實(shí)驗(yàn)七血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析.ppt

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血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析,【目的要求】1.掌握瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白的原理,掌握正常人血漿脂蛋白的分類(lèi)。2.熟悉瓊脂糖凝膠電泳的特點(diǎn)和操作要點(diǎn)。3.了解電泳帶中脂蛋白顯色特點(diǎn),【實(shí)驗(yàn)原理】,瓊脂在化學(xué)上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復(fù)合物，為一種含硫酸根、帶負(fù)電荷的多糖類(lèi)物質(zhì)。瓊脂是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3，6脫水L-半乳糖的殘基交替排列組成。瓊脂糖主要通過(guò)氫鍵形成凝膠。電泳時(shí)，因?yàn)槟z中含水量大（98～99%），近似自由電泳，固體支持物的影響較少，故電泳速度快、區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團(tuán)，電滲影響很小，是一種良好的電泳材料，分離效果較好。血清中脂類(lèi)物質(zhì)均與載脂蛋白結(jié)合成水溶性脂蛋白形式存在。各種脂蛋白所含載脂蛋白的種類(lèi)及數(shù)量不同，因而不同脂蛋白顆粒大小相差很大。因此，以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場(chǎng)中可使各種脂蛋白顆粒分開(kāi)。瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白方法簡(jiǎn)單。將血清脂蛋白用脂類(lèi)染料蘇丹黑（或油紅等）進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過(guò)的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行分離。通電后，可以看到脂蛋白被分成三條區(qū)帶，從負(fù)極到正極依次為β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最淺）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原點(diǎn)處應(yīng)無(wú)乳糜微粒。,【實(shí)驗(yàn)器材】,1.電泳儀、電泳槽2.載玻片3.臺(tái)式離心機(jī),【實(shí)驗(yàn)操作】,1.預(yù)染血清血清0.2ml中加蘇丹黑色液0.02ml，混合置37℃水浴中染色30分鐘，離心（2，000轉(zhuǎn)/分）5分鐘。2.制備瓊脂糖凝膠板將已配制好的0.50%瓊脂糖凝膠于水浴中加熱融化，用吸管吸取約3ml凝膠溶液澆注在載玻片上，立即放上“橋”，靜置待其凝固后，小心取下“橋”。3.電泳將凝膠板平行放入電泳槽中，加樣孔端置負(fù)極。用四層濾紙于巴比妥緩沖液浸濕，然后輕輕蓋貼在凝膠板兩端，濾紙的另一端則浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液中。接通電源后低壓加樣，加樣完后電壓調(diào)為120～130V。經(jīng)電泳35～50分鐘，即可見(jiàn)到分離的區(qū)帶。4.如果需要保留電泳圖譜，可將電泳后的凝膠板放入干膠機(jī)中制成干膠片。若無(wú)干膠機(jī)，可用玻璃紙包好凝膠板（連同載玻片），其上平鋪多層吸水濾紙，濾紙上再壓上書(shū)等重物，吸干凝膠中的水分。也可將凝膠板先放入清水中浸泡脫鹽2小時(shí)，然后放烘箱（80℃左右）中烘干，但應(yīng)陋隨時(shí)注意溫度的變化以及凝膠的脫水程度，以避免凝膠在脫水過(guò)程中龜裂。,【注意事項(xiàng)】,1.預(yù)染血清與溫度有關(guān)，低溫著色慢，高溫著色快，37℃較為適宜。2.澆注瓊脂糖凝膠板要盡量使厚薄均一，否則會(huì)影響脂蛋白的分離效果。3.將凝膠板放入電泳槽中，應(yīng)切記與電力線平行、樣品端置負(fù)極、搭橋?yàn)V紙不能搭在樣品上。4.制備干膠時(shí)，要嚴(yán)控制脫水的溫度和速度，避免脫水時(shí)溫度過(guò)高、速度太快引起凝膠收縮龜裂。,【思考題】,1.瓊脂糖凝膠電泳有哪些操作要點(diǎn)？2.在不同的實(shí)驗(yàn)方法（超速離心、瓊脂糖凝膠電泳、PAGE）中，正常人血清脂蛋白如何分類(lèi)，電泳后的相對(duì)位置及其與超速離心法的對(duì)應(yīng)關(guān)系？3.各種脂蛋白的功能？為什么正常人血清脂蛋白電泳時(shí)見(jiàn)不到乳糜微粒區(qū)帶？,【正常參考值】,乳糜微粒（CM）0～0%β－脂蛋白（β-LP）（LDL為主）50～60%前β－脂蛋白（Preβ-LP）13～25%α-脂蛋白（α－LP）（HDL為主）20～40%,