(kuò)散法 RIA ELISA和免疫傳感器 ELISA雙抗夾心法 PCR技術(shù),15,一、糖類代謝試驗(yàn),（一）糖發(fā)酵試驗(yàn) 不同的微生物可對(duì)各種糖類、醇類、糖苷類等進(jìn)行分解，但其分解能力和分解產(chǎn)物均因不同的微生物而不同。,第四節(jié) 生化試驗(yàn),16,常用于糖發(fā)酵試驗(yàn)的糖類、醇類和糖苷類：,糖類 名稱 戊糖（C5H10O5） 阿拉伯糖（Arabinose） 木糖（xylose） 鼠李糖（rhamnose） 己糖（C6H12O11） 葡萄糖（glucose） 果糖（fructose） 甘露糖（mannose） 半乳糖（galactose） 三糖類（（C8H10O5）3） 棉子糖（raffinose） 落葉松糖（melizitose）,,,,,,17,糖類 名稱 雙糖類（C12H22O11） 麥芽糖（maltose） 乳糖（lactose） 蔗糖（sucrsoe） 海藻（trehalose） 纖維二糖（cellobiose） 蜜二糖（melibiose） 多糖類（（C6H10O5）3 ） 菊糖（inulin） 淀粉（starch） 肝糖（glycogen） 糊精（dextrin）,,,,,18,糖類 名稱 三元醇（C3H5（OH）3） 甘油（glycerol） 四元醇（C4H6（OH）4） 赤霉糖醇（erythitol） 五元醇（C5H7（OH）5） 核糖醇（adonitol） 六元醇（C6H7（OH）6） 阿拉伯膠醇（Arabitol） 甘露醇（mannitol） 半乳糖醇（dulcitol） 山梨醇（sorbitol） 環(huán)己六醇（（CHOH）8） 肌醇（inositol） 糖苷類 水楊苷（salicin） 七葉苷（aescukin） 松柏苷（coniferin）,19,二、蛋白質(zhì)及氨基酸代謝試驗(yàn),（二）甲基紅（MOR）試驗(yàn) （三）V－P（Voges-Proskauer）試驗(yàn) （四）β－半乳糖苷酶試驗(yàn),（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn) （二）硫化氫試驗(yàn) （三）尿素酶 （四）氨基酸脫氫酶試驗(yàn) （五）苯丙氨酸脫氨試驗(yàn),20,三、呼吸酶類試驗(yàn),（一）硝酸鹽還原試驗(yàn) （二）氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）試驗(yàn) （三）過(guò)氧化氫試驗(yàn),四、有機(jī)酸鹽及銨鹽利用試驗(yàn),（一）檸檬酸鹽利用試驗(yàn) （二）丙二酸鹽利用試驗(yàn),21,五、毒性酶類試驗(yàn),（一）軟磷脂酶試驗(yàn) （二）血漿凝固酶試驗(yàn) （三）鏈激酶試驗(yàn),六、其他生化試驗(yàn)（氰化鉀抗性試驗(yàn)）,氰化鉀（KCN）是呼吸鏈末端抑制劑，常用于腸桿菌科各屬的鑒別。,22,第五節(jié) 血清學(xué)檢驗(yàn),血清學(xué)檢驗(yàn)是根據(jù)抗原與相應(yīng)抗體在體外發(fā)生特異性結(jié)合，并在一定條件下出現(xiàn)各種抗原－抗體反應(yīng)的現(xiàn)象，用于檢驗(yàn)抗原或抗體的技術(shù)。 血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展迅速，主用應(yīng)用于：傳染病診斷、 病原微生物分類鑒定、抗原分析、毒素與抗毒素測(cè)定等方面。,23,一、抗原,凡是能刺激有機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，稱為抗原（antigen）。這一概念包括兩個(gè)基本內(nèi)容，一是刺激有機(jī)體產(chǎn)生抗體，通常稱之為抗原性（antigenicity）或免疫原性(immunogenicity)。另一是能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，稱為反應(yīng)原性(reaginicity)。,,24,（一）抗原的性質(zhì),異物性,大分子量,特異性,完整性,25,１. 完全抗原（complete antigen）:能在機(jī)體內(nèi)引起抗體形成，在體外可與抗體發(fā)生特異性 結(jié)合，并在一定條件下出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)的物質(zhì)。如細(xì)菌、病毒等微生物蛋白質(zhì)和外毒素等。,(二)抗原種類,２.不完全抗原（incomplete antigen）或稱半抗原（ hapten）:也稱之為辦抗原（hapten），不能單獨(dú)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，需與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但在試管內(nèi)可與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，并在一定條件下出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)的物質(zhì)。,26,,３.細(xì)菌抗原,表面抗原,菌體抗原,鞭毛抗原,,外毒素和類毒素,菌毛抗原,27,二、抗體,抗體(antibody)是機(jī)體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，亦稱免疫球蛋白(immunoglobulin，簡(jiǎn)稱Ig)。含有免疫球蛋白的血清，通常被稱為免疫血清或抗血清。,28,抗體的結(jié)構(gòu),29,抗體是一些具有免疫活性的球蛋白 在試管內(nèi)能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合 抗體的分子量都很高,（一）抗體的性質(zhì),,30,,,,１、根據(jù)其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分,,（二）抗體的種類,31,32,33,34,35,２.根據(jù)其抗體獲得方式分,,3.根據(jù)作用對(duì)象不同,4.根據(jù)與抗原接合后的可見(jiàn)反應(yīng)不同,,,,,36,三.