實驗七血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析.ppt

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血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析,【目的要求】1.掌握瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白的原理,掌握正常人血漿脂蛋白的分類。2.熟悉瓊脂糖凝膠電泳的特點和操作要點。3.了解電泳帶中脂蛋白顯色特點,【實驗原理】,瓊脂在化學上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復合物，為一種含硫酸根、帶負電荷的多糖類物質(zhì)。瓊脂是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3，6脫水L-半乳糖的殘基交替排列組成。瓊脂糖主要通過氫鍵形成凝膠。電泳時，因為凝膠中含水量大（98～99%），近似自由電泳，固體支持物的影響較少，故電泳速度快、區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團，電滲影響很小，是一種良好的電泳材料，分離效果較好。血清中脂類物質(zhì)均與載脂蛋白結(jié)合成水溶性脂蛋白形式存在。各種脂蛋白所含載脂蛋白的種類及數(shù)量不同，因而不同脂蛋白顆粒大小相差很大。因此，以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可使各種脂蛋白顆粒分開。瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑（或油紅等）進行預染。再將預染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進行分離。通電后，可以看到脂蛋白被分成三條區(qū)帶，從負極到正極依次為β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最淺）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原點處應無乳糜微粒。,【實驗器材】,1.電泳儀、電泳槽2.載玻片3.臺式離心機,【實驗操作】,1.預染血清血清0.2ml中加蘇丹黑色液0.02ml，混合置37℃水浴中染色30分鐘，離心（2，000轉(zhuǎn)/分）5分鐘。2.制備瓊脂糖凝膠板將已配制好的0.50%瓊脂糖凝膠于水浴中加熱融化，用吸管吸取約3ml凝膠溶液澆注在載玻片上，立即放上“橋”，靜置待其凝固后，小心取下“橋”。3.電泳將凝膠板平行放入電泳槽中，加樣孔端置負極。用四層濾紙于巴比妥緩沖液浸濕，然后輕輕蓋貼在凝膠板兩端，濾紙的另一端則浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液中。接通電源后低壓加樣，加樣完后電壓調(diào)為120～130V。經(jīng)電泳35～50分鐘，即可見到分離的區(qū)帶。4.如果需要保留電泳圖譜，可將電泳后的凝膠板放入干膠機中制成干膠片。若無干膠機，可用玻璃紙包好凝膠板（連同載玻片），其上平鋪多層吸水濾紙，濾紙上再壓上書等重物，吸干凝膠中的水分。也可將凝膠板先放入清水中浸泡脫鹽2小時，然后放烘箱（80℃左右）中烘干，但應陋隨時注意溫度的變化以及凝膠的脫水程度，以避免凝膠在脫水過程中龜裂。,【注意事項】,1.預染血清與溫度有關(guān)，低溫著色慢，高溫著色快，37℃較為適宜。2.澆注瓊脂糖凝膠板要盡量使厚薄均一，否則會影響脂蛋白的分離效果。3.將凝膠板放入電泳槽中，應切記與電力線平行、樣品端置負極、搭橋濾紙不能搭在樣品上。4.制備干膠時，要嚴控制脫水的溫度和速度，避免脫水時溫度過高、速度太快引起凝膠收縮龜裂。,【思考題】,1.瓊脂糖凝膠電泳有哪些操作要點？2.在不同的實驗方法（超速離心、瓊脂糖凝膠電泳、PAGE）中，正常人血清脂蛋白如何分類，電泳后的相對位置及其與超速離心法的對應關(guān)系？3.各種脂蛋白的功能？為什么正常人血清脂蛋白電泳時見不到乳糜微粒區(qū)帶？,【正常參考值】,乳糜微粒（CM）0～0%β－脂蛋白（β-LP）（LDL為主）50～60%前β－脂蛋白（Preβ-LP）13～25%α-脂蛋白（α－LP）（HDL為主）20～40%,