PI染色法測細胞周期.ppt
《PI染色法測細胞周期.ppt》由會員分享,可在線閱讀,更多相關《PI染色法測細胞周期.ppt(26頁珍藏版)》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。
PI染色法測細胞周期,,一) 細胞DNA含量檢測,細胞固定后用PI (Propidium iodide碘化丙啶),染色,因為PI特異性結合于細胞DNA,熒光強度與PI的結合量呈良好的線性關系,根據(jù)這個原理,可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。,,單參數(shù)直方圖,圖中2N代表G0/G1期細胞,4N代表G2/M期細胞,兩者中間代表S期細胞。這是以2倍體和4倍體細胞為主的流式DNA圖,DNA細胞周期分析,細胞周期,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,,,,,,s,DNA分析,DNA含量,細胞數(shù)量,,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,含量與凋亡關系,DNA亞G1峰的檢測:利用PI染色,檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例,代表凋亡細胞數(shù)。 凋亡過程中,細胞內(nèi)核酸酶的釋放,將DNA降解,分解成小的片段,在標本制備中的固定處理時,細胞膜的完整性被破壞,使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出,造成總體DNA含量減少,成為亞2倍體。,2. 凋亡研究,在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰,即凋亡峰。 檢測調(diào)亡,可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。,Annexin V Assay,,,,圖 Annexin V/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死,,,Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04 Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48,,圖 FCM測試細胞周 期分布和凋亡,根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測,在形態(tài)上,早期細胞核固縮,染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂;細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變小;細胞膜皺折卷曲,但早期細胞膜的完整性未受到破壞 凋亡細胞的FSC ?SSC ? 細胞壞死時,細胞腫脹,F(xiàn)SC ?,SSC ?,,正常人靜止體細胞有46條染色體,相當于7.10-12 pg DNA/細胞核,我們稱之為二倍體細胞,而正常增殖細胞則存在不同的DNA含量。在細胞周期(G0,G1,S,G2 ,M)的各個時期,DNA含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化:在G1期,細胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成,但DNA含量仍保持二倍體;,,進入S期后,DNA開始合成,這時細胞核內(nèi)DNA的含量介于G1和G2期之間;當DNA復制結束成為4倍體時,細胞進入G2期,G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì),直到進入M期,因此,單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期;一旦有絲分裂發(fā)生,細胞分裂成兩個子細胞,這兩個子細胞或者進入下一個細胞周期,或者進入靜止期(G0期),而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分。因此,整個復制周期可以描述為G0/G1,S,G2/M期。,,通過核酸染料標記DNA,并由流式細胞儀進行分析,可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài),計算出G0/G1,S及G2/M的百分含量,了解細胞的增殖能力;結合DNA指數(shù)分析,還可進行凋亡、異倍體等檢測。,,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,細胞濃度及質(zhì)量要求,單細胞和核的上機濃度應約106/ml。濃度太低,上機時樣本的流速不得不提高,這樣就會影響檢測的CV。濃度太高,則可能導致染料的相對不足,最終使染色不飽和,同樣影響CV和檢測結果。 制備完成后的標本應用光學顯微鏡檢查其質(zhì)量:細胞是否聚集或過多的碎片。,,染料的選擇取決于流式激光的配置。488nm的激光下應用PI(碘化丙啶),由于PI也與RNA結合,所以分析前樣本應用Rnase處理.。重要的是染料要足夠,以保證飽和結合。PI的推薦濃度是至少20ug/106 個細胞。其最佳濃度為50ug/106 個細胞。,操作步驟,取一瓶生長期的A549細胞,倒掉瓶中舊的培養(yǎng)液,加入3mlPBS,細胞生長面在下輕輕晃動細胞瓶,然后去掉液體,加入1ml胰蛋白酶消化1~5分鐘(以鏡下觀察決定) 加入5mlPBS輕輕吹打細胞生長面,制成細胞懸液,將細胞懸液移至15ml離心管中1500rpm離心5min,去上清。 加入500ulPBS輕輕吹打細胞團成細胞懸液,在旋渦狀態(tài)下逐滴加入2ml-20℃95%冷乙醇,混勻后固定30min。,,加入5mlPBS,1500rpm離心5min,去上清液。 加入5mlPBS重懸細胞,1500rpm離心5min,去上清液。 加入800ulPI染液,用槍輕輕吹打細胞團,混勻,室溫避光染色30min 上機檢測。,影響熒光染色的因素,溫度:溫度高于20℃時,即出現(xiàn)溫度淬滅。 2、PH:PI在7.2~7.6,保持熒光染料分子與溶劑間的電離平衡。 3、熒光染料濃度:染料太少,結合不完全。染料過多,又會出現(xiàn)濃度淬滅現(xiàn)象。 4、固定劑:醛類固定劑會干擾插入性染料與核酸分子的結合,造成熒光發(fā)射強度減弱。,- 配套講稿:
如PPT文件的首頁顯示word圖標,表示該PPT已包含配套word講稿。雙擊word圖標可打開word文檔。
- 特殊限制:
部分文檔作品中含有的國旗、國徽等圖片,僅作為作品整體效果示例展示,禁止商用。設計者僅對作品中獨創(chuàng)性部分享有著作權。
- 關 鍵 詞:
- PI 染色 細胞周期
裝配圖網(wǎng)所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網(wǎng)友學習交流,未經(jīng)上傳用戶書面授權,請勿作他用。
鏈接地址:http://m.jqnhouse.com/p-2383549.html