聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作方法.doc

系統(tǒng)Ⅰ (PH值8.9)(7.2%) 系統(tǒng)Ⅱ (PH值7.5)(7.5%) 系統(tǒng)Ⅲ (PH值4.3)(15%) 系統(tǒng)Ⅳ (PH值2.9)(7.5%) 溶液號 組份/100 ml PH 值 溶液號 組份/100ml PH值 溶液號 組份/100ml PH值 溶液號 組份/100ml PH值 1 1mol/l HCl 48.0ml Tris 36.3克 TEMED 0.46ml 8.9 15 1mo;/L HCl 48.0ml Tris 6.85克 TEMED 0.46ml 7.5 17 1mol/L KOH 48.0ml 醋酸17.2 mlTEMED 4.0ml 4.3 20 1mol/l KOH 12.0ml 醋酸.25ml TEMED 1.15ml 2.9 2a 丙烯酰胺 28.0克 雙丙烯酰胺0.735克 8 2 丙烯酰胺 30.0克 雙丙烯酰胺0.8克 6 8 丙烯酰胺 60.0克 雙丙烯酰胺0.4克 21 過硫酸銨 2.8克 3 過硫酸銨 0.14克 16 1N H3PO4 39.0ml Tris 4.95克TEMED 0.46ml 5.5 18 過硫酸銨 0.28克 22 1N KOH 48.0升 醋酸2.95ml 5.9 4a 1N HCl 48ml Tris 5.98克 TEMED 0.46ml 6.7 19 1N KOH 48.0ml 醋酸2.87ml TEMED 0.46ml 6.7 5 丙烯酰胺 10.0克 雙丙烯酰胺2.5克 6.7 6 核黃素 4.0mg 7 蔗糖 40.0克 電極緩沖液： Tris 6.0克 甘氨酸 28.8克 加水至 1升 使用：10%稀釋液 8.3 電極緩沖液： 二乙基巴比妥 5.82克 Tris 1.0克 加水至 1升 7.0 電極緩沖液： β-丙氨酸 32.2克 醋酸 8.0克 加水至1升 使用：10%稀釋液 4.5 電極緩沖液： 甘氨酸 28.1克 醋酸 3.06ml 加水至1升 使用：10%稀釋液 4.0 電極：上槽接負(fù)極Θ 下槽接正極⊕ 電極：上槽接負(fù)極Θ 下槽接正極⊕ 電極：上槽接正極⊕ 下槽接負(fù)極Θ 電極：上槽接正極⊕ 下槽接負(fù)極Θ 各溶液混合比 各溶液混合比 各溶液混合比 各溶液混合比 濃縮膠 分離膠 濃縮膠 分離膠 濃縮膠 分離膠 濃縮膠 分離膠 1份4a號 2份5號 1份6號 4份7號 1份1號 2份2a號 1份水 4份3號 1份16號2份5號 1份6號 4份7號 1份15號 2份2號 1份水 4份3號 1份19號 2份5號 1份6號 4份7號 1份17號 2份8號 1份水 4份18號 1份22號 2份5號 1份6號 4份7號 4份20號 2份2號 2份21號 (2)指示劑配制 蛋白質(zhì)樣品通常是無色的，為了觀察和估計(jì)樣品在凝膠上遷移情況，常加指示劑作為電泳遷移的可見標(biāo)志。對堿性緩沖系統(tǒng)，一般用溴酚藍(lán)或酚紅，對于酸性緩沖系統(tǒng)，一般用甲基綠或次甲基蘭。指示劑可直接加在樣品中，也可加在電泳槽的緩沖液中，也可加在玻管中。 溴酚藍(lán)通常配制成0.1%的母液備用。 (3)染色劑配制 蛋白質(zhì)的染色方法很多，常用的染色劑有氨基黑10B，考馬斯亮藍(lán)R250，考馬斯亮藍(lán)G250等，有關(guān)配制濃度，染色方法以及同工酶的顯色方法見操作過程中的染色部分。 4.操作技術(shù) (1)凝膠制備 配制凝膠前，應(yīng)把玻璃管裝好。裝玻管的方式很多：在凝膠架的孔洞內(nèi)，加少許40%蔗糖溶液，然后把洗凈干燥的玻璃管套上乳膠管，插入架的孔洞內(nèi)，使玻璃管、乳膠管與孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶蓋封口，或者用附有玻璃短柱的乳膠管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在試管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培養(yǎng)皿中，然后用1%瓊脂趁熱倒在培養(yǎng)皿中，冷卻后，玻璃管口即被瓊脂凝膠封住。 