南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué).ppt

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第五節(jié) 酶的提取純化與活力測定,一.酶的分離與提取,酶提取基本的方法,細(xì)胞產(chǎn)生的酶有二類： 1. 由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶，稱為細(xì)胞外酶。這類酶大部分屬于水解酶。此類酶通常含量高，容易得到。 2. 在細(xì)胞內(nèi)合成后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為細(xì)胞內(nèi)酶，該類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞器結(jié)合，不僅有一定的區(qū)域性，而且催化的反應(yīng)具有一定順序性。,A. 了解所分離酶在細(xì)胞中分布,B. 材料的獲取,在提取某一酶時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料。由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料限制，成本又很大，因此，目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。,一.酶的分離與提取,酶提取基本的方法,C. 酶分離純化的主要步驟,1.主要步驟為：抽提、純化、結(jié)晶 抽提：破碎細(xì)胞，動(dòng)植物組織一般可用組織搗碎器；或者加石英砂研磨，將材料做成丙酮粉或進(jìn)行冰凍融解 ；對(duì)細(xì)菌，常采用加砂或加氧化鋁研磨和超聲波振蕩方法破碎。 大多數(shù)酶一般都用緩沖液進(jìn)行抽提，緩沖液的類型決定于酶的種類和理化特性，抽提液pH最好遠(yuǎn)離等電點(diǎn) 。,一.酶的分離與提取,酶提取基本的方法,C. 酶分離純化的主要步驟,1.主要步驟：抽提、純化、結(jié)晶 濃縮：抽提液或發(fā)酵液中酶濃度往往很低，必須濃縮富集。常用的濃縮方法有：加中性鹽或冷乙醇沉淀后再溶解，膠過濾濃縮以及超過濾濃縮法等。 純化：純化過程就是去除雜質(zhì)的過程。原則：一方面是要提高酶的純度，另一方面卻也使酶的總量不可避免有所損失。,一.酶的分離與提取,酶提取基本的方法,C. 酶分離純化的主要步驟,1. 主要步驟為：抽提、純化、結(jié)晶 結(jié)晶：濃縮液經(jīng)過各種方法的純化，可得到較純的結(jié)晶產(chǎn)品。,一.酶的分離與提取,酶提取基本的方法,C. 酶分離純化的主要步驟,2. 選擇分離純化方法 a.鹽析法（如硫酸胺） b.有機(jī)溶劑沉淀法 c.層析純化法（葡聚糖凝膠、陰離子交換層析） d.等電點(diǎn)法 e.吸附分離法,一.酶的分離與提取,酶提取基本的方法,1. 酶活力概念,酶活力 是酶促反應(yīng)的能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化的某一化學(xué)反應(yīng)速度的快慢，即酶催化的反應(yīng)速度越快，酶活力越高，反之則表示該酶活力低。,二.酶活力及其測定,但是，酶的定量并非對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，而是對(duì)它的催化能力進(jìn)行定量。,所以，酶的定量就是測定酶的活力，也即測定酶促反應(yīng)的速度。,二.酶活力及其測定,1. 酶活力概念,如何測定酶活力？,以產(chǎn)物濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，可得到酶促反應(yīng)速度曲線,注意：初速度的測定是關(guān)鍵，為什么？,二.酶活力及其測定,1. 酶活力概念,可見，反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨著時(shí)間的延長，反應(yīng)速度逐漸下降,,原 因 底物濃度的降低、產(chǎn)物的增加造成的逆反應(yīng)的加快 產(chǎn)物的抑制作用 酶本身逐漸失活,二.酶活力及其測定,1. 酶活力概念,常用的酶活力單位有三種：,A. 國際單位 (IU),這種單位是由國際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定的。,在標(biāo)準(zhǔn)條件(25℃、最適pH、最適底物濃度)下，酶每分鐘催化 1 mmol 底物轉(zhuǎn)化，這樣的速度所代表的酶的活力即酶的量定義為1個(gè)國際單位 (IU)。,2. 酶活力與單位,二.酶活力及其測定,B. Katal,是由國際酶學(xué)委員會(huì)于1972年規(guī)定的一種新單位,在最適條件下，酶每秒鐘催化1 mol 底物轉(zhuǎn)化，這樣的速度所代表的酶的活力即酶的量定義為 1個(gè)Kat 。,1 Kat = 60106 IU,2. 酶活力與單位,2. 酶活力與單位,二.酶活力及其測定,C. 自定義的活力單位,這種單位簡單方便，省去了許多計(jì)算；但只能進(jìn)行酶活力的相對(duì)比較。,酶習(xí)慣上或測定時(shí)使用的反應(yīng)速度的單位定義為酶的活力單位。 有的甚至直接用測得的物理量，如單位時(shí)間內(nèi)消光值的變化 (DA/t) 表示酶活力單位。,2. 酶活力與單位,2. 酶活力與單位,二.酶活力及其測定,指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù),比活力是酶制劑純度的常用指標(biāo) —— 比活力越大，表示酶越純,3. 酶的比活力,二.酶活力及其測定,純化倍數(shù) = 每次比活力/第一次比活力,產(chǎn)率(回收率) = 每次總活力/第一次總活力100%,4. 酶的純度,二.酶活力及其測定,1. 某酶在一定條件下，5 min內(nèi)使30 mmol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，問該酶的活力（IU）是多少？,2. 從某細(xì)胞中提取的一種蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白質(zhì)，總活力為360單位。經(jīng)過一系列純化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，總活力為288單位。請(qǐng)問回收率是多少？純化了多少倍？,4. 酶的純度,二.酶活力及其測定,不同樣品同一酸制劑的總活力、總蛋白、比活力比較,4. 酶的純度,二.酶活力及其測定,