高中生物《血紅蛋白的提取和分離》課件8（44張PPT）（人教版選修1）

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歡迎進入生物課堂 高中生物技術(shù)實踐課件 血紅蛋白的提取和分離 本課題學(xué)習(xí)目標(biāo) 體驗從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法 并了解色譜法 電泳法等分離生物大分子的基本原理 1 主要概念 凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用 2 主要原理 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機理3 課題重點 凝膠色譜法的原理和方法4 課題難點 樣品的預(yù)處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成 這標(biāo)志著進入了后基因組和蛋白質(zhì)組時代 人類基因組 指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息 蛋白質(zhì)組 生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的總和 主要是對蛋白質(zhì)功能的研究 2 提問 血液有哪些成分 1 提問 用雞的紅細胞提取DNA 用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么 雞的紅細胞具有細胞核 含有DNA 便于進行DNA的提取 人的紅細胞無細胞核 結(jié)構(gòu)簡單 血紅蛋白含量豐富 便于提取血紅蛋白 血紅蛋白 每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團 此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳 血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色 血紅蛋白的特點 1 分離生物大分子的基本思路 選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子 2 蛋白質(zhì)分離和提取的原理 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異 如分子的形狀和大小 所帶電荷的性質(zhì)和多少 溶解度 吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等 可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì) 一 血紅蛋白的提取和分離 3 高溫滅菌和酒精滅菌的結(jié)果 使微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生變性 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞 一 凝膠色譜法 分配色譜法 2 凝膠 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物 如葡聚糖或瓊脂糖 構(gòu)成的多孔小球體 內(nèi)部有許多貫穿的通道 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小 利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用 來進行分離 1 概念 3 凝膠色譜法的原理 分子篩效應(yīng) 當(dāng)相對分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時 相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道 路程較長 移動速度較慢 而相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道 只能在凝膠外部移動 路程較短 移動速度較快 相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離 依據(jù)的特性是 蛋白質(zhì)分子量的大小 4 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動畫演示 二 緩沖溶液 1 概念 在一定的范圍內(nèi) 凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液 能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響 維持PH基本不變 2 作用 3 緩沖溶液的配制 通常由1 2種緩沖劑溶解于水中配制而成 調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液 4 提問 在本課題中使用的緩沖液是 其目的是 利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境 保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能 便于觀察 紅色 和科學(xué)研究 活性 磷酸緩沖液 緩沖溶液的組成及分類 弱酸及其對應(yīng)的鹽 弱堿及其對應(yīng)的鹽 多元弱酸的酸式鹽及其對應(yīng)的次級鹽 H2CO3 NaHCO3 CH3COOH CH3COONa NH3 H2O NH4CL NH4OH NH4CL NaHCO3 Na2CO3 NaH2PO4 Na2HPO4 緩沖溶液由足夠濃度的共軛酸堿對組成 其中 能對抗外來強堿的稱為共軛酸 能對抗外來強酸的稱為共軛堿 這一共軛酸堿通常稱為緩沖對 緩沖劑或緩沖系 常見的緩沖對主要有如下三種類型 三 電泳 1 概念 帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程 2 原理 許多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有可解離的基團 在一定的PH下 這些基團會帶上正電或負(fù)電 在電場的作用下 這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小 形狀的不同 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離 3 類型 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙稀酰胺凝膠電泳 在電場的作用下 這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動 瓊脂糖凝膠電泳示意圖 聚丙稀酰胺凝膠電泳 1 在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉 SDS 聚丙稀酰胺凝膠電泳 聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N N 甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素 SDS的作用 為了消除凈電荷對遷移率的影響 可以在凝膠中加入SDS 2 原理 聚丙稀酰胺凝膠電泳 SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性 由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈 因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量 SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別 使電泳遷移率完全取決于分子的大小 3 SDS作用機理 用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法 使用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時 