2018-2019學年高中生物 專題1 基因工程 1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具教學案（含解析）新人教版選修3.doc

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DNA重組技術(shù)的基本工具 1.基因工程的基本原理是基因重組，外源DNA能在受體細胞表達的理論基礎(chǔ)是密碼子的通用性。 2．DNA重組技術(shù)的基本工具有限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和使目的基因進入受體細胞的載體。 3．限制性核酸內(nèi)切酶可識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并在特定位點上切割。 4．Ecoli DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端也能連接平末端。 5．質(zhì)粒作為基因工程的載體需具備的條件有：能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并自我復制；具有一個或多個限制酶切割位點；具有標記基因。 6．在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 一、基因工程的概念及其誕生與發(fā)展 1．基因工程的概念[填表] 別名 DNA重組技術(shù) 操作環(huán)境 生物體外 操作對象 基因 操作水平 DNA分子水平 結(jié)果 創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品 2．基因工程的誕生和發(fā)展 (1)基礎(chǔ)理論的突破：DNA是遺傳物質(zhì)的證明；DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立；遺傳密碼的破譯。 (2)技術(shù)的發(fā)明：基因轉(zhuǎn)移載體和工具酶的相繼發(fā)現(xiàn)；DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明；DNA體外重組的實現(xiàn)及重組DNA表達實驗的成功；第一例轉(zhuǎn)基因動物的問世及PCR技術(shù)的發(fā)明。 二、DNA重組技術(shù)的基本工具 1．限制性核酸內(nèi)切酶(又稱限制酶) (1)來源：主要來自原核生物。 (2)功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。 (3)結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。 (4)應(yīng)用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ識別的堿基序列和酶切位點分別為G↓AATTC和CCC↓GGG，在圖中寫出兩種限制酶切割DNA后產(chǎn)生的末端并寫出末端的種類。 EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶識別的堿基序列不同，切割位點不同(填“相同”或“不同”)，說明限制酶具有專一性。 2．DNA連接酶 (1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 (2)種類：[填表] 　　種類 比較　　 Ecoli DNA連接酶 T4DNA連接酶 來源 大腸桿菌 T4噬菌體 特點 只能連接黏性末端 既可以連接黏性末端，又可以連接平末端 3．基因進入受體細胞的載體 (1)種類 ①常用載體：質(zhì)粒 ②其他載體：λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 (2)作用 ①作為運載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。 ②利用它在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量復制。 (3)載體須具備的條件及其作用(連線) 三、重組DNA分子的模擬操作 1．所用材料用具中，剪刀代表EcoRⅠ，透明膠條代表DNA連接酶。 2．用剪刀進行DNA“切割”時，應(yīng)找出G—A—A—T—T—C序列并在G—A之間作切口進行“切割”。 3．若操作正確，不同顏色的黏性末端能互補配對。 1．基因工程是一種新興的生物技術(shù)，實施該工程的最終目的是(　　) A．定向提取生物體的DNA分子 B．定向?qū)NA分子進行人工“剪切” C．在生物體外對DNA分子進行改造 D．定向改造生物的遺傳性狀 解析：選D　基因工程也稱DNA重組技術(shù)，它是按照人類的意愿，將某種基因有計劃地轉(zhuǎn)移到另一種生物中去的新技術(shù)，故實施基因工程的最終目的是定向改造生物的遺傳性狀。 2．下列關(guān)于限制酶的說法，正確的是(　　) A．限制酶廣泛存在于各種生物中，其化學本質(zhì)是蛋白質(zhì) B．一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列 C．不同的限制酶切割DNA后都會形成黏性末端 D．限制酶均特異性地識別由6個核苷酸組成的序列 解析：選B　限制酶主要存在于微生物中；限制酶具有專一性，即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列；不同的限制酶切割DNA后會形成黏性末端或平末端；限制性核酸內(nèi)切酶均能特異性地識別核苷酸序列，但識別的核苷酸序列不一定由6個核苷酸組成。 3．“分子縫合針”——DNA連接酶“縫合”的部位是(　　) A．堿基對之間的氫鍵 B．堿基與脫氧核糖 C．雙鏈DNA片段間的磷酸二酯鍵 D．脫氧核糖與脫氧核糖 解析：選C　相鄰的兩個脫氧核苷酸之間由磷酸和脫氧核糖形成的磷酸二酯鍵連接，DNA連接酶連接的是此化學鍵。 4．下列通常不被用作基因工程載體的是(　　) A．細菌質(zhì)?！　　　　　．λ噬菌體的衍生物 C．動植物病毒 D．細菌核區(qū)的DNA 解析：選D　常用的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。細菌的核區(qū)由一個大型的環(huán)狀DNA分子經(jīng)反復折疊纏繞而成，它控制著細菌的主要性狀，一般不能用作基因工程的載體。 5．