實(shí)驗(yàn)13-瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法.ppt

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,瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法,一、電泳方法的分類,按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可為：濾紙及其他纖維（如醋酸纖維、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維）薄膜電位；粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳；凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠等；絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。,按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可為：平板式電泳，支持物水平放置，是最常用的電泳方式；垂直板式電泳，聚丙烯酰胺凝膠常做成垂直板式電泳；垂直柱式電泳，聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳即屬于此類；連續(xù)液動電泳，首先應(yīng)用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，溶液自頂端向下流，與電泳方向垂直。,概念：以瓊脂糖凝膠作支持體的電泳方式。,二、瓊脂糖凝膠電泳,天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉，從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。,瓊脂糖（agarose）瓊脂膠（agaropectin）,天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(約占80%)及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。,瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。,D-半乳糖,3，6-脫水-L-半乳糖,瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下：(1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進(jìn)行電泳。(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98-99%)，近似自由電泳，樣品擴(kuò)散度較自由電泳小，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。(4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。,瓊脂糖凝膠電泳的缺點(diǎn)：(1)機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。(2)易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。(3)瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。(4)與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。,目前，瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。瓊脂糖也可用作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1μg蛋白質(zhì)就可檢出。,瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相對分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。,三、DNA的瓊脂糖凝膠電泳,1.核酸分子大小及瓊脂糖的濃度的關(guān)系(1)DNA分子的大?。篋NA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。,在凝膠中，DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離進(jìn)行比較，便可測出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。,(2)瓊脂糖的濃度：不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離,如下表所示:,2.核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動速度次序?yàn)椋汗矁r閉環(huán)DNA(covalentlyclosedcircular，簡稱cccDNA)＞直線DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA(一般為球形)不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為0(Rm=O)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(jìn)(Rm＞O)，由此可見，這3種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。,3.電泳方法(1)凝膠類型用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因?yàn)樗颇z和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而受到人們的歡迎。,(2)緩沖液系統(tǒng)缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時，會造成膠熔化和DNA的變性。常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，濃度約為50mmol/L(pH7.5-7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5溶液，用時稀釋10倍。0.5工作液也可提供足夠的緩沖能力。,(3)凝膠的制備以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，冷卻至45-50℃時灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。(4)樣品配制與加樣DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖溶解液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。,(5)電泳瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明：在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強(qiáng)度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強(qiáng)度不宜高于5V/cm。電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳，只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃，進(jìn)行電泳。(6)染色和拍照常用熒光染料溴乙錠(EB)染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。,注意!,溴化乙錠（EB）為強(qiáng)致癌劑，操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。目前實(shí)驗(yàn)室一般用相對安全的GoldenView等核酸熒光染料代替。,四、印跡轉(zhuǎn)移電泳,生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離后的DNA進(jìn)行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進(jìn)行雜交操作，1975年，Southern創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜(NC膜)上，再進(jìn)行雜交的方法，被稱為Southern印跡法。隨后，Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設(shè)計(jì)了將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再與相應(yīng)的抗體等配體反應(yīng)，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉(zhuǎn)移。1982年Reinhart等用電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶從凝膠轉(zhuǎn)移到特定膜上，稱Eastern印跡。,目前國內(nèi)外有多種核酸、蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移的電泳裝置出售，使印跡轉(zhuǎn)移速度快、效率高、重復(fù)性好，應(yīng)用更加廣泛，儀器的使用方法可參照廠家說明書。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳，但轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉(zhuǎn)移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因?yàn)槟猃埬C(jī)械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移電泳時，要注意緩沖液的離子強(qiáng)度要低，pH要遠(yuǎn)離pI，使蛋白質(zhì)帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間不能有氣泡。適當(dāng)提高電壓或電流可以提高轉(zhuǎn)移速度，但亦會增加熱效應(yīng)，故電壓或電流不可過高。,一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因?yàn)樵诃傊悄z中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構(gòu)象，沿新的泳動方向伸直，而轉(zhuǎn)向時間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。,五、交變脈沖電場凝膠電泳,1983年，Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時間(外推為零的滯留時間)與DNA分子大小有關(guān)的特性，設(shè)計(jì)了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。后來，Carle等改進(jìn)了電泳技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉(zhuǎn)換電場(periodicinversionoftheelectricfield)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一個水平式電泳槽和兩組獨(dú)立，彼此垂直的電極組成，一組電極負(fù)極為N，正極為S；另一組負(fù)極為W，正極為E。,一塊正方形瓊脂糖凝膠板(10cm10cm或20cm20cm)呈45置于中央，電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。電泳時，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當(dāng)DNA分子達(dá)到一定構(gòu)型后，才能繼續(xù)前進(jìn)。DNA分子凈移動方向與加樣線(圖中點(diǎn)線)垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬bp的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時間均可調(diào)，使用更加方便。,按電泳法分：按超速離心法分：乳糜微粒（CM）乳糜微粒CM(pI，各種脂蛋白均帶負(fù)電，電泳時由負(fù)極到正極；VLDL為圓形，受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。,,,,,,加樣槽β前βα,CMLDLVLDLHDL,—,+,臨床應(yīng)用：高脂蛋白血癥的分型CMβ前βα正常Ⅰ型Ⅱa型Ⅱb型Ⅲ型Ⅳ型Ⅴ型,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,