可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進行電泳 根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置 用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線 可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量 市場上有高分子量 次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售 二 實驗操作 樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定 1 樣品處理 一 蛋白質(zhì)提取和分離步驟 二 操作過程 本課題可選用豬 牛 羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白 1 紅細胞的洗滌 洗滌目的 去除雜蛋白 以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化 洗滌次數(shù)不可過少 洗滌操作 1 采集血樣 2 低速短時間離心 速度越高和時間越長 會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀 達不到分離的效果 3 吸取血漿 上層透明的黃色血漿 4 鹽水洗滌 用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 9 的氯化鈉溶液洗滌 5 低速離心 低速短時間 6 重復(fù)4 5步驟三次 直至上清液中已沒有黃色 表明洗滌干凈 采集得到雞血 柜式離心機 初次離心后的結(jié)果 3次洗滌后的結(jié)果 2 血紅蛋白的釋放 加蒸餾水到原血液體積 再加40 體積的甲苯 置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘 加速細胞破裂 細胞破裂釋放出血紅蛋白 3 分離血紅蛋白溶液 過程 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi) 以2000r min的速度離心10min 試管中溶液層次 第1層 最上層 甲苯層 無色透明 第2層 中上層 脂溶性物質(zhì)沉淀層 白色薄層固體 第3層 中下層 血紅蛋白的水溶液層 紅色透明液體 第4層 最下層 雜質(zhì)沉淀層 暗紅色 分離 用濾紙過濾 除去脂溶性沉淀層 于分液漏斗中靜置片刻后 分出下層的紅色透明液體 二 實驗操作 磁力攪拌器 攪拌器轉(zhuǎn)子 攪拌器正在工作 甲苯層 無色透明 白色薄層固體 紅色透明液體 雜質(zhì)沉淀層 暗紅色 試管中溶液層次 4 透析 過程 取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中 將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol l的磷酸緩沖液中 pH為7 0 透析12小時 透析目的 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì) 二 實驗操作 透析過程動畫演示 利用透析袋透析 2 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 取長40厘米 內(nèi)徑1 6厘米的玻璃管 兩端需用砂紙磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng) 再用100目尼龍紗包好 插到玻璃管的一端 注意事項 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否則難以鋪實尼龍網(wǎng) 還會導(dǎo)致液體殘留 蛋白質(zhì)分離不徹底 頂塞的制作 打孔 安裝玻璃管 組裝 將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體 安裝其他附屬結(jié)構(gòu) 2 凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇 A 材料 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G 75 B 代表意義 G 表示凝膠的交聯(lián)程度 膨脹程度及分離范圍 75表示凝膠的得水值 即每克凝膠膨脹時吸水7 5克 凝膠的前處理 配置凝膠懸浮液 計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后 配成凝膠懸浮液 凝膠色譜柱的裝填方法 A 固定 將色譜柱裝置固定在支架上 B 裝填 將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi) 裝填時輕輕敲動色譜柱 使凝膠填裝均勻 注意 1 凝膠裝填時盡量緊密 以降低凝膠顆粒之間的空隙 2 裝填凝膠柱時不得有氣泡存在 因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序 降低分離效果 裝配好的凝膠柱 洗滌平衡 裝填完畢后 立即用緩沖液洗脫瓶 在50cm高的操作壓下 用300ml的20mmol l的磷酸緩沖液 pH為7 0 充分洗滌平衡12小時 注意 1 液面不要低于凝膠表面 否則可能有氣泡混入 影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果 2 不能發(fā)生洗脫液流干 露出凝膠顆粒的現(xiàn)象 2 凝膠色譜柱的裝填 50cm高 3 樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面 打開下端出口 使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊 關(guān)閉出口 滴加透析樣品 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端 滴加樣品時 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣 同時注意不要破壞凝膠面 樣品滲入凝膠床 加樣后打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內(nèi) 等樣品完全進入凝膠層后 關(guān)閉下端出口 洗脫 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口進行洗脫 收集 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時 用試管收集流出液 每5ml收集一試管 連續(xù)收集 在分離過程中 如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動 說明色譜柱制作成功 注意 正確的加樣操作 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 3 樣品加入與洗脫 注意 正確的加樣操作是 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 開始進行層析 收集得到的純化后的蛋白 思考下面的問題 讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi) 維持結(jié)構(gòu)和功能 1 在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么 2 與其他真核細胞相比 紅細胞有什么特點 這一特點對你進行蛋白質(zhì)得分離有什么意義 血紅蛋白是有色蛋白 因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液 這使血紅蛋白的分離過程非常直觀 大大簡化了實驗操作 3 你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步 包括 樣品處理 粗分離 純化和純度鑒定 首先通過洗滌紅細胞 血紅蛋白的釋放 離心等操作收集到血紅蛋白溶液 即 樣品的處理 再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì) 