《植化方法學(xué)》PPT課件.ppt

植化方法學(xué),天然藥物化學(xué)教研室 邱 峰 2003年 4月,植化方法學(xué)（一） （各種色譜的分離原理及操作方法）,一、硅膠相關(guān)色譜 二、氧化鋁相關(guān)色譜 三、聚酰胺柱色譜 四、葡聚糖凝膠柱色譜 五、大孔吸附柱色譜 六、離子交換柱色譜 七、反應(yīng)薄層,一、硅膠相關(guān)色譜,1、硅膠的結(jié)構(gòu)(SiO2.XH2O) 2、分離原理 吸附作用：氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等 吸附強度的大小取決于硅醇基類型、硅醇基數(shù)目（比表面積）、孔體積、平均孔徑,OSiOSiOH,O,O,O,O,3、使用范圍 由于硅膠的弱酸性、往往適合于分離黃酮、香豆素、蒽醌、萜、甾體等中性或弱酸性類化合物。,黃連生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu),薄層板： 硅膠G薄層板， 110 C 活化1小時 展開劑： 乙酸乙酯-氯仿-甲醇-濃氨水-二乙胺 （8:2:2:1:0.5） 檢測方式：UV366nm,黃連生物堿硅膠薄層層析圖譜,4、常用硅膠的規(guī)格 100140目、100200目（75150m）、200300目（4575 m ）為柱層析硅膠 1040m為薄層層析硅膠 210 m為高效薄層或液相色譜硅膠 5、薄層層析硅膠的種類 硅膠G:含有石膏1214%，粒度1040m，pH67(10%)。 硅膠H:不含石膏，pH67(10%)。 硅膠GF254:含有石膏1214%，pH67(10%)，且含有少量的熒光劑。,6、硅膠含水量與活性之間的關(guān)系,細玻璃管法測定硅膠活性 展開劑：苯,7、含水硅膠色譜 硅膠含水達17%以上為分配色譜，適宜分離生物堿、糖類、皂苷、有機酸等。表現(xiàn)在薄層和開放柱上，展開劑或洗脫劑為多相含水系統(tǒng)。,薄層板：硅膠H 展開劑： I: 正丁醇-乙酸乙酯-水 （4:1:1） II: 氯仿-甲醇-水 （65:35:10）下層 顯色：10%硫酸,紅參中人參皂苷的薄層色譜圖,8、硅膠制備薄層 操作方法 1)、薄層的制備 2020cm2的玻璃板一般所用硅膠量為820g，5CMCNa的用量按1:22.5為宜，晾干，根據(jù)需要可進行活化。 2)、點樣（1050mg） 用玻璃毛細管或移液管將樣品溶液線形點樣于硅膠板上，點樣線寬度要適宜，過窄易超載，過寬影響分離效果。 3)、展開 晾干點樣處溶劑后，以選好的展開劑進行展開，對有些化合物預(yù)飽和一段時間，分離效果更好。,原點,前沿,4)、標記色帶 取出薄層板，晾干，根據(jù)熒光畫出色帶，或部分顯色確定色帶的位置。 5)、剝離、提取 剝離色帶部分的硅膠，以合適的溶劑直接提取或裝入小玻璃柱進行洗脫。（忌用含水系統(tǒng)處理） 6)、濃縮 濃縮提取液或洗脫液得色帶對應(yīng)的化合物。多數(shù)情況下，需要進一步的精制或純化處理。,8、制備薄層的操作,原點,前沿,制備薄層展開后的后處理,9、硅膠柱層析的操作（開放柱） 1)、拌樣（干法上樣）： 將分離樣品溶于易揮散溶劑中，與三倍量的柱層析硅膠拌樣。滴加樣品溶液的同時應(yīng)不斷攪拌均勻，一旦達到制劑軟材程度應(yīng)停止滴加樣品溶液，晾干或低溫干燥（注意有毒溶劑的處理）后再繼續(xù)操作，直到樣品溶液全部加入。 2)、裝柱： 將拌樣硅膠1020倍量的柱層析硅膠浸泡于起始溶劑中，攪拌趕出氣泡，裝入準備好的玻璃柱中，平衡至不再下降為止。 3)、上樣： 待硅膠柱平衡好后，將干燥好的拌樣硅膠用漏斗加入柱子上部（加入前要保證起始溶劑在柱子中足夠的高度以免帶入氣泡）。 4)、加入保護硅膠或棉花：用起始溶劑洗脫至柱中上端溶劑顏色變淺或無色為止，然后加入適量硅膠或棉花起緩沖作用。