抗原抗體反應(yīng)（血清學(xué)反應(yīng)）,抗原與抗體無(wú)論在體外或體內(nèi)均能發(fā)生特異性結(jié)合，根據(jù)抗原性質(zhì)，反應(yīng)條件及其參與反應(yīng)因素，表現(xiàn)為各種反應(yīng)，統(tǒng)稱為免疫反應(yīng)。若這種反應(yīng)表現(xiàn)在體外則稱之為血清學(xué)反應(yīng)。,37,,（一）血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn) 1、特異性和交叉性 2、可逆性 3、結(jié)合比列 4、敏感性 5、階段性 血清學(xué)反應(yīng)特點(diǎn)及用途（表）,38,39,,（二）影響血清學(xué)反應(yīng)的條件 1、電解質(zhì) 2、溫度 3、pH值 4、雜質(zhì)異物,40,四、血清學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用,（一）凝集反應(yīng) 1、直接凝集反應(yīng) （1）玻片法：通常為定性試驗(yàn)，用抗體測(cè)未知抗原，如鑒定菌種，測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型等。 （2）試管法：定量試驗(yàn)，用抗原測(cè)雪青中有無(wú)某種抗體及相對(duì)含量。 2、間接凝集反應(yīng) 利用某些與免疫無(wú)關(guān)的均一小顆粒物質(zhì)作為載體，將可溶性抗原（抗體）吸附于表面，在有電解質(zhì)存在適宜條件下，與相應(yīng)抗體（抗原）結(jié)合，發(fā)生凝集現(xiàn)象。,41,,（二）沉淀反應(yīng) 1、環(huán)狀法 常用于抗原定性試驗(yàn) 2、絮狀法 3、瓊脂擴(kuò)散法 （1）單向擴(kuò)散：常做抗體定量試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)抗 體預(yù)先在瓊脂中混勻，澆鑄成平板打孔， 抗原注入小孔（圖） （2）雙向擴(kuò)散：瓊脂澆鑄成平板打孔，抗原、抗 體分別注入小孔。（圖）,42,單向瓊脂擴(kuò)散,43,雙向瓊脂擴(kuò)散,44,凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的比較,沉淀反應(yīng),凝集反應(yīng),抗原 體積小總面積大 體積大總面積小大,抗體 需要少 需要多,,,,45,,（三）免疫電泳 將瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)結(jié)合的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。 1、對(duì)流免疫電泳：雙向擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合（圖） 2、火箭電泳：?jiǎn)蜗驍U(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合（圖） 3、瓊脂免疫電泳：先電泳，后雙向擴(kuò)散（圖）,46,對(duì)流免疫電泳,47,火箭電泳,48,免疫電泳,49,（四）補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng),指示系統(tǒng),反應(yīng)系統(tǒng),補(bǔ)體,50,（五）免疫標(biāo)記技術(shù),1、免疫熒光標(biāo)記技術(shù) 用熒光素對(duì)抗體（或抗原）進(jìn)行標(biāo)記，然后用于免疫學(xué)測(cè)定。 （1）直接法 抗原 熒光素標(biāo)記過(guò)的抗抗體 抗原－結(jié) 合物抗體 （2）間接法 抗原－抗體結(jié)合 滴加熒光素標(biāo)記過(guò)的抗抗體 抗原－抗體－抗抗體復(fù)合物 （3）補(bǔ)體法 抗原－抗體－補(bǔ)體復(fù)合物 滴加熒光素標(biāo)記過(guò)的抗 補(bǔ)體抗體 抗原－抗體－補(bǔ)體－抗補(bǔ)體抗體復(fù)合物,,,,,,,51,52,2、免疫酶標(biāo)記技術(shù),用化學(xué)方法將酶與抗原或抗體結(jié)合起來(lái)，形成酶標(biāo)記物，但不影響抗原或抗體的免疫活性及酶的催化活性。 常用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、 堿性磷酸酶(AKP)做標(biāo)記 3、同位素標(biāo)記技術(shù) 用放射性同位素3H 14C等標(biāo)記抗原或抗體,53,用于病原微生物的分離與鑒定、病原微生物的致病性測(cè)定、微生物毒素的毒力測(cè)定一進(jìn)免疫血清的制備等。 試驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、家貓、家禽等 接種方法：灌服、皮膚劃痕、皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射、腦內(nèi)注射。結(jié)扎腸段注射以及滴眼等。,第六節(jié) 動(dòng)物試驗(yàn),54,第七節(jié) 菌落總數(shù)測(cè)定,菌落總數(shù)指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性等），得到1g或1ml檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。該培養(yǎng)條件下所得結(jié)果只包括一群在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)，主要作為判定食品被污染程度的指標(biāo)。 具體操作參考國(guó)標(biāo)GB4789.2-94,55,第八節(jié) 大腸菌群測(cè)定,大腸菌群指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)自人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。 以100ml（g）檢樣大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。 具體操作參考國(guó)標(biāo)GB4789.3-94,56,