多功能酶標(biāo)儀課件.ppt

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1、酶 標(biāo) 儀 的 使 用 免 疫 球 蛋 白 的 結(jié) 構(gòu)免 疫 球 蛋 白 都 是 大 分 子 的 物 質(zhì) ， 輕 鏈 和 重 鏈 ，且 具 有 抗 原 結(jié) 合 的 部 位 。 什 么 是 抗 原 ？ 凡 能 刺 激 機(jī) 體 產(chǎn) 生 抗 體 ， 并 能 與 抗 體 發(fā)生 特 異 性 結(jié) 合 的 物 質(zhì) 稱 為 抗 原 。 物 質(zhì) 所 具 有的 這 種 特 性 稱 為 抗 原 性 。 抗 原 的 物 質(zhì) 可 以 是機(jī) 體 自 身 的 成 分 如 蛋 白 、 酶 、 多 肽 或 者 多 糖 。也 有 外 來 的 抗 原 （ 如 病 毒 、 污 染 物 ） 。 A B C D 二 、 酶 標(biāo) 儀 和

2、多 功 能 酶 標(biāo) 儀1.普 通 酶 標(biāo) 儀2.多 功 能 酶 標(biāo) 儀 1.普 通 酶 標(biāo) 儀即 酶 聯(lián) 免 疫 檢 測(cè) 儀 (ELISA Reader） Bio-RadModel 5504萬 元 光 源 光 電 檢 測(cè) 器電 信 號(hào) 經(jīng) 前 置 放 大 、 對(duì)數(shù) 放 大 、 模 數(shù) 轉(zhuǎn) 換 等 濾 光 片或 單 色 器 酶 標(biāo) 儀 結(jié) 構(gòu) 及 原 理 光 源 ： 鎢 燈濾 光 片 ： 常 用 的 波 長(zhǎng) 范 圍 ： 405nm 450nm(四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 ) 490nm(鄰 苯 二 胺 ) 630nm單 色 器 ： 可 調(diào) 節(jié) 波 長(zhǎng) 的 光 Thermo公司 全 波 長(zhǎng) 多功 能

3、酶 標(biāo) 儀50多 萬 元 三 、 酶 標(biāo) 儀 操 作 1. 注 意 事 項(xiàng) 2. 酶 標(biāo) 板 3. 操 作 要 點(diǎn) 1.注 意 事 項(xiàng)1） 反 復(fù) 研 讀 試 劑 盒 說 明 ， 熟 悉 操 作 步 驟 。2） 加 樣 的 準(zhǔn) 確 性 。 操 作 中 須 注 意 顯 色 劑 和終 止 的 加 量 準(zhǔn) 確 ， 最 好 使 用 加 樣 槍 加 液以 保 證 比 色 時(shí) 吸 光 度 的 準(zhǔn) 確 性 。 槍 頭 不要 混 用 。3） 洗 滌 時(shí) 間 。 一 般 按 照 說 明 書 要 求 ， 起 碼洗 滌 5次 ， 切 要 把 殘 液 甩 干 。 4） 觀 察 和 判 讀 吸 光 度 結(jié) 果 應(yīng) 在

4、15min 內(nèi) 完成 ， 否 則 液 體 顏 色 會(huì) 減 退 。5） 待 測(cè) 生 物 樣 品 要 放 在 4 冰 浴 上 。6） 顯 色 液 要 現(xiàn) 用 現(xiàn) 配 ， 避 光 低 溫 保 存 。7） 注 意 購(gòu) 買 抗 體 的 保 存 。 2.酶 標(biāo) 板 酶 標(biāo) 板 材 料 可 溶 性 抗 原 或 抗 體 吸 附 于 固 相 載 體 而 成為 不 溶 形 式 ， 這 是 進(jìn) 行 酶 標(biāo) 記 測(cè) 定 的 基本 條 件 。 許 多 物 質(zhì) 可 作 為 固 相 載 體 ， 如纖 維 素 、 交 聯(lián) 右 旋 糖 苷 、 瓊 脂 糖 珠 、 聚丙 烯 、 聚 苯 乙 烯 、 聚 乙 烯 及 聚 氯 乙 烯

