瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理).doc

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打印 瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳，普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好，其分辯力極高，甚至相差1bp的DNA段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前，一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。 瓊脂糖凝膠電泳原理： 瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D-半乳糖和3,6脫水L-半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1%-3%,加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會(huì)被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。 瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質(zhì)來說是比較大的，對蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時(shí)蛋白質(zhì)分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。例如對于雙鏈DNA,電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)，而與堿基排列及組成無關(guān)。另外，一些低熔點(diǎn)的瓊脂糖在62 ℃時(shí)熔化，因此其中的樣品(如DNA)，可以在加熱到熔點(diǎn)的水浴中放置一段時(shí)間，重新溶解到溶液中而回收。 由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應(yīng)用得相對較少。 目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下： (1) 瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。 (2) 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98%~99%)，近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。 (3) 瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。 (4) 電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理： 聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉雙丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N- methylenebisacrylamide)聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通常是加入催化劑過硫酸銨(AP)以及加速劑四甲基乙二胺(TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基。溶液的pH對聚合作用是重要的，因?yàn)檫^低 pH沒有足夠的堿基加速催化反應(yīng)，同樣過多的氧分子存在，會(huì)使聚合作用很快停止。所以制備凝膠時(shí)，在加過硫酸銨之前，混合物必須抽去空氣。核黃素催化的聚合作用，常用于制備濃縮膠，因?yàn)檫@樣制得的凝膠孔度要大些。核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)，產(chǎn)生自由基使Acr發(fā)生聚合作用。