質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列有關(guān)質(zhì)粒的說法錯誤的是(　　) A．質(zhì)粒不僅存在于細菌中，某些病毒也具有 B．質(zhì)粒作為載體時，應(yīng)具有標記基因和多個限制酶切點 C．質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于擬核(區(qū))外的細胞質(zhì)基質(zhì)中 D．質(zhì)粒能夠在宿主細胞中穩(wěn)定保存，并在宿主細胞內(nèi)復制 解析：選A　質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，不僅存在于細菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中沒有質(zhì)粒；質(zhì)粒作為載體時，應(yīng)具有標記基因和多個限制酶切割位點；質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于細胞核或擬核外的細胞質(zhì)基質(zhì)中；質(zhì)粒能夠在宿主細胞中穩(wěn)定保存，并在宿主細胞內(nèi)復制。 1．限制性核酸內(nèi)切酶 (1)作用特點：具有專一性，表現(xiàn)在以下兩個方面 ①能夠識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。 ②能夠切割特定序列中的特定位點。 (2)識別序列的特點：遵循堿基互補配對原則，無論是奇數(shù)個堿基還是偶數(shù)個堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復排列的。 如以為軸，兩側(cè)堿基互補對稱。 (3)作用產(chǎn)物：黏性末端或平末端。 ①黏性末端：是限制性核酸內(nèi)切酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時形成的，如圖所示： ②平末端：是限制性核酸內(nèi)切酶在它識別序列的中心軸線處切開時形成的，如圖所示： 2．限制性核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的關(guān)系 (1)區(qū)別： 作用 應(yīng)用 限制性核酸內(nèi)切酶 使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂 用于提取目的基因和切割載體 DNA 連接酶 在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵 用于目的基因和載體的連接 (2)兩者的關(guān)系可表示為： 3．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較 比較項目 DNA連接酶 DNA聚合酶 相同點 作用實質(zhì)相同，都是催化磷酸二酯鍵的形成 不同點 是否需要模板 不需要 需要 接DNA鏈 雙鏈 單鏈 作用過程 在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵 將單個核苷酸加到已存在的DNA單鏈片段上，形成磷酸二酯鍵 作用結(jié)果 將已存在的DNA片段連接 合成新的DNA分子 用途 基因工程 DNA復制 [題組沖關(guān)] 1．下列關(guān)于幾種酶作用的敘述，錯誤的是(　　) A．DNA連接酶能使不同脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接 B．RNA聚合酶能與基因的特定位點結(jié)合，催化遺傳信息的轉(zhuǎn)錄 C．一種限制酶能識別多種核苷酸序列，并切割出多種目的基因 D．DNA聚合酶能把單個脫氧核苷酸分子連接成一條DNA單鏈 解析：選C　限制酶具有專一性，一種限制酶一般只能識別一種核苷酸序列，并在特定位點切割DNA分子。DNA連接酶能使不同DNA片段的脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接，重新形成DNA分子；RNA聚合酶能與基因的特定位點結(jié)合，催化遺傳信息的轉(zhuǎn)錄；DNA聚合酶能以DNA的一條鏈為模板，把單個脫氧核苷酸分子連接成一條DNA單鏈，復制形成新的DNA分子。 2．(江蘇高考改編)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識別序 列及切 割位點 圖1 圖2 (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用__________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。 (2)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________________________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (3)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 解析：(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因時，應(yīng)保留目的基因和至少一個標記基因結(jié)構(gòu)的完整性，即遵循“目的基因切兩側(cè)，標記基因留一個”的基本原則，最好選擇切割產(chǎn)生不同末端的兩種限制酶同時切割質(zhì)粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來的不正常表達，因此據(jù)圖分析應(yīng)選擇的限制酶為BclⅠ和HindⅢ，切割后質(zhì)粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標記基因。酶切后的載體和目的基因通過DNA連接酶的作用形成重組質(zhì)粒。(2)因為BclⅠ和BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端相同，所以可以被DNA連接酶連接，連接部位的6個堿基對序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的識別序列，連接部位不能被這兩種酶切開。