配制凝膠時(shí)，先將所需的貯備液自冰箱中取出，放至室溫下預(yù)溫。 聚丙烯酰胺凝膠通常只制備二種膠。先制備分離膠，再在分離膠上面制備濃縮膠，樣品膠一般不制作，這是因?yàn)棰儆行悠窌种颇z聚合；②光照可引起某些蛋白質(zhì)變性；③多了一道手續(xù)，延長制膠時(shí)間。 分離膠的制備：按表4比例混合貯存液，(先不與過硫酸銨混合)，放在真空干燥器中抽氣，排除溶液中空氣。抽氣后在貯存液中加入過硫酸銨混勻，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入膠液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好標(biāo)記，注膠到相同的高度。務(wù)必勿使氣泡出現(xiàn)。為了使凝膠表面平整，在凝膠表面再慢慢地加入一層水，約3～5mm高度，消除凝膠的彎月面。加水要小心，切勿沖亂界面。加水的另一作用是隔絕空氣中氧與膠液接觸。以防影響頂部膠層的聚合。注射器中殘留的膠液要立即清洗掉，以防膠液在針頭與注射器中聚合，而使其損壞。 水層放好后，靜置30分鐘，使凝膠進(jìn)行化學(xué)聚合反應(yīng)。聚合最適溫度為25℃。當(dāng)水剛加入膠面時(shí)，水與凝膠形成一界面，后界面慢慢消失，當(dāng)凝膠聚合時(shí)，水與凝膠之間又出現(xiàn)界面。界面的再出現(xiàn)表明凝膠已經(jīng)聚合，再靜置20～30分鐘，聚合便完全。 分離膠的預(yù)電泳(此步驟應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要決定取舍)：凝膠聚合程度一般在90%以上。殘留的物質(zhì)，尤其是過硫酸銨，對某些樣品(如酶)會造成鈍化或引起其它人為效應(yīng)。因此有時(shí)需要在正式電泳前，先用電泳方法除去這些殘留物，稱為“預(yù)電泳”。若直接用光密度計(jì)來掃描分離的區(qū)帶，則預(yù)電泳更為重要，因未聚合的丙烯酰胺單體對紫外光有較高吸收，會干擾測定。步驟：去除玻管封口，倒出玻管中凝膠上的水分，并用分離膠緩沖液洗滌一下。把玻管插入電泳裝置中。上下電極槽中均加入分離膠緩沖液，預(yù)電泳的電流為3mA/管，時(shí)間需30分鐘～2小時(shí)。預(yù)電泳不能在制好濃縮膠后進(jìn)行，也不能用電極緩沖液進(jìn)行，不然會破壞不連續(xù)系統(tǒng)，而使?jié)饪s效應(yīng)失效。 濃縮膠的制備：分離膠聚合好后，或已經(jīng)過預(yù)電泳的分離膠，用注射器小心吸去水層，用濾紙條吸去殘余的水。按表4中比例混合濃縮膠液(也預(yù)先抽氣，抽氣時(shí)不要與核黃素混合，使用時(shí)再混勻)，先用這種凝膠液漂洗一下分離膠頂，除去漂洗液后，再用注射器加濃縮膠溶液1cm左右，各管加的高度應(yīng)一致，并在上面加水層壓平膠面。放在兩只20W以上功率的日光燈下，約離燈管10～15cm處，光下聚合60分鐘左右，當(dāng)濃縮膠由淺黃色變?yōu)椴煌该鞯娜榘咨?，即聚合完成，取出水層，吸干后用電極緩沖液洗滌，準(zhǔn)備加樣。濃縮膠應(yīng)臨用前制備。 (2)樣品的準(zhǔn)備 聚丙烯酰胺盤狀電泳可用于分離各種蛋白質(zhì)、核酸等樣品。例如血清、唾液、細(xì)胞膜蛋白，動(dòng)植物及微生物的各種蛋白提取液，昆蟲的體液，各種酶制品，色素蛋白復(fù)合體以及核糖核酸等。初學(xué)者可用現(xiàn)成的蛋白質(zhì)樣品如血清練習(xí)操作。 盤狀電泳所需要的樣品是很少的。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)凝膠管按體積，需要5～100μl的樣品(約0.1～2mm高)；按含量需要5～100μg。實(shí)際上就是用0.1%濃度的樣品5～100μl。由于樣品組分的不同，用量可有一定的幅度。對于只含有少數(shù)組分的樣品，通常用10～20μg，對于含有多種組分的樣品，可用到200μg。