,5)、柱層析洗脫劑的選擇 起始溶劑原則上對被分離樣品中的任何物質(zhì)都沒有洗脫能力。洗脫溶劑的選擇以硅膠薄層板的層析行為為指導(dǎo)，被分離成分的Rf值一般在0.10.2為宜（理論上為0.20.3）。,“注”：展開劑和洗脫劑的選擇最好參考文獻資料。 6)、更換洗脫劑 在一個洗脫劑系統(tǒng)下，一般要求至少洗脫35個保留體積，實驗中可根據(jù)具體情況決定是否更換，比如到5個保留體積還有較大量的的物質(zhì)被洗脫下來，就應(yīng)當(dāng)繼續(xù)洗脫下去。 7)、保留體積的估算 浸泡硅膠的溶劑量 + 空柱溶劑量洗脫下來的溶 劑量=保留體積 8)、流速的提高：柱上端加壓或下段流出口減壓，特別是填料硅膠粒度小時可采用這兩種方式加快洗脫速度。 9)、合并相同流份：硅膠薄層指導(dǎo)合并，流份體積根據(jù)硅膠柱大小和分離樣品量確定。,10、硅膠中低壓柱色譜及高效液相色譜,1)、流動相的選擇： 通過硅膠薄層摸索液相色譜條件，最好用高效薄層指導(dǎo)來選擇流動相，其粒度接近于中低壓柱填料的粒度，用自制的硅膠薄層選擇流動相時注意粒度和含有水分的影響。另外也可用同類型填料的分析柱摸索流動相條件。 2)、樣品溶液的處理： 盡可能選擇流動相溶解樣品，并用微孔過濾器過濾。選擇極性大于流動相的溶劑配制樣品溶液會因進樣量的不同影響保留時間和分離效果。 3)、檢測器的選擇： 有紫外吸收的物質(zhì)盡可能用紫外檢測器，無紫外吸收的或紫外吸收較弱的可選用示差 檢測器。目前出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射檢測器則是對幾乎所有的非揮發(fā)性天然化合物適用。,11、硅膠干柱法（適用于有顏色或熒光的物質(zhì)分離） 干柱層析的優(yōu)點： 1)、分離效果比濕裝柱高。 2)、洗脫液的選擇可直接套用薄層層析的最佳分離 條件。 3)、常采用塑料薄膜柱，對有熒光或顏色的物質(zhì)， 可借助紫外燈分割各色帶，避免交叉。 4)、適用于制備性分離。 5)、設(shè)備簡單，消耗溶劑少，節(jié)省時間。,硅膠干柱法的操作,1)、填充： 將硅膠填料（可用薄層層析硅膠）裝入玻璃柱或透明塑料薄膜柱中，注意不要留有空隙。 2)、上樣： 將拌樣硅膠均勻地加入柱的上端，并在拌樣硅膠的上方加入與柱內(nèi)徑相同大小的原形濾紙。 3)、展開： 將薄層展開劑條件直接用于干柱層析上，配好足量的展開劑用分液漏斗滴加入柱中，待展開劑滲透到柱子的下端，即停止滴加。,4)、分割： 根據(jù)色帶或熒光帶做好標記，然后用彎勺取出各標記帶對應(yīng)的硅膠（玻璃柱），塑料薄膜柱可直接切割。 5)、洗脫： 用合適的溶劑提取色帶或熒光帶硅膠，也可裝入小玻璃柱用溶劑洗脫下來。 “注意點”： a ：上樣量比正常的硅膠柱層析要少，一般1:1001:300； b ：上柱硅膠的粒度越小效果越好，一般用與薄層規(guī)格同樣的硅膠H，大的開放柱粒度要大些。,12、與硅膠相關(guān)的反相色譜填料,常用的反相填料有RP-18(ODS)、RP-8和RP-2,13、反相分離色譜柱操作上的注意點,1)、流動相為含水系統(tǒng)，同樣可由相應(yīng)的TLC確定柱層析的色譜條件，常用的有機溶劑有甲醇、乙腈、四氫呋喃。 2)、柱層析的填料最好以甲醇浸泡上柱，然后用甲醇洗脫23個保留體積，再用水置換出甲醇備用。 3)、樣品最好用流動相溶解，盡可能避免溶解在有機溶劑的比例大于流動相的溶液中。 4)、對一些酸堿性物質(zhì)，為了使峰形變銳，有時流動相加入少量的酸或水，或需配成緩沖溶液（普通的反相色譜柱可耐受的pH為29），實驗完畢沖洗柱子時一定要先用水，然后用醇。