(3)由圖可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識別并切割，因此圖中質(zhì)粒上存在3個Sau3AⅠ的切割位點，若將3個切割位點之間的DNA片段分別編號為a、b和c，則完全酶切(3個切割位點均被切割)會產(chǎn)生3種大小的DNA片段，即為a、b和c；考慮只切1個切割位點，有三種情況，都產(chǎn)生一種大小的DNA片段，即大小均為a＋b＋c；考慮切2個切割位點，則會產(chǎn)生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3AⅠ識別并切割圖中質(zhì)粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。 答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接 (2)　都不能　(3)7 [方法規(guī)律] 限制酶的選擇技巧 根據(jù)目的基因兩端的限制酶 切割位點確定限制酶的種類 ①應(yīng)選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶， 如圖甲可選擇PstⅠ； ②不能選擇切割位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶， 如圖甲不能選擇SmaⅠ； ③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接， 也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒， 如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶 (但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點) 根據(jù)質(zhì)粒的特點 確定限制酶的種類 ①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致， 以確保產(chǎn)生相同的黏性末端； ②質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選 擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限 制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切割位 點不只一個，則切割重組后可能丟失某些片段， 若丟失的片段含復制起點區(qū)，則切割重組后的 片段進入受體細胞后不能自主復制 1．種類 (1)常用載體：質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，具有自我復制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 (2)其他載體：λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 2．具備條件 (1)能自我復制：能夠在受體細胞中進行自我復制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制。 (2)有切割位點：有一個至多個限制酶切割位點，供外源基因插入。 (3)具有標記基因：具有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。 (4)無毒害作用：對受體細胞無毒害作用，否則受體細胞將受到損傷甚至死亡。 3．作用 (1)用它作為運輸工具，將目的基因送入受體細胞中。 (2)利用它在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復制。 [名師點撥]　細胞膜上的載體與基因工程中的載體不同 (1)化學本質(zhì)不同：細胞膜上的載體化學成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動植物病毒等。 (2)功能不同：細胞膜上的載體功能是協(xié)助細胞膜控制物質(zhì)進出細胞；基因工程中的載體是一種“分子運輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細胞。 [題組沖關(guān)] 3．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識別序列及切割位點分別是 —C↓TTAAG— 和 —G↓AATTC—。如圖表示的是四種質(zhì)粒和目的基因，其中箭頭所指部位為酶的識別位點，質(zhì)粒的陰影部分表示標記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是(　　) 解析：選A　目的基因兩側(cè)有MunⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶的識別序列，用這兩種酶切割都可得到目的基因，且未破壞標記基因的結(jié)構(gòu)；B中質(zhì)粒無標記基因，不符合作為載體的條件；C、D中的標記基因都會被破壞。 4．(全國卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}： (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是___________________________；并且__________________________和____________________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________________________________。 在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有__________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自________________。 解析：(1)質(zhì)粒作為載體，應(yīng)具備的基本條件有：有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細胞中能自我復制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制；有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇等。