瓊脂糖凝膠電泳詳細(xì)過程與步驟.ppt

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瓊脂糖凝膠電泳Agarosegelelectrophoresis,天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉是從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。,瓊脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷,D-半乳糖,核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段,1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定6.樣品易回收，常用于制備。,瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)1.機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法,DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。,DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。,二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定。,瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測。,溴化乙錠（EthidiumBromide,EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。,三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品質(zhì)粒DNA樣品。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。瓊脂糖，1XTBE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液,四、實(shí)驗(yàn)步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）,⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。,⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。,⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。,⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約30min-60min。,⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。,⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。,,,123M,1、DNA分子的大小雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比；2、瓊脂糖濃度濃度越低，相同核酸分子遷移越快；3、DNA的構(gòu)象同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀,DNA的遷移速率決定因素,4、凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。5、所用的電壓低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。6、瓊脂糖種類常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；,不同類型瓊脂糖的性質(zhì),不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍,常用的電泳緩沖液,4℃保存?zhèn)溆?,7、電泳緩沖液,TAE和TBE電泳緩沖液比較,都是常用電泳緩沖液，二者相比：1）TAE的緩沖容量較低，如長時(shí)間電泳會被消耗，此時(shí)凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。,凝膠載樣緩沖液,載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。,6凝膠載樣緩沖液,瓊脂糖凝膠中DNA的檢測,通過染色,紫外燈下檢測。主要采用溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法。,使用EB染色注意事項(xiàng),（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸（3）EB使用時(shí)的配制、貯存及使用EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。,凝膠中DNA的成像,可以用透射或入射紫外光對EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。,關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)技巧和方法\幾點(diǎn)注意事項(xiàng),1）加樣時(shí)槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。2）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。3）應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時(shí)樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。4）在實(shí)驗(yàn)加樣中不一定每一個(gè)樣品都換一個(gè)槍頭，可在陽極槽中反復(fù)吸打電泳緩沖液以清洗。（對于Southern印跡轉(zhuǎn)移和需要回收DNA片段的電泳，則應(yīng)該每一個(gè)樣品用一個(gè)槍頭加樣，避免樣品交叉污染。）,5）凝膠中加入EB進(jìn)行電泳，便于紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會導(dǎo)致線形DNA遷移率下降，這在酶切質(zhì)粒與空白對照質(zhì)粒一起電泳時(shí)應(yīng)值得注意。6）電泳過程中，溴化乙錠向負(fù)極移動，與DNA泳動的方向相反，較長時(shí)間的電泳會造成靠正極方向的凝膠中溴化乙錠含量低，會對含量較少的小分子DNA片段檢測困難。處理方法是：將凝膠在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分鐘。7）判斷正負(fù)極的另一方法是負(fù)極氣泡（H2）比正極氣泡（O2）多一倍。,