實驗13-瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法.ppt

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,瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法,一、電泳方法的分類,按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可為：濾紙及其他纖維（如醋酸纖維、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維）薄膜電位；粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳；凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠等；絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。,按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可為：平板式電泳，支持物水平放置，是最常用的電泳方式；垂直板式電泳，聚丙烯酰胺凝膠常做成垂直板式電泳；垂直柱式電泳，聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳即屬于此類；連續(xù)液動電泳，首先應用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，溶液自頂端向下流，與電泳方向垂直。,概念：以瓊脂糖凝膠作支持體的電泳方式。,二、瓊脂糖凝膠電泳,天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉，從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。,瓊脂糖（agarose）瓊脂膠（agaropectin）,天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(約占80%)及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。,瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。,D-半乳糖,3，6-脫水-L-半乳糖,瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下：(1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98-99%)，近似自由電泳，樣品擴散度較自由電泳小，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。(4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。,瓊脂糖凝膠電泳的缺點：(1)機械強度差，易破碎，濃度不能太低。(2)易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。(3)瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。(4)與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。,目前，瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。瓊脂糖也可用作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1μg蛋白質(zhì)就可檢出。,瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相對分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。,三、DNA的瓊脂糖凝膠電泳,1.核酸分子大小及瓊脂糖的濃度的關(guān)系(1)DNA分子的大小：DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。,在凝膠中，DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離進行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，應用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。,(2)瓊脂糖的濃度：不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離,如下表所示:,2.核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：共價閉環(huán)DNA(covalentlyclosedcircular，簡稱cccDNA)＞直線DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA(一般為球形)不能進入膠中，相對遷移率為0(Rm=O)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm＞O)，由此可見，這3種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。,3.電泳方法(1)凝膠類型用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而受到人們的歡迎。,(2)緩沖液系統(tǒng)缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，濃度約為50mmol/L(pH7.5-7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點，室溫下貯存5溶液，用時稀釋10倍。0.5工作液也可提供足夠的緩沖能力。,(3)凝膠的制備以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，冷卻至45-50℃時灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。(4)樣品配制與加樣DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖溶解液內(nèi)含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。,(5)電泳瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明：在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃，進行電泳。(6)染色和拍照常用熒光染料溴乙錠(EB)染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。,注意!,溴化乙錠（EB）為強致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。目前實驗室一般用相對安全的GoldenView等核酸熒光染料代替。,四、印跡轉(zhuǎn)移電泳,生物化學與分子生物學的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離后的DNA進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作，1975年，Southern創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜(NC膜)上，再進行雜交的方法，被稱為Southern印跡法。隨后，Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設(shè)計了將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再與相應的抗體等配體反應，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉(zhuǎn)移。1982年Reinhart等用電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶從凝膠轉(zhuǎn)移到特定膜上，稱Eastern印跡。,目前國內(nèi)外有多種核酸、蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移的電泳裝置出售，使印跡轉(zhuǎn)移速度快、效率高、重復性好，應用更加廣泛，儀器的使用方法可參照廠家說明書。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳，但轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉(zhuǎn)移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。進行印跡轉(zhuǎn)移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質(zhì)帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間不能有氣泡。適當提高電壓或電流可以提高轉(zhuǎn)移速度，但亦會增加熱效應，故電壓或電流不可過高。,一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構(gòu)象，沿新的泳動方向伸直，而轉(zhuǎn)向時間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。,五、交變脈沖電場凝膠電泳,1983年，Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時間(外推為零的滯留時間)與DNA分子大小有關(guān)的特性，設(shè)計了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。后來，Carle等改進了電泳技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉(zhuǎn)換電場(periodicinversionoftheelectricfield)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一個水平式電泳槽和兩組獨立，彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。,一塊正方形瓊脂糖凝膠板(10cm10cm或20cm20cm)呈45置于中央，電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。電泳時，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當DNA分子達到一定構(gòu)型后，才能繼續(xù)前進。DNA分子凈移動方向與加樣線(圖中點線)垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬bp的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時間均可調(diào)，使用更加方便。,按電泳法分：按超速離心法分：乳糜微粒（CM）乳糜微粒CM(pI，各種脂蛋白均帶負電，電泳時由負極到正極；VLDL為圓形，受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。,,,,,,加樣槽β前βα,CMLDLVLDLHDL,—,+,臨床應用：高脂蛋白血癥的分型CMβ前βα正常Ⅰ型Ⅱa型Ⅱb型Ⅲ型Ⅳ型Ⅴ型,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,