(2)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素進行篩選，其中未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目 的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養(yǎng)基上存活，二者不能區(qū)分。含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養(yǎng)基上存活，二者也不能區(qū)分。若要將含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌進一步篩選出來，還需要使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。(3)某些噬菌體經(jīng)改造后作為載體，導入受體細胞后，其DNA復制所需的原料來自受體細胞。 答案：(1)能自我復制、具有標記基因(答出兩點即可) (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素　(3)受體細胞 [方法規(guī)律] 載體上標記基因的標記原理 載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，原理如圖所示： [隨堂基礎(chǔ)鞏固]　 1．以下有關(guān)基因工程的敘述，正確的是(　　) A．基因工程是細胞水平上的生物工程 B．基因工程的產(chǎn)物對人類都是有益的 C．基因工程育種的優(yōu)點之一是目的性強 D．基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變 解析：選C　基因工程是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行有目的地改造，然后導入受體細胞內(nèi)，使目的基因在受體細胞內(nèi)成功表達，產(chǎn)生人類所需要的基因產(chǎn)物。因而基因工程是分子水平上的生物工程，其產(chǎn)生的變異屬于基因重組，而不屬于人工誘變；基因工程雖是按照人們的意愿改造生物，目的性強，但并不是所有的基因產(chǎn)物對人類都有益。 2．有關(guān)DNA重組技術(shù)中的工具——“分子縫合針”“分子手術(shù)刀”“分子運輸車”的組合正確的是(　　) ①DNA連接酶?、贒NA聚合酶　③限制酶 ④RNA聚合酶?、葺d體 A．②③⑤　　　　　　　B．①③④ C．①③⑤ D．④③⑤ 解析：選C　基因工程中，“手術(shù)刀”是限制酶，“縫合針”是DNA連接酶，“運輸車”是指將目的基因?qū)胧荏w細胞的載體。 3．下列有關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的敘述，正確的是(　　) A．用限制性核酸內(nèi)切酶切割一個DNA分子中部，獲得一個目的基因時，被水解的磷酸二酯鍵有2個 B．限制性核酸內(nèi)切酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大 C. 和序列被限制酶切出的黏性末端堿基數(shù)不同 D．只有用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理含目的基因的片段和質(zhì)粒，才能形成重組質(zhì)粒 解析：選B　用限制酶切割DNA分子中部獲得一個目的基因時，需剪切2次，水解磷酸二酯鍵4個；限制酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越大；和序列被限制酶切出的黏性末端均有4個堿基；切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶，如果不同的限制酶切割DNA分子所產(chǎn)生的末端存在互補關(guān)系，則兩末端也可連接。 4．下列關(guān)于DNA連接酶作用的敘述，正確的是(　　) A．將單個核苷酸加到某個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵 B．將斷開的2個DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵 C．連接2條DNA鏈上堿基之間的氫鍵 D．只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來，而不能將兩者之間的平末端進行連接 解析：選B　DNA連接酶和DNA聚合酶都能催化磷酸二酯鍵的形成，但DNA連接酶是在2個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將2個DNA片段連接成重組DNA分子；DNA聚合酶則是將單個的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯鍵，合成新的DNA分子。 5．下列四條DNA片段，可能是由同一種限制酶切割而成的是(　　) A．①②　　　B．②③　　　C．③④　　　D．②④ 解析：選D　只有②和④的黏性末端的堿基都是互補的，它們可能是由同一種限制酶切割而成的。 6．下列有關(guān)基因工程和酶的敘述，正確的是(　　) A．同種限制酶既可以切割目的基因又可以切割質(zhì)粒，因此不具備專一性 B．載體的化學本質(zhì)與載體蛋白相同 C．限制酶不能切割煙草花葉病毒的核酸 D．DNA連接酶可催化脫氧核苷酸鏈間形成氫鍵 解析：選C　一種限制酶可識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子，因此具有專一性。載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等，成分不單一；載體蛋白的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。煙草花葉病毒的核酸為RNA，限制酶不能切割。DNA連接酶可催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 7．根據(jù)圖表的內(nèi)容回答問題： 幾種限制酶識別序列切割位點 限制酶 SmaⅠ EcoRⅠ PstⅠ 切割位點 (1)假設(shè)所用的限制酶均能將所識別的位點完全切開，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到________種DNA片段。