5、 等等 。 但 在 ELISA中 最 常 用 的 是 聚 苯 乙 烯或 聚 氯 乙 烯 微 量 反 應(yīng) 板 。 由 于 微 量 反 應(yīng)板 所 用 試 劑 量 少 ， 操 作 方 便 ， 適 合 于 大規(guī) 模 應(yīng) 用 。 酶 標(biāo) 板 材 料 國(guó) 產(chǎn) 聚 苯 乙 烯 微 量 反 應(yīng) 板 （ 上 海 塑 料 三廠 出 品 ） 目 前 已 大 量 應(yīng) 用 于 ELISA測(cè) 定 ，并 且 獲 得 了 滿 意 的 結(jié) 果 。 但 每 批 微 量 反應(yīng) 板 對(duì) 抗 原 或 抗 體 蛋 白 質(zhì) 的 吸 附 性 能 是有 顯 著 差 別 的 。 實(shí) 驗(yàn) 證 明 ， 吸 附 效 果 似乎 與 塑 料 的 類 型

6、及 其 表 面 性 質(zhì) 有 關(guān) 。 特別 是 塑 料 制 品 在 加 工 過 程 中 因 工 藝 不 同或 受 其 他 因 素 的 影 響 而 造 成 吸 附 性 能 的極 大 差 異 ， 甚 至 完 全 喪 失 吸 附 能 力 。 酶 標(biāo) 板 鑒 定 對(duì) 每 批 制 品 在 使 用 前 ， 必 須 經(jīng) 過 實(shí) 驗(yàn) 室鑒 定 ， 鑒 定 的 方 法 和 標(biāo) 準(zhǔn) 是 對(duì) 每 批 購(gòu) 置 的微 量 反 應(yīng) 板 抽 樣 ， 用 檢 測(cè) 試 劑 盒 進(jìn) 行 試 驗(yàn) ，當(dāng) 顯 色 并 終 止 反 應(yīng) 后 ， 在 酶 標(biāo) 比 色 計(jì) 中 測(cè)定 其 O.D值 。 一 般 認(rèn) 為 全 板 中 每 兩 孔 間

7、O.D值 的 誤 差 不超 過 10%為 合 格 。 如 果 中 間 孔 與 四 周 孔O.D值 相 差 太 大 ， 或 者 反 應(yīng) 板 的 這 一 邊 與另 一 邊 凹 孔 的 O.D值 相 差 大 ， 均 不 合 格 。此 外 ， 還 要 檢 查 陽(yáng) 性 和 陰 性 參 考 血 清 O.D值 是 否 有 明 顯 差 別 。 一 般 要 求 有 10倍 左右 的 差 異 為 合 格 。 酶 標(biāo) 儀 單 、 雙 波 長(zhǎng) 檢 測(cè) 一 般 的 酶 標(biāo) 儀 在 測(cè) 定 中 均 有 單 波 長(zhǎng) 和 雙波 長(zhǎng) 的 模 式 ， 為 什 么 呢 ？ 酶 標(biāo) 儀 是 垂 直 光 路 ， 受 被 測(cè) 樣 本 液

8、 面 是否 水 平 、 酶 標(biāo) 板 透 光 性 、 孔 底 是 否 平 整等 的 影 響 較 大 。 選 擇 630nm為 參 比 波 長(zhǎng) , 測(cè) 定 其 吸 光 度 A0;在 測(cè) 定 波 長(zhǎng) （ 如 490nm/450nm） 下 測(cè) 定樣 本 的 吸 光 度 A,雙 波 長(zhǎng) 測(cè) 定 后 ,取 二 者 的差 值 , 測(cè) 定 結(jié) 果 的 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 比 單 波 長(zhǎng) 下 測(cè)定 的 要 小 ,實(shí) 驗(yàn) 誤 差 小 。 在 ELISA測(cè) 定 所 使 用 的 底 物 如 鄰 苯 二 胺或 四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 ， 顯 色 終 止 后 ， 在 630nm處 的 吸 光 度 值 都 只 有 吸 收 峰

9、處（ 490nm/450nm） 吸 光 度 值 的 1%以 下 ，因 此 ， 利 用 雙 波 長(zhǎng) 檢 測(cè) ， 不 會(huì) 影 響 檢 測(cè)靈 敏 度 。 一 般 酶 標(biāo) 儀 比 色 應(yīng) 該 首 選 雙 波 長(zhǎng) 。 酶 標(biāo) 儀 的 工 作 環(huán) 境1.儀 器 應(yīng) 放 置 在 無 強(qiáng) 磁 場(chǎng) 和 干 擾 電 壓 的 位 置 。2.儀 器 應(yīng) 放 置 在 噪 音 低 于 40分 貝 的 環(huán) 境 下 。3.為 延 緩 光 學(xué) 部 件 的 老 化 ， 應(yīng) 避 免 陽(yáng) 光 直 射 。4.操 作 環(huán) 境 溫 度 應(yīng) 在 1540 之 間 ， 環(huán) 境 濕 度 在15%85%之 間 。5.操 作 時(shí) 電 壓 應(yīng) 保 持