,常見高效液相色譜柱的種類,鑒定化合物純度的方法,1、熔點測定法 2、薄層色譜法 3、高效液相色譜法 4、核磁共振法 4、電泳法,二、氧化鋁相關(guān)色譜,1、層析用氧化鋁規(guī)格和種類 薄層：200300目 柱層：60100目，100200目 1)、堿性氧化鋁：pH910，直接由氫氧化鋁高溫脫水制得。適用于對堿溶液比較穩(wěn)定的中性色素、甾族化合物、生物堿、醇以及其它中性、堿性物質(zhì)的分離。 2)、中性氧化鋁：可由堿性氧化鋁水洗至pH7.5，經(jīng)活化制得。中性氧化鋁使用最廣，適于醛、酮、醌、某些苷及酸堿溶液中不穩(wěn)定的化合物如酯、內(nèi)酯等化合物的分離。 3)、酸性氧化鋁：加入2N鹽酸處理，使水提液的pH為44.5，經(jīng)活化制得。適用于酸性色素及某些醛酸的分離。,2、氧化鋁的含水量與活性,3、氧化鋁活性的測定 細玻璃管法（展開劑：苯）,4、氧化鋁的再生 用甲醇、稀醋酸、氫氧化鈉溶液及水洗滌，再經(jīng)高溫活化后，可重復(fù)使用。 5、氧化鋁應(yīng)用的局限性 一些酚性化合物（部分黃酮、香豆素類）、酸性物質(zhì)（部分三萜酸）能與氧化鋁結(jié)合。此外，層析過程中引起的異構(gòu)化、氧化、皂化、水合，以及脫氯化氫形成雙鍵等反應(yīng)，應(yīng)引起操作者的注意。,三、聚酰胺相關(guān)柱色譜,1、聚酰胺的結(jié)構(gòu) 常用有錦綸6(聚己內(nèi)酰胺)和錦綸66(聚己二酰己二胺),2、聚酰胺的分離原理 1) 反相分配色譜（流動相：含水溶劑）： a、氫鍵吸附：聚酰胺分子內(nèi)的酰胺鍵，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵，因而產(chǎn)生吸附作用。 b、非極性固定相：聚酰胺非極性脂肪鏈。 2) 正相分配色譜（流動相：有機溶劑）： 極性小的化合物先被洗脫下來，表現(xiàn)在薄層層析上比移值較大。 3、聚酰胺適用范圍 黃酮、酚類、蒽醌類、萜類、甾體、生物堿、糖類等物質(zhì)的分離；去鞣質(zhì)。,4、聚酰胺的規(guī)格 柱層析聚酰胺 2040目，60100目，100200目 薄層層析聚酰胺 200300目 5、層析聚酰胺粉的預(yù)處理 聚酰胺粉（錦綸）中常有兩種雜質(zhì)：原料單體、小分子聚合物和蠟質(zhì)，在使用前需要預(yù)處理。 操作方法： 1)、以90%95%的乙醇浸泡，攪拌，除去氣泡后裝入柱中，用醇洗至洗液透明并在蒸干后無殘渣或極少量，一般至少洗脫34倍的體積。 2)、依次用23倍體積的5%NaOH水溶液、2倍體積的蒸餾水、23倍體積的10%醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性。,6、聚酰胺柱層析操作 裝柱：以含水溶劑系統(tǒng)層析，常以水裝柱（反相分配色譜）；若以有機溶劑系統(tǒng)層析，常以極性較小的起始溶劑裝柱（正相分配色譜）。 加樣：100ml的聚酰胺可吸附1.52.5g。干法上樣可參照硅膠柱層析；濕法上樣多用于反相分配色譜，樣品溶于或至少均勻分散在水溶液中。 洗脫：根據(jù)聚酰胺薄層層析結(jié)果確定柱層析的條件。反相分配色譜一般用水、稀至濃的乙醇；正相分配色譜一般用氯仿、氯仿-甲醇的混合溶劑。 再生：5%NaOH洗滌至溶液顏色變淡，然后蒸餾水洗至pH89，再以2倍量10%醋酸洗脫，最后以蒸餾水洗至中性。,黃芩二氯甲烷提取物經(jīng)硅膠柱分離后的一黃酮組分,Fr.145-236 (四個黃酮類化合物),Fr.23 B,Fr.33 A,Fr.42-52 D,Fr.55-63 C,Polyamide CHCl3 CHCl3-MeOH (100:1-1:1),A,B,C,D,Fr.145-236中的四個黃酮類成分,四、葡聚糖凝膠柱層析 1、交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu),2、常用葡聚糖凝膠種類、分離原理 Sephadex G 系列分子篩,葡聚糖凝膠G系列的性質(zhì),Sephadex LH20分子篩和反相分配色譜 羥丙基交聯(lián)葡聚糖凝膠，吸水量每克2ml?？