如果將質(zhì)粒載體和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切產(chǎn)物再加入DNA連接酶，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有________________________、______________________________________________、 ________________________。 (2)為了防止目的基因和質(zhì)粒表達載體酶切后的末端任意連接，酶切時應(yīng)該選用的酶是_______________________________________________、____________________。 解析：(1)含目的基因的DNA分子上含有2個EcoRⅠ和1個PstⅠ的酶切位點，3個切點全部切開，則形成4種DNA片段。質(zhì)粒與含目的基因的DNA片段都用EcoR Ⅰ切割，目的基因兩端和質(zhì)粒切口處的黏性末端相同，只考慮兩個DNA片段相連，則會形成3種連接產(chǎn)物，即質(zhì)粒與質(zhì)粒相連、質(zhì)粒與目的基因相連、目的基因與目的基因相連。(2)為了防止任意連接，可選用EcoRⅠ和SmaⅠ兩種酶同時切割。 答案：(1)4　質(zhì)粒載體－質(zhì)粒載體連接物　目的基因－目的基因連接物　質(zhì)粒載體－目的基因連接物 (2)EcoRⅠ　SmaⅠ [課時跟蹤檢測]　 一、選擇題 1．下圖為DNA分子的某一片段，其中①②③分別表示某種酶的作用部位，則相應(yīng)的酶依次是(　　) A．DNA連接酶、限制酶、解旋酶 B．限制酶、解旋酶、DNA連接酶 C．解旋酶、限制酶、DNA連接酶 D．限制酶、DNA連接酶、解旋酶 解析：選C　解旋酶可催化堿基之間氫鍵(①)的斷裂，限制酶可使兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵(②)斷開，而DNA連接酶則催化磷酸二酯鍵(③)的形成。 2．下列關(guān)于DNA重組技術(shù)基本工具的說法，正確的是(　　) A．DNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端 B．微生物中的限制性核酸內(nèi)切酶對自身DNA無損害作用 C．限制酶切割DNA后一定能產(chǎn)生黏性末端 D．質(zhì)粒是基因工程中唯一的載體 解析：選B　DNA連接酶分為兩類：Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，前者只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來，而后者既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，也可以連接雙鏈DNA片段的平末端。細菌內(nèi)的限制酶能限制異源DNA的侵入并使之失活，即能將外源DNA切斷，從而保護自身的遺傳特性。限制酶切割DNA后，產(chǎn)生的末端有黏性末端和平末端兩種。質(zhì)粒是常用的載體，除此之外，基因工程中用到的載體還有λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。 3．玉米的PEPC酶固定CO2的能力較水稻的強60倍。我國科學家正致力于將玉米的PEPC基因?qū)胨局?，以提高水稻產(chǎn)量。下列有關(guān)該應(yīng)用技術(shù)的敘述，錯誤的是(　　) A．該技術(shù)是在DNA水平上進行設(shè)計和施工的 B．該技術(shù)的操作環(huán)境是生物體內(nèi) C．該技術(shù)的原理是基因重組 D．該技術(shù)的優(yōu)點是定向產(chǎn)生人類需要的生物類型 解析：選B　由題意可知，該技術(shù)為基因工程，是在生物體外進行的操作。 4．基因工程在操作過程中需要限制酶、DNA連接酶、載體三種工具。以下有關(guān)基本工具的敘述，正確的是(　　) A．所有限制酶的識別序列均由6個核苷酸組成 B．所有DNA連接酶均能連接黏性末端和平末端 C．真正被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒 D．原核生物內(nèi)的限制酶可切割入侵的DNA分子而保護自身 解析：選D　大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4、5或8個核苷酸組成；DNA連接酶包括Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，前者只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來；在基因工程操作中真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。 5．質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列關(guān)于質(zhì)粒的說法正確的是(　　) A．質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)都要整合到染色體DNA上 B．質(zhì)粒是獨立于細菌擬核DNA之外的小型細胞器 C．基因工程使用的質(zhì)粒一定含有標記基因和復制原點 D．質(zhì)粒上堿基之間數(shù)量存在A＋G＝U＋C 解析：選C　基因工程使用的載體需有一至多個酶切位點，具自我復制的能力，有標記基因，對受體細胞安全，且分子大小適合。質(zhì)粒進入宿主細胞后不一定都要整合到染色體DNA上，如宿主細胞是細菌細胞則不需整合。質(zhì)粒是小型環(huán)狀雙鏈DNA分子而不是細胞器，也不會有堿基U。 6．圖1表示DNA的基本結(jié)構(gòu)，圖2表示染色體DNA的片段，箭頭是某種限制酶的識別序列和作用位點，下列相關(guān)說法正確的是(　　) A．圖1中a所示部位即圖2中箭頭所示部位 B．圖2所示的DNA片段被限制酶切割后獲得的末端形式與圖1下端相同 C．Ecoli DNA連接酶可以將兩個圖1所示結(jié)構(gòu)連接成為一個DNA片段 D．