10、 穩(wěn) 定 。6.操 作 環(huán) 境 空 氣 清 潔 ， 避 免 水 汽 、 煙 塵 。7.保 持 干 燥 、 干 凈 、 水 平 的 工 作 臺(tái) 面 ， 以 及 足 夠的 操 作 空 間 。 3.Bio-Rad Model 550酶 標(biāo) 儀 操 作1.接 通 電 源 ， 打 開 酶 標(biāo) 儀 開 關(guān) 。2.儀 器 開 始 自 檢 。 Self disgonsis in progress3.按 箭 頭 光 標(biāo) 到 Mode,設(shè) 置 參 數(shù) 。 當(dāng) 儀 器 出現(xiàn) set analysis mode 時(shí) ， 按 enter確 定 。4.選 擇 測(cè) 定 波 長(zhǎng) 的 類 型 。 按 箭 頭 光 標(biāo) 到 D/S

11、,按 select選 中 ， enter 確 定 。 光 標(biāo) 出 現(xiàn)在 Dual/ Single， 選 擇 雙 波 長(zhǎng) ， 按 select選 中 ， enter 確 定 。 5.選 擇 濾 光 波 長(zhǎng) ， 此 酶 標(biāo) 儀 有 四 個(gè) 波 長(zhǎng) ： 1：405nm;2:450nm;3:490nm;4:630nm。 按 箭 頭 光標(biāo) 到 Filt,按 select選 中 ， enter 確 定 。 光 標(biāo) 出現(xiàn) 在 Mes=#X Ref=# Y， 如 按 光 標(biāo) 選 擇 數(shù) 字 3，即 490nm的 測(cè) 定 波 長(zhǎng) ,enter確 定 。 再 按 Next, 到Ref,按 光 標(biāo) 選 擇 參 考

12、波 長(zhǎng) ， 如 選 數(shù) 字 4.即 為630nm， enter 確 定 。 6.選 擇 是 否 混 合 。 按 箭 頭 光 標(biāo) 到 Mix,按 select選 中 ， enter 確 定 。 光 標(biāo) 出 現(xiàn) 在 yes/ No， 如光 標(biāo) 選 擇 No， 按 select選 中 ,enter 確 定 ， 說 明 樣品 不 混 合 。 7.返 回 原 顯 示 ， set analysis 的 D/S Filt Mix,按 enter出 現(xiàn) set analysis的 Mode。說 明 儀 器 已 經(jīng) 到 達(dá) 測(cè) 試 狀 態(tài) 。 8.推 開 測(cè) 定 蓋 ， 將 酶 標(biāo) 板 小 心 正 確 放 到

13、測(cè) 定 槽內(nèi) ， 合 住 蓋 。 9.上 好 酶 標(biāo) 儀 專 用 的 光 敏 打 印 紙 。 10.按 Start， 開 始 測(cè) 量 吸 光 度 ， 并 自 動(dòng) 打 印 測(cè)定 結(jié) 果 。 11.測(cè) 定 完 成 后 ， 取 出 酶 標(biāo) 板 ， 合 上 蓋 ， 關(guān) 儀 器開 關(guān) 和 電 源 ， 蓋 上 防 塵 罩 。 4.Therm o多 功 能 酶 標(biāo) 儀 的 操 作 1.開 機(jī) ， 點(diǎn) 擊 SkanIt RE for Varioskan flash2.4.3,進(jìn) 入 分 析 系 統(tǒng) ； 2. 選 擇 new session;name;next； 3.選 擇 酶 標(biāo) 板 ， 如 96孔 版 ； next； 4.選 定 文 件 夾 ； 設(shè) 定 測(cè) 定 方 法 ， 如 波 長(zhǎng) ； 5.連 接 儀 器 connect； 放 板 （ in） ,save;點(diǎn) 擊excute session;開 始 讀 板 ， Results,保 存 數(shù) 據(jù) ；觀 察 結(jié) 果 ， 記 錄 或 保 存 ； 6.取 板 （ out） ,斷 開 連 接 disconnect,關(guān) 機(jī) 。 思 考 題 普 通 酶 標(biāo) 儀 測(cè) 定 時(shí) 為 什 么 選 擇 雙 波 長(zhǎng)測(cè) 定 ？ ELISA法 的 原 理 是 什 么 ？ 普 通 酶 標(biāo) 儀 和 紫 外 分 光 光 度 計(jì) 有 什 么區(qū) 別 ？