即樣品的粗分離 然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去 即 樣品的純化 最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定 三 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 2 試劑的配制 鑒定血紅蛋白純度 1 目的 丙烯酰胺和N N 甲叉雙丙烯酰胺 用去離子水配制29 29g 100mL 下同 的丙烯酰胺和1 的N N 甲叉雙丙烯酰胺的貯存液 十二烷基硫酸鈉 SDS 用去離子水配成10 的貯存液 于室溫保存 用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液 TEMED 作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合 用去離子水配制10 過硫酸銨 作用是提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基 此溶液須配制新鮮液 Tris 甘氨酸電泳緩沖液 25mmol LTris 250mmol L甘氨酸 pH8 3 0 1 的SDS 樣品處理液 50mmol LTris HCl pH6 8 100mmol LDTT 巰基蘇糖醇 或用5 的巰基乙醇 2 的SDS 0 1 的溴酚藍 10 的甘油 染色液 0 1 的考馬斯亮藍R250 40 的甲醇 10 的冰醋酸 脫色液 10 的甲醇和10 的冰醋酸 1 由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性 并且容易被皮膚吸收 因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進行 2 TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織 眼睛 皮膚等有很大的破壞作用 吞服可致命 3 在進行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成 操作時要戴好一次性手套 注意事項 三 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS 聚丙烯酰胺分離膠制備 用去離子水4 6mL 30 的丙烯酰胺2 7mL 1 5mol pH8 8的Tris緩沖液2 5mL 10 的SDS0 1mL 10 的過硫酸胺0 1mL TEMED0 006mL 混合均勻 迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間 要留出灌注濃縮膠所需空間 梳子的齒長再加0 5cm 再在膠液面上小心注入一層水 約高2 3mm 以阻止氧氣進入凝膠溶液 分離膠聚合完全后 約30min 傾出覆蓋水層 再用濾紙吸凈殘留水 配制SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液用去離子水2 7mL 30 的丙烯酰胺0 67mL 1 0mol pH6 8的Tris緩沖液0 5mL 10 的SDS0 041mL 10 的過硫酸胺0 04mL TEMED0 004mL 混合均勻 直接灌注在聚合的分離膠上 并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子 整個操作過程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生 然后再補加濃縮膠溶液 使其充滿梳子之間的空隙 將凝膠垂直放置于室溫下聚合 1 根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板 2 SDS 聚丙烯酰胺凝膠制備 3 電泳方法步驟 3 樣品處理 在電泳樣品中按1 1體積比加入樣品處理液 在100 溫度下加熱3min 以使蛋白質(zhì)變性 4 濃縮膠聚合完全后 30min 小心移出梳子 把凝膠固定于電泳裝置上 上下槽各加入Tris 甘氨酸電泳緩沖液 必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡 5 加樣 按順序加樣 加樣量通常為10 25 L 樣品可以多加幾個 例如 血漿樣品紅細胞破碎后 即進行凝膠色譜分離之前 的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品 6 電泳 將電泳裝置與電源相接 凝膠上所加電壓為8V cm 當(dāng)染料前沿進入分離膠后 把電壓提高到15V cm 繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1cm處 關(guān)閉電源 7 剝膠 從電泳裝置上卸下玻璃板 用刮刀撬開玻璃板 將緊靠最左邊一孔 第一槽 凝膠下部切去一角 以標(biāo)注凝膠的方位 8 染色 將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍染色液中染色1 2h 9 脫色 染色完畢 傾出染色液 換脫色液脫色3 10h 其間需多次更換脫色液至背景清楚 10 觀察結(jié)果 SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中 待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度 3 電泳方法步驟 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層 見教科書圖5 18 如果分層不明顯 可能是洗滌次數(shù)少 未能除去血漿蛋白的原因 此外 離心速度過高和時間過長 會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀 也得不到純凈的紅細胞 影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度 三 實驗結(jié)果分析與評價 1 你是否完成了對血液樣品的處理 你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎 2 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生 你的色譜柱裝填得成功嗎 你是如何判斷的 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì) 因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈 檢查凝膠是否裝填得均勻 此外 還可以加入大分子的有色物質(zhì) 例如藍色葡聚糖 2000或紅色葡聚糖 觀察色帶移動的情況 如果色帶均勻 狹窄 平整 說明凝膠色譜柱的性能良好 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡 輕輕敲打柱體以消除氣泡 消除不了時要重新裝柱 如果凝膠色譜柱裝填得很成功 分離操作也正確的話 能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻 狹窄 平整 隨著洗脫液緩慢流出 如果紅色區(qū)帶歪曲 散亂 變寬 說明分離的效果不好 這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān) 3 你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中 紅色區(qū)帶的移動嗎 請描述紅色區(qū)帶的移動情況 并據(jù)此判斷分離效果 三 實驗結(jié)果分析與評價 本課題作業(yè) 1 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的 2 什么是緩沖溶液 它的作用是什么 3 電泳的作用及其原理是什么 4 你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎 5 與其他真核細胞相比 紅細胞有什么特點 這一特點對你進行蛋白質(zhì)的分離有什么意義 同學(xué)們 來學(xué)校和回家的路上要注意安全 同學(xué)們 來學(xué)校和回家的路上要注意安全