基因工程的載體必須具有圖2所示的堿基序列 解析：選A　圖2箭頭所示的部位表示兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，圖1中a部位是磷酸二酯鍵；圖2所示的DNA片段被限制酶切割后將獲得黏性末端，而圖1所示的DNA具有的末端是平末端；Ecoli DNA連接酶只可以“縫合”雙鏈DNA片段的黏性末端，圖1所示為平末端；限制酶有多種，基因工程中的載體具有其中一個或幾個限制酶識別的序列即可，不必一定含有圖2所示的堿基序列。 7．某線性DNA分子含有3 000個堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示。下列有關(guān)說法正確的是(　　) a酶切割產(chǎn)物(bp) b酶再次切割產(chǎn)物(bp) 1 600；1 100；300 800；300 A．在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有3個和2個 B．a(chǎn)酶與b酶切出的黏性末端不能相互連接 C．a(chǎn)酶與b酶切斷的化學鍵不相同 D．用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進行反復切割、連接操作，若干循環(huán)后，序列會明顯增多 解析：選D　a酶切割后形成3個片段，說明a酶的切割位點有2個，則識別序列有2個；b酶切割a酶的切割產(chǎn)物后得到800 bp、300 bp的片段，說明在a酶的產(chǎn)物中，1 600 bp中有一個切割位點，被切成兩個800 bp片段，1 100 bp中有一個切割位點，被切成800 bp片段和300 bp片段，即b酶的識別序列有2個。a酶與b酶切出的黏性末端可互補，因而能相互連接。a酶與b酶切斷的化學鍵均為磷酸二酯鍵。 a酶切割后形成的黏性末端為：　 b酶切割后形成的黏性末端為：　 當用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進行反復切割、連接操作后，①和④、②和③的連接產(chǎn)物會增多。 8．下面是四種不同質(zhì)粒的示意圖，其中ori為復制必需的序列，amp為氨芐青霉素抗性基因，tet為四環(huán)素抗性基因，箭頭表示一種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點。若要得到一個能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的含重組DNA的細胞，應(yīng)選用的質(zhì)粒是(　　) 解析：選C　A項破壞了復制必需的序列。B項氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因都完好，在四環(huán)素培養(yǎng)基上和氨芐青霉素培養(yǎng)基上都能生長。C項氨芐青霉素抗性基因被破壞，四環(huán)素抗性基因完好，能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長。D項氨芐青霉素抗性基因完好，四環(huán)素抗性基因被破壞。 9．下表所示為常用的限制酶及其識別序列和切割位點，由此推斷以下說法，正確的是(　　) 限制酶名稱 識別序列和切割位點 限制酶名稱 識別序列和切割位點 BamHⅠ ATCC KpnⅠ GGTA EcoRⅠ ATTC Sau3AⅠ ATC HindⅡ GTAC SmaⅠ CCGG 注：Y＝C或T，R＝A或G。 A．限制酶切割后不一定形成黏性末端 B．限制酶的切割位點一定在識別序列的內(nèi)部 C．不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端 D．一種限制酶只能識別一種核苷酸序列 解析：選A　由表中信息可知，HindⅡ能識別4種不同的核苷酸序列；Sau3AⅠ酶的切割位點在識別序列的外部；BamHⅠ酶與Sau3AⅠ酶切割后能形成相同的黏性末端；SmaⅠ酶切割后產(chǎn)生的是平末端。 10．對下圖所示黏性末端的相關(guān)說法錯誤的是(　　) A．甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性核酸內(nèi)切酶催化產(chǎn)生的 B．甲、乙具相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲、丙之間不能 C．DNA連接酶作用位點在b處，催化磷酸基團和脫氧核糖之間形成化學鍵 D．切割甲的限制性核酸內(nèi)切酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子 解析：選C　甲圖表示在G和A之間進行剪切，乙圖表示在C和A之間進行剪切，丙圖表示在C和T之間進行剪切，因此三者需要不同的限制性核酸內(nèi)切酶進行剪切；甲和乙的黏性末端相同，能夠通過堿基互補配對形成重組DNA分子，但甲和丙不行；DNA連接酶作用的位點是磷酸二酯鍵，乙圖中的a和b分別表示磷酸二酯鍵和氫鍵；甲和乙形成的重組DNA分子相應(yīng)位置的DNA堿基序列為，而甲圖表示在G和A之間切割，所以該重組序列不能被切割甲的限制性核酸內(nèi)切酶識別。 二、非選擇題 11．下列是基因工程的有關(guān)問題，請回答： (1)限制性核酸內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的__________(填化學鍵名稱)斷裂，形成的末端總體可分為兩種類型，分別是________________。 (2)目的基因和載體重組時需要的工具酶是________，與限制性核酸內(nèi)切酶相比，它對所重組的DNA兩端堿基序列____________(填“有”或“無”)專一性要求。 (3)如圖表示的是構(gòu)建表達載體時的某種質(zhì)粒與目的基因。已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。 分析可知，最好選擇限制酶________切割質(zhì)粒，限制酶________切割目的基因所在的DNA，這樣做的好處分別是________________________、_____________________________。 解析：(1)限制性核酸內(nèi)切酶作用的化學鍵是磷酸二酯鍵。限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后形成平末端或黏性末端。(2)目的基因與載體連接需要用DNA連接酶。(3)限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—，用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒只會破壞一個標記基因。 