即每一凝膠的樣品容納量不僅指所加的樣品總量，更重要的是指樣品混合物組分的量。所加樣品液量的精確性將影響重復(fù)性，誤差要不大于5%。 近來，樣品膠一般已改用樣品液中加入5%～20%的蔗糖或10%甘油代替，因?yàn)闃悠纺z的作用主要是抗對流，蔗糖液和甘油能起同樣的效果。 如果樣品離子強(qiáng)度太高，會引起分界面模糊不清，嚴(yán)重時(shí)完全不能進(jìn)行電泳。因離子強(qiáng)度太高時(shí)降低了蛋白質(zhì)的電動(dòng)電位，同時(shí)電導(dǎo)過高，在樣品部分幾乎沒有電勢梯度，以至樣品的泳動(dòng)速度近于零，不能泳動(dòng)。硫酸銨鹽析的樣品或柱層析高鹽濃度的洗脫部分，必須透析除鹽，務(wù)必使其電導(dǎo)低于分離膠的電導(dǎo)，以便形成足夠的電勢梯度，使區(qū)帶在分離之前進(jìn)行濃縮變窄。 如果樣品過稀，加樣體積太大時(shí)，相應(yīng)地加厚濃縮膠層。玻璃管也要適當(dāng)加長。通常稀樣液與濃縮膠的比不大于1∶1.2。 一個(gè)生物樣品(粗抽提物)，常需要事先經(jīng)過處理(高速離心，微孔濾膜過濾，柱分離等)去除沉淀，消除混濁?；蛑蝗】扇苄圆糠诌M(jìn)行電泳。不然常有許多物質(zhì)留在凝膠與緩沖液的界面上，阻塞凝膠，干擾分離。當(dāng)樣品裝載量與樣品溶解度不相應(yīng)時(shí)，也會在濃縮膠上或濃縮膠與分離膠界面上產(chǎn)生沉淀，并造成拖尾現(xiàn)象(隨著電泳過程，沉淀逐漸溶解，逐漸進(jìn)入)。 加樣前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，應(yīng)先讓空氣進(jìn)去，再拔管子，防止凝膠拉壞。下槽中放滿緩沖液，把玻管固定在盤狀電泳槽上槽的洞中。安裝時(shí)要特別注意保證凝膠管垂直和橡膠塞孔密封不漏。管的下端懸一滴電極緩沖液。先在下槽放上電極緩沖液，再把上槽放在下槽上，避免管下有氣泡。然后加樣。 加樣方法因人習(xí)慣不同而略有差異。有的把樣品與增加比重的蔗糖及指示劑先混在一起加樣；有的指示劑單獨(dú)加在玻璃管中或在上槽電極緩沖液中滴上幾滴指示劑。加樣時(shí)，有的先加好樣液，再在樣品上加幾滴緩沖液，然后在樣液上加電極槽緩沖液；有的先在上槽中加滿電極緩沖液，然后用加樣器插在緩沖液中往膠管濃縮膠上方加樣?？偟脑瓌t，先提高樣品的比重，后加樣，加樣和加電極緩沖液互不干擾。 (3)電泳 在電泳槽中注滿電極緩沖液。緩沖液應(yīng)事先在冰箱中預(yù)冷，上槽電極緩沖液必須浸沒玻管和電極。連接直流穩(wěn)壓電源，緩沖液系統(tǒng)為堿性時(shí)上槽為負(fù)極，下槽為正極。緩沖系統(tǒng)為酸性時(shí)則相反。Davis標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)的凝膠電泳，負(fù)極在上，正極在下，電泳槽一般放在冰箱中，保持溫度在0～4℃。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流，開始時(shí)用1～2mA/管，電泳3～5分鐘后，再逐漸升高到4mA/管。不要一開始就電流很高。電流最好不要超過5mA/管。太高的電流強(qiáng)度會造成產(chǎn)熱量大，使分離失敗。如果高溫對樣品不利，可降低電流，延長時(shí)間，或進(jìn)行有效冷卻，在整個(gè)電泳過程中，一般要求電流保持穩(wěn)定。電泳時(shí)間與所用緩沖液和樣品有關(guān)，一般根據(jù)指示劑的遷移來決定，如果指示劑已遷移到凝膠柱的下口附近，或已遷移管長的3/4距離時(shí)，就可停止電泳，關(guān)閉電源，取出玻璃管。 上槽電極緩沖液可連續(xù)使用幾次，但必須每次測一下PH，如PH值發(fā)生改變就不能再使用。每次電泳后，下槽中混入了催化劑及氯離子，如將下槽緩沖液用于上槽，則影響電泳。重要的電泳，電極緩沖液最好用新鮮的。 (4)剝膠 為了防止電泳后凝膠中蛋白(酶)盤狀區(qū)帶擴(kuò)散，電泳完畢必須立刻取出凝膠柱進(jìn)行固定與染色，一般用20～30ml的注射器配上10cm長的針頭，左手拿玻管，右手握灌滿水的注射器，將針頭插入凝膠與管壁之間，左手慢慢旋轉(zhuǎn)玻管，右手一邊壓水，一邊使針頭呈螺旋式推進(jìn)?？克鲏毫蜐櫥⒉ＡЧ軆?nèi)壁與凝膠分開，一般情況下，針頭抽出，膠就自動(dòng)滑出。如果不出，就從另一端再注水或用洗耳球在一端稍加壓力。如果膠濃度較高，取出困難，可用10%甘油水溶液代替水注入。一般剝膠的方向是從濃縮膠端開始。剝膠時(shí)應(yīng)注意不要損傷膠柱表面。 (5)固定與染色 為防止凝膠柱內(nèi)已分離成分的擴(kuò)散，需要進(jìn)行固定。剝出的凝膠柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中幾分鐘就可達(dá)到蛋白帶固定的效果。也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同時(shí)進(jìn)行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和鑒定同工酶，為了讓酶帶上進(jìn)行某種顯色反應(yīng)，往往是先顯色后固定。 三氯醋酸固定蛋白質(zhì)的機(jī)制可能是這樣：其分子不僅與蛋白質(zhì)帶正電荷側(cè)鏈結(jié)合，而且通過氫鍵與蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)合，其結(jié)果使蛋白質(zhì)分子失去水分子，同時(shí)在肽鏈表面包上一層疏水的CCl3基團(tuán)，使蛋白質(zhì)水溶性破壞，從水相沉淀在凝膠相上。乙酸固定蛋白質(zhì)的機(jī)制可能同三氯乙酸一樣。 電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶的檢測，對于不同的目的，應(yīng)采用不同的檢測方法，最常用的方法是用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復(fù)合物，選用染料通常應(yīng)考慮以下要求：A)必須與大分子結(jié)合以形成一個(gè)不溶性的，有色的，緊密的復(fù)合物，但不結(jié)合到凝膠中和支持膜上，以便從凝膠中除去，否則背景會影響蛋白帶的辨別和定量掃描;B)染料必須容易溶解在對大分子沒有影響的溶劑中，以利于背景的脫色;C)選用高吸光系數(shù)的染料有利于提高定量測定的靈敏度;D)選用能與大分子有專一性結(jié)合的染料，并在結(jié)合后能產(chǎn)生不同的顏色，可以提高檢測的選擇性。 用于蛋白質(zhì)區(qū)帶染色的試劑常用的有氨基黑10B、考馬斯亮藍(lán)，1-苯胺基-8-萘磺酸等，其性能及染色原理如下： ①氨基黑10B (amino black 10B) C22H13O12N6S3Na3 MW＝715 λmax＝620～630nm 氨基黑是酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽。是最常用的蛋白質(zhì)染料。但用氨基黑染SDS-蛋白質(zhì)時(shí)效果不好。另外氨基黑染不同蛋白質(zhì)時(shí)的著色度不等，色調(diào)不一(有藍(lán)、黑、棕等)，作同一凝膠柱的掃描時(shí)誤差較大，需要對各種蛋白質(zhì)作出本身的蛋白質(zhì)-染料量(吸收值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ②考馬斯亮蘭R250(Coomassie brilliant blne R250) 即三苯基甲烷(triphenylmethane) C46H44O7H3S2Na MW＝824 λmax＝560～590nm 染色的靈敏度比氨基黑高5倍。尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色，但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍時(shí)，對高濃度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分析時(shí)要注意這點(diǎn)。 ③考馬斯亮蘭G250(Coomassie brilliant blne G250)，即二甲花青亮藍(lán)(Xylene Cyanine brilliant Blue)，MW＝854，λmax＝590～610nm，染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。優(yōu)點(diǎn)在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。 氨基黑與考馬斯亮蘭兩種染料的共同點(diǎn)是：都帶有負(fù)電荷的磺酸基，能與蛋白分子上帶正電荷的側(cè)鏈相結(jié)合。但是，氨基黑分子含有較多的親水基團(tuán)，和蛋白質(zhì)親水微區(qū)以及親水的凝膠基質(zhì)有很大的親和力。而考馬斯亮蘭卻相反，含有較多的疏水基團(tuán)，和蛋白質(zhì)的疏水區(qū)有較大的親和力，而和凝膠基質(zhì)的親和力不如氨基黑。因此，用考馬斯亮蘭染色的漂洗要容易得多。另外，考馬斯亮蘭的靈敏度要比氨基黑高。 4.1-苯胺基-8-萘磺酸(1-animo-naphthal sulfonic acid簡稱ANS)，MW＝241，本身無熒光，但與蛋白質(zhì)結(jié)合后則產(chǎn)生熒光。電泳后，凝膠在此染料溶液浸1～3分鐘，用長波紫外燈照射時(shí)產(chǎn)生黃色熒光，可顯示蛋白質(zhì)100mg，如果不明顯，可將凝膠取出暴露于空氣或鹽酸氣中，或浸沒在3mol/L鹽酸中幾秒至2分鐘，使表面蛋白質(zhì)稍變性,然后再用 表5 蛋白質(zhì)的常染色法 方 法 固 定 液 染 料 染色時(shí)間 脫 色 氨基黑 10B 甲 醇 7%乙酸 0.1N氫氧化鈉中1%氨基黑 7%乙酸中0.5%～1%氨基黑 5分鐘(室溫) 2小時(shí)(室溫) 10分鐘(96℃) 5%乙醇 7%乙酸 考馬斯亮蘭 R250 20%磺基水楊酸 10%三氯乙酸 樣品中含尿素的在5%三氯乙酸中固定 0.25%R250水溶液 10%三氯乙酸-1%R250 19∶1(V/V) 5%磺基水楊酸和1%R250 19∶1 5分鐘(室溫) 0.5小時(shí)(室溫) 1小時(shí)(室溫) 7%乙酸 10%三氯乙酸 90%甲酸 考馬斯亮蘭 G250 6%乙酸 12.5%三氯乙酸 6%乙酸中1% G250 12.5%三氯乙酸中0.1% G250 10分鐘(室溫) 30分鐘(室溫) 甲醇-水-濃氨 64∶36∶1 1-苯胺基-8-萘磺酸 2mol/L鹽酸浸幾秒種 PH6.8，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中0.003%染料 3分鐘 Ponceau 3R 12.5%三氯乙酸 0.1mol/L NaOH中1%3R 2分鐘(室溫) 5%乙醇 固綠 7%乙酸 7%乙酸中1%固綠 2小時(shí)(5℃) 7%乙酸 ANS染色，這樣可顯示蛋白質(zhì)20μg。這種染色優(yōu)點(diǎn)是可保留凝膠內(nèi)中的酶和抗體的活性?？蓪⒃搮^(qū)帶切下來進(jìn)行酶活力測定，也可直接把凝膠搗碎研細(xì)，用作抗原來注射動(dòng)物，聚丙烯酰胺不影響抗體的產(chǎn)生。 常用染色方法見表5。 (6)脫色 凝膠柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后放在脫色液中浸洗，常用的脫色液有7%乙酸，甲醇-水-乙酸溶液等。經(jīng)常更換新溶液，直到染料洗出，背景幾乎無色為止。用氨基黑染色的，脫色時(shí)間較長，而考馬斯亮藍(lán)染料易于脫色。為了短時(shí)間得出結(jié)果，可采用電泳脫色。即在一玻璃或有機(jī)玻璃槽中盛7%的乙酸溶液，已染色的膠放置在槽中間，兩邊加鉑金電極，并通直流電，電壓30～40V，電流0.5A左右，1～2小時(shí)即可脫色完畢。 (7)結(jié)果的記錄 記錄電泳結(jié)果常用的方法有 ①繪制示意圖，將各個(gè)樣品的酶帶如實(shí)地描繪下來，根據(jù)酶帶寬窄，顏色深淺，擬分七級表示之(圖10)。 