稍谒陀袡C溶劑中使用，洗脫劑的選擇從被分離物質(zhì)的性質(zhì)和溶解度兩方面考慮。,3、葡聚糖凝膠柱色譜的操作 Sephadex LH20 1)、柱子的選擇 細長柱(長11.5m，直徑23cm) 2)、 浸泡 用上柱的洗脫溶劑浸泡34小時（分離小分子的G-10、15和LH20），然后攪拌排氣泡。 3)、 裝柱 空柱加洗脫液1/4左右，盡可能一次性加入所有凝膠，沉降、平衡至柱床不再下降為止。柱床越高，分離效果越好。,4)、加樣 待液面離柱床表面12mm時，用滴管加入樣品溶液（洗脫劑溶解），樣品溶液要盡量體積小、濃度大。 5)、洗脫 洗脫劑的選擇根據(jù)上柱樣品的性質(zhì)和樣品的溶解度。分離中性物質(zhì)可選擇水、電解質(zhì)和緩沖液；對阻滯較強的組分，可選擇含水有機溶劑，或單用有機溶劑。 6)、收集和檢出 帶有顏色的物質(zhì)可根據(jù)外觀色帶判斷； 有強UV吸收的物質(zhì)可用紫外燈照射來區(qū)分色譜帶； 無或較弱紫外吸收的物質(zhì)可用薄層層析行為判斷。 7)、再生 用0.5N 氫氧化鈉和0.5N氯化鈉混合液浸泡，再用水洗至中性。,葛根素大鼠灌喂后尿中代謝產(chǎn)物的分離,葛根素及其在大鼠尿中的代謝產(chǎn)物,Sephadex G系列在操作上的注意事項 （分離寡聚糖、多糖、多肽、蛋白） 浸泡溶劑：非有機溶劑，主要有水、電解質(zhì)和緩沖液。 洗脫溶劑：水、電解質(zhì)和不同pH值的緩沖溶液。 檢測方法：寡聚糖、多糖用硫酸顯色法； 多肽、蛋白可用硫酸銅或考馬思亮藍顯色,多糖分離實例,蛋白分離實例,植化方法學(xué)實驗內(nèi)容,一、普通硅膠柱色譜 二、制備薄層色譜 三、反應(yīng)薄層 四、制備高效液相色譜,大黃中的主要化學(xué)成分,雙蒽酮類成分（番瀉苷A、B）、鞣質(zhì)、沒食子酸、二苯乙烯苷類成分。,植化方法學(xué)實驗須知 1、大黃用量50g，提取溶劑95%乙醇，回流提取 兩次，每次200ml. 2、回收溶劑用常壓蒸餾裝置，可使用減壓泵。 3、考慮實驗室條件和時間原因，建議直接對提取浸 膏進行分離，不做分配萃取處理。提取浸膏的用 量根據(jù)色譜條件確定。 4、要求采用兩種手段分離：硅膠柱色譜(2cm40cm) 和硅膠制備薄層色譜（每組10塊2020cm2玻璃板 ，制備薄層需首日制備）。接硅膠玻璃柱下口的 塑料管須在準備室自制。,5、分離所用的玻璃儀器包括試管、錐形瓶、燒杯等 需要事先洗刷烘干。實驗結(jié)束后清洗干凈歸原位。 6、建議首日完成大黃的提取、溶劑回收，拌樣，合 并用薄層、制備薄層的制備。有時間的同學(xué)可摸 索柱色譜和制備薄層色譜的條件。 7、摸好色譜條件后應(yīng)立即向準備實驗的兩位老師申 請訂購溶劑的種類和數(shù)量（實驗室事先只準備摸 條件的用量）。,8、實驗室準備的溶劑：石油醚，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，甲醇； 吸附劑：薄層色譜硅膠（1040m ），柱色譜硅膠（200300目）； 顯色劑（裝置）：1%氫氧化鉀溶液，2%三氯化鐵溶液，10%硫酸乙醇溶液，紫外燈。,9、回收溶劑或廢溶劑禁止到入水槽，裝入試劑瓶標明。 10、實驗過程中使用石油醚等易燃易爆溶劑，實驗室禁止用火。 11、實驗過程中保持實驗室清潔，實驗結(jié)束時打掃衛(wèi)生。 12、實驗報告須每人上交一份，具體格式不限，但需達到讓他人能夠重復(fù)實驗的程度，實驗記錄自存。,