答案：(1)磷酸二酯鍵　黏性末端和平末端　(2)DNA連接酶　無　(3)Ⅰ?、颉∶涪袂懈钯|(zhì)粒不會把兩個標記基因都破壞　目的基因兩端均有酶Ⅱ的識別序列 12．目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如下圖所示。 (1)構(gòu)建人工質(zhì)粒時要有抗性基因，以便于_________________________________。 (2)pBR322分子中有單個EcoRⅠ限制酶作用位點，EcoRⅠ只能識別序列—GAATTC—，并只能在G和A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個EcoRⅠ的切點，請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端：__________________________________。 (3)pBR322分子中另有單個的BamHⅠ限制酶作用位點，現(xiàn)將經(jīng)BamHⅠ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復________鍵，成功獲得了重組質(zhì)粒，說明_______________________________________________。 (4)為了檢測上述重組質(zhì)粒是否導入原本無Ampr和Tetr的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果(空圈表示與圖二對照無菌落的位置)。與圖三空圈相對應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是____________________，圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導入的是_____________________________________________________。 解析：(1)質(zhì)粒作為基因表達載體的條件之一是要有抗性基因，以便于篩選(鑒別)目的基因是否導入受體細胞。(2)同一種限制酶切割DNA分子產(chǎn)生的黏性末端相同，根據(jù)題意可知：該目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端為： 　　　　　　　　目的基因 —G　　　AATTC—…… —G　　　AATTC— —CTTAA　　　G—…… —CTTAA　　　G— (3)DNA連接酶催化兩個DNA片段形成磷酸二酯鍵；而通過DNA連接酶作用能將兩個DNA分子片段連接，表明經(jīng)兩種限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。(4)由題意知：由于與圖三空圈相對應(yīng)的大腸桿菌能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，而不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，故可推知與圖三空圈相對應(yīng)的圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素。由圖二、圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌都能抗氨芐青霉素，而經(jīng)限制酶BamHⅠ作用后，標記基因Tetr被破壞，故導入目的基因的大腸桿菌不能抗四環(huán)素，即多數(shù)大腸桿菌導入的是pBR322質(zhì)粒。 答案：(1)篩選(鑒別)目的基因是否導入受體細胞 (2)如下所示： 　　　　　　　　目的基因 —G　　　AATTC—…… —G　　　AATTC— —CTTAA　　　G—…… —CTTAA　　　G— (3)磷酸二酯　兩種限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同 (4)能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素　pBR322質(zhì)粒 13．(全國卷Ⅲ)圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 圖(b) 根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： (1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_____________________________________________。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達的原因是_________________________________________________________。 圖(c) (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是______________。 解析：(1)由題圖可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制性內(nèi)切酶的共同識別序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此經(jīng)BamHⅠ酶切得到的目的基因可以與圖(b)所示表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。(2)在基因表達載體中，啟動子應(yīng)位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能順利地轉(zhuǎn)錄，再完成翻譯過程，即順利表達。圖(c)中甲所示的目的基因插入在啟動子的上游，丙所示目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄，因此目的基因不能表達。(3)常見的DNA連接酶有Ecoli DNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。 答案：(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄(其他答案合理即可)(3)Ecoli DNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