瓊脂糖凝膠電泳標準操作流程.doc

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瓊脂糖凝膠電泳操作標準流程 一、實驗目的 瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經濟快速等優(yōu)點。本銅人陣學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術， 此關為能力考核，通關成功后，代表具備操作瓊脂糖電泳的能力。 二、實驗原理 瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影響核酸分子泳動率的因素主要還是：1、DNA分子大??；2、瓊脂糖濃度；3、DNA構想；4、所用的電壓；5、瓊脂糖種類；6、電泳緩沖液 核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射BE-DNA復合物時，出現不同的效應。254nm的紫外線照射時，靈敏度最高，但對DNA損傷嚴重；360nm紫外線照射時，雖然靈敏度較低，但對DNA損傷小，所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且對DNA損傷不是很大，所以也比較適用。 三、材料、試劑及器具 1、材料 不同大小的基因組片段； 2、試劑 Hind III digest DNA Marker（分子量標準）(TaKaRa)；D2000(TianGen)； BIOWESTAGAROSE（西班牙瓊脂糖）；加樣緩沖液（6x）：溴酚黃；電泳緩沖液（1TAE）；溴化乙錠（EB）； 3、儀器及器具 （1）移液器、吸頭、錐形瓶 （2）電泳系統：電泳儀、水平電泳槽、托盤、膠托、梳子等。 （3）紫外透射儀、微波爐、電子天平 四、操作步驟 1.器具清洗：首先將配膠、電泳、染膠所需要的器具清洗干凈，包括托盤、膠托、梳子、電泳槽、染膠盤（EB污染，需獨立清洗）。清洗流程為：先用自來水沖洗三次，然后用純水沖洗三次，最后用紙巾或醫(yī)用紗布擦干。若需對電泳產物進行膠回收，則還需用75%酒精對器具進行消毒。 2.配膠：根據基因組片段大小，配置相應濃度的瓊脂糖凝膠。首先將錐形瓶洗干凈并加入少量純水煮沸，然后量取一定量的電泳緩沖液（1TAE）至錐形瓶中，再稱取相應量的BIOWESTAGAROSE（西班牙瓊脂糖）倒入錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，最后放入微波爐煮，煮膠的過程中需注意安全，應適當搖勻，防止爆沸。煮好的凝膠需無氣泡、色澤均勻。 將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，及時將凝膠倒入裝好的干凈模具中。 待凝膠完全凝固后，將凝膠小心轉移至4℃冰箱，冷凍30min，然后拔梳子。此時，凝膠需平整、不漏孔，可以用于電泳檢測。 3.電泳準備：先將干凈的電泳槽排放整齊并做好標記，然后把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負極（注意：①放凝膠前，需將膠托底部的凝膠抹干凈，防止膠托在電泳槽中滑動；②此時，可順便觀察凝膠是否漏孔），再往電泳槽中倒入一定量的電泳緩沖液（1TAE）至剛好將凝膠淹沒。（注意保持桌面衛(wèi)生，防止緩沖液灑到桌面） 4.驗孔：用2ul 6溴酚黃加入到每一個膠孔中，檢測凝膠膠孔是否漏孔。若不漏孔，則可在凝膠孔底部看到一條黃色條帶；若漏孔，則看不到條帶。（注意：驗孔完畢之后，需將凝膠固定在電泳槽中央） 5.上樣：將樣品、6溴酚黃按3：1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣，上樣順序應與電泳槽上的標記一致，最后點上一定量的Ladder。（注意：①上樣時必須確保上樣順序正確無誤，樣品間不混淆，點樣后的空管子先放在電泳槽旁邊，用于核查；②點樣時不戳孔、不外漏、不溢出；③點樣時需小心槍頭不要碰到凝膠，以免凝膠挪動，若凝膠已經挪動，需等樣品完全沉到底部后，再固定凝膠） 6.電泳：確認已經正確上樣后，雙手蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽（注意：確認電極正確連接），設置電泳參數：電壓：120V，電流：400mA，時間：30min； 注意確認電極、電泳參數完全正確之后，最后按star 鍵開始電泳。 7.染膠：電泳結束之后，帶上PE手套，小心滑出凝膠，把凝膠轉移到干凈的PE手套上（注意：PE手套上應做好標記，確保樣品、電泳槽、PE手套的標記是一致），小心地將凝膠放入相應標記的EB染膠盤中，蓋上蓋子染30min。其中，染膠盤放在EB暗房中，EB染液的配方為：100ml 1TAE + 5ul EB燃料。（注意：①配制EB染液和染膠時需戴上乳膠手套、PE手套，必要時可戴上口罩，染膠時動作要輕，防止濺起EB染液；②注意區(qū)分EB污染區(qū)與非污染區(qū)，防止EB污染區(qū)向非污染區(qū)擴散） 8.凝膠成像：帶上PE手套，將凝膠從染膠盤中撈出，放在染膠時的那個PE手套上（注意：撈膠時需小心防止凝膠斷裂、滑落，盡量把多余的EB染液甩干），將凝膠放入凝膠成像系統中，按照“Tanon凝膠成像系統操作規(guī)程”進行操作拍照。（注意：拍照時需嚴格區(qū)分EB污染區(qū)與非污染區(qū)，防止EB污染區(qū)污染電腦、鍵盤及鼠標），最后保存膠圖信息至規(guī)定的文件夾內，命名規(guī)則為：日期+姓名+工號+部門+電泳銅人陣考核。 五、注意事項 1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質，務必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的EB暗房中操作，操作時戴上乳膠手套，必要時戴上PE手套和口罩