凝膠電泳的注意事項(xiàng).doc

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凝膠電泳的注意事項(xiàng) 影響電泳分離的主要因素： 1. 待分離生物大分子的性質(zhì)：待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質(zhì)都會(huì)對(duì)電泳有明顯影響。一般來(lái)說(shuō)， 子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 2. 緩沖液的性質(zhì)：緩沖液的pH值會(huì)影響待分離生物大分子的解離程度，從而對(duì)其帶電性質(zhì)產(chǎn)生影響，溶液pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性分子，緩沖液pH還會(huì)影響到其電泳方向，當(dāng)緩沖液pH大于蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，其電泳的方向是指向正極。為了保持電泳過(guò)程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液pH值的穩(wěn)定性，緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度，一般在0.02－0.2，離子強(qiáng)度過(guò)低，則緩沖能力差，但如果離子強(qiáng)度過(guò)高，會(huì)在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），由于離子氛與待分離分子的移動(dòng)方向相反，它們之間產(chǎn)生了靜電引力，因而引起電泳速度降低。另外緩沖液的粘度也會(huì)對(duì)電泳速度產(chǎn)生影響。 3. 電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度（V/cm）是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳速度越快。但增大電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)引起通過(guò)介質(zhì)的電流強(qiáng)度增大，而造成電泳過(guò)程產(chǎn)生的熱量增大。電流在介質(zhì)中所做的功（W）為：W=I2.R.t式中：I為電流強(qiáng)度，R為電阻，t為電泳時(shí)間。 　　電流所作的功絕大部分都轉(zhuǎn)換為熱，因而引起介質(zhì)溫度升高，這會(huì)造成很多影響： 1、 樣品和緩沖離子擴(kuò)散速度增加，引起樣品分離帶的加寬； 2、 產(chǎn)生對(duì)流，引起待分離物的混合； 3、 如果樣品對(duì)熱敏感，會(huì)引起蛋白變性； 4、 引起介質(zhì)粘度降低、電阻下降等等。電泳中產(chǎn)生的熱通常是由中心向外周散發(fā)的，所以介質(zhì)中心溫度一般要高于外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質(zhì)相對(duì)于外周部分粘度下降，摩擦系數(shù)減小，電泳遷移速度增大，由于中央部分的電泳速度比邊緣快，所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強(qiáng)度，可以減小生熱，但會(huì)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，引起待分離生物大分子擴(kuò)散的增加而影響分離效果。所以電泳實(shí)驗(yàn)中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)強(qiáng)度，同時(shí)可以適當(dāng)冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。 4. 電滲：液體在電場(chǎng)中，對(duì)于固體支持介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng)，稱為電滲現(xiàn)象。由于支持介質(zhì)表面可能會(huì)存在一些帶電基團(tuán)，如濾紙表面通常有一些羧基，瓊脂可能會(huì)含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基團(tuán)等等。這些基團(tuán)電離后會(huì)使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子，在電場(chǎng)的作用下向電極方向移動(dòng)，形成介質(zhì)表面溶液的流動(dòng)，這種現(xiàn)象就是電滲。在pH值高于3時(shí)，玻璃表面帶負(fù)電，吸附溶液中的正電離子，引起玻璃表面附近溶液層帶正電，在電場(chǎng)的作用下，向負(fù)極遷移，帶動(dòng)電極液產(chǎn)生向負(fù)極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同，則加快電泳速度；如果相反，則降低電泳速度。 5. 支持介質(zhì)的篩孔：支持介質(zhì)的篩孔大小對(duì)待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動(dòng)速度快，反之，則泳動(dòng)速度慢。 關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項(xiàng)： 1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒(méi)有外源dna污染。 2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對(duì)比較薄的膠來(lái)做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。 3. 關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴樹(shù)脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對(duì)于膠有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來(lái)確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。 4. 按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對(duì)位置已知，根據(jù)尺子來(lái)衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺(jué)得很難判斷，可以直接在marker邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容易確定了。