圖10 酶帶的分級標(biāo)準(zhǔn) ②測量相對遷移率(Rf):分離區(qū)帶的泳動(dòng)速度可用相對遷移率來表示。測定遷移率時(shí)，在電泳結(jié)束后要先在指示劑移動(dòng)的位置(前沿)作一標(biāo)記(通常是插一根短銅絲)，染色后，量出指示劑移動(dòng)的距離和酶帶移動(dòng)的距離。 Rf＝ 酶帶遷移距離/ 前沿指示劑遷移距離 測量遷移率時(shí)，應(yīng)以酶帶的中部位置為準(zhǔn)，值得注意的是，交聯(lián)劑的濃度，交聯(lián)劑和丙烯酰胺的比例，催化劑濃度及聚膠時(shí)的溫度和時(shí)間均對凝膠柱結(jié)構(gòu)有影響，因而會影響遷移率。另外，電泳時(shí)電場強(qiáng)度等也會影響帶電顆粒遷移速度。為了使試驗(yàn)重復(fù)性好，這些因子都應(yīng)盡可能保持恒定。 ③照相：采用透射照相方法，用照相機(jī)把酶帶真實(shí)地拍攝下來，盤狀電泳的凝膠柱一般放在試管中(注滿脫色液或保存液)拍攝。對于綠色、藍(lán)色和暗藍(lán)色的染色區(qū)帶，照相時(shí)可加黃濾色鏡，能增加清晰度。 ④光密度計(jì)掃描定量：把酶帶放在光密度掃描儀上，描繪酶譜——光密度曲線。配合計(jì)算機(jī)，可作定量分析。 (二)垂直平板電泳 垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳和管型盤狀凝膠電泳相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①一系列樣品可以在相同的制板、電泳、顯色條件下進(jìn)行比較，減少試驗(yàn)誤差；②在一塊平板上點(diǎn)樣數(shù)目可根據(jù)需要任意變動(dòng)，可多可少；③凝膠可制成干板，作為科研資料長期保存；④電泳后取膠、顯色、攝影等都較方便，并能得到較好的效果。 由于具有上述優(yōu)點(diǎn)，故近年來垂直平板凝膠電泳技術(shù)發(fā)展較快，現(xiàn)將方法介紹如下： 垂直平板凝膠電泳所用的電泳儀，配制分離膠、濃縮膠的試劑，以及固定染色、脫色用的藥品可與盤狀凝膠電泳通用，所不同的主要在電泳槽結(jié)構(gòu)上，以及隨之帶來的操作方法上。 1.器材 夾心式垂直板電泳槽，凝膠模(1351001.5mm)(北京六一儀器廠)，直流穩(wěn)壓電源(電壓300～600V，電流50～100mA)，吸量管(1，5，10mL)，燒杯(25，50，100mL),細(xì)長頭的滴管，1mL注射器及6號長針頭，微量注射器(10μL或50μL)，水泵或油泵，真空干燥器，培養(yǎng)皿(直徑120mm)，玻璃板(1313cm)，玻璃紙2張(1818cm)，日光燈一臺。 2.操作方法 圖11 夾心垂直平板電泳槽示意圖 圖12 凝膠模示意圖 3.操作技術(shù) (1)安裝夾心式垂直板電泳槽 夾心式垂直板電泳槽(圖11)兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩電極槽中間有一凝膠模(圖12)，該模由ㄩ形硅膠框，長、短玻璃板，模板梳組成，電泳槽由上貯槽(白金電極面對短玻璃板)，下貯槽(白金電極面對長玻璃板)和回紋冷凝管組成，兩電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定，其組裝順序?yàn)椋? ①裝貯槽和固定螺絲銷釘； ②將洗凈的長、短玻璃板分別插到ㄩ形硅橡膠框的凹形槽中，注意不要用手接觸灌膠面的玻璃； ③將已插好玻板的凝膠模夾到貯槽中，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽，長玻璃板應(yīng)面對下貯槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽； ④豎直電泳槽，用滴管吸取少量的1%瓊脂糖溶液，灌入凝膠模板底部(長玻璃板外側(cè)，下沿凹形小槽內(nèi))，液面高度約0.5～1.0cm,待瓊脂糖凝固后,即堵住凝膠模下面的窄縫(通電時(shí)又可作為鹽橋)。 (2)制備凝膠板 ①分離膠制備：配制分離膠溶液(見表4)，將凝膠溶液沿玻棒小心注入到長、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm)，用注射器在凝膠表面沿短玻板邊緣輕輕加一層水以隔絕空氣，并使膠面平整。為防止?jié)B漏，在上下貯槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30～60分鐘凝膠完全聚合后，可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界限，用濾紙吸去多余的水。 ②濃縮膠制備：配制濃縮膠溶液(見表4)，用滴管將凝膠溶液注入到長、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(分離膠上方)，輕輕加入樣品模板梳，用日光燈照射進(jìn)行光聚合，約30分鐘后，凝膠由淡黃透明變成乳白色，聚合完全后，輕輕取出樣品模板梳，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm。 (3)加樣 用微量注射器取樣品溶液5～10μl，小心地加入到凝膠凹形樣品槽底部，因樣品比重大于電極緩沖液，因此樣品液自動(dòng)沉降在膠面上平鋪成一層。 (4) 電泳 加樣畢，在上槽加入0.1%溴酚藍(lán)數(shù)滴，不要移動(dòng)電泳槽(防引起樣品漂流)，接通電源，先低壓電泳一般時(shí)間，待指示劑在膠板上成一條直線時(shí)，即可將電泳槽移入冰箱，按所需電流電壓進(jìn)行電泳。溫度控制在0～4℃。由于電流和電壓同電極緩沖液的離子強(qiáng)度有關(guān)，因此根據(jù)電極緩沖液分高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度兩種。高離子強(qiáng)度電極緩沖液配方：141.1g甘氨酸加30g Tris加水1000ml，用時(shí)稀釋20倍調(diào)PH值至8.3；低離子強(qiáng)度電極緩沖液配方：2g甘氨酸加5.2g Tris加水至1000ml，用時(shí)衡釋10倍，調(diào)PH值至8.7。 當(dāng)電極緩沖液離子強(qiáng)度確定后，又有穩(wěn)定電流和穩(wěn)定電壓兩種電泳方式。用高離子強(qiáng)度電泳液，穩(wěn)定電流2.0～2.5mA/cm，電泳16小時(shí)左右；用低離子強(qiáng)度電泳液，穩(wěn)定電流0.2～0.3mA/cm，電泳16小時(shí)左右，此為穩(wěn)定電流的方法。穩(wěn)定電壓電泳方式通常是這樣：用高離子強(qiáng)度時(shí)，穩(wěn)定電壓10V/cm，電泳14～15小時(shí)；用低離子強(qiáng)度時(shí)，穩(wěn)定電壓20V/cm，約4～5小時(shí)。若指示劑移動(dòng)到離下層電泳液水平面1cm處，即可關(guān)閉電源，停止電泳。 (5)卸板 電泳完畢，從冰箱中取出電泳槽，吸出電極緩沖液，將膠板從電泳槽上卸下，平放在實(shí)驗(yàn)臺上，用壓舌板在兩塊玻璃板的一角輕輕一撬，揭去上面長型玻璃板。用刀片在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，而后用磨平針尖的獸醫(yī)用針頭吸取無離子水把凝膠從短型玻璃板上剝離，慢慢地把膠板沖入白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)，即可染色與固定。 (6)固定、染色和脫色 與垂直管型盤狀電泳所用的方法相同。 (7)結(jié)果和記錄 除按管型盤狀電泳法記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果外，還可以制成干板保存。在水中用兩張比膠板稍大的玻璃紙，將膠板夾在中間，平放在玻璃板上，排除氣泡，四周用玻璃條壓住并用夾子固定在玻璃板上，30℃烘干或自然風(fēng)干。包前如將膠板放在10%的甘油中浸泡片刻，則效果會更好。