《放射醫(yī)學(xué)研究所》PPT課件.ppt

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1、朱茂祥 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 2004.06,中式卷煙的 生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù),報(bào)告內(nèi)容,發(fā)展中式卷煙的意義 從吸煙與健康談起 中式卷煙的生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù) 技術(shù)原理與方法 代表性中式卷煙的安全性評(píng)價(jià)舉例 煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害 使用SRM生物濾嘴降低卷煙危害,吸煙與健康事實(shí)與問(wèn)題,全世界1/3的成年男性吸煙，香煙銷(xiāo)售量約1.51010支/d（約1.0107支/min） 未成年人中有近1/5的吸煙者，而且每天還以810萬(wàn)人的速度增加（近一半在亞洲） 發(fā)達(dá)國(guó)家吸煙人數(shù)呈下降趨勢(shì)，但女性吸煙者增多。目前美國(guó)吸煙的女性約2200萬(wàn)人，韓國(guó)女性吸煙比例從1989年的3.9%上升到1998

2、年的6.7%，增加了近2倍；在日本，最近十年中女性吸煙者的比例也達(dá)到近10% 在中國(guó)，香煙消費(fèi)量占全世界1/3，每年消耗的香煙數(shù)約1.71012支（每分鐘3.0106支），吸煙人數(shù)3.2億，比整個(gè)美國(guó)人口還多，成年人中，約67%的男性和4%的女性吸煙，未成年人中，約1/3的男性和8%的女性吸煙 WHO：2004年公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)字,事實(shí),,19651998年間美國(guó)大于18歲公民中吸煙者的比例（按性別） （CDC，MMWR, 2000，Vol 49, No. 39）,事實(shí),1964 US Surgeon General報(bào)告吸煙對(duì)健康的不良影響 1965 41%的美國(guó)成年人吸煙 1967 煙盒上標(biāo)示“

3、吸煙有害健康” 1970 電視上禁止煙草廣告 2000 美國(guó)只有25%的成年人吸煙,19001998年間美國(guó)成年人年均吸煙量,煙草中含有大量碳水化合物（占40%50%），羧酸，色素，萜烯類(lèi)，鏈烷烴，類(lèi)脂物質(zhì)，以及一些生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物（如硝酸鹽等）和某些污染物（如農(nóng)藥、重金屬等） 吸煙是不完全燃燒過(guò)程，煙草經(jīng)一系列熱分解與熱合成反應(yīng)，產(chǎn)生大量化學(xué)物質(zhì)。據(jù)分析，煙氣中化學(xué)成分共5068種，除煙草中存在的1172種外，3896種是吸煙過(guò)程中產(chǎn)生的新的化學(xué)物質(zhì) Roberts，1988 Tobacco Reporter,事實(shí),卷煙煙氣的粒相物（如脂肪烴、芳香烴、萜類(lèi)、羰基化合物、酚類(lèi)、有機(jī)酸、氮雜環(huán)、

4、亞硝胺、金屬）和氣相物（如氮、氧、CO2、CO、氫、揮發(fā)性烴類(lèi)、酯類(lèi)、呋喃類(lèi)、腈類(lèi)）中包含多種有害成分，如氣相中的CO、氮氧化物、丙烯醛、揮發(fā)性芳香烴、氫氰酸，粒相中的稠環(huán)芳烴、酚類(lèi)、煙堿、亞硝胺、雜環(huán)化合物及微量放射性元素，以及氣相與粒相中都存在的自由基等 Hoffmann list：卷煙煙氣存在44種有害成分 69種致癌物中（包括一些促癌劑或輔致癌物）NNK最受關(guān)注 Hoffmann D：Chem Res Toxicol 2001; 14(7):767-90 40年吸煙（40支/天）的累積NNK量可致癌 Hoffmann D：Prev Med 1997; 26(4):427-34,事實(shí)

5、,幾乎所有的機(jī)體組織、器官或系統(tǒng)均可受到吸煙的影響，其中，最敏感的部位是呼吸系統(tǒng)（肺、氣管、咽喉）、循環(huán)系統(tǒng)（心臟、血管），神經(jīng)系統(tǒng)（腦），免疫和抗氧系統(tǒng)也是近年來(lái)研究較多的問(wèn)題。孕婦、未成年人（特別是嬰育兒）對(duì)吸煙的敏感性尤為值得關(guān)注 吸煙可造成40種致命疾病，包括口腔癌、食道癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、膽囊癌、子宮內(nèi)膜癌及其他非常罕見(jiàn)的疾病等。長(zhǎng)期吸煙者肺癌發(fā)病率比不吸煙者高1020倍，喉癌發(fā)病率高610倍，冠心病發(fā)病率高23倍。循環(huán)系統(tǒng)發(fā)病率高3倍，氣管炎發(fā)病率高28倍 英國(guó)牛津拉德克里夫醫(yī)院ICRF癌癥研究中心 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)與流行病學(xué)教授Richard Peto 世界衛(wèi)生組織煙草與衛(wèi)生規(guī)劃署研

6、究員Alan D. Lopez 19502000年期間發(fā)達(dá)國(guó)家的吸煙死亡率,事實(shí),全世界每年死于與吸煙有關(guān)的疾病人數(shù)達(dá)400萬(wàn)，相當(dāng)于每8秒就有1人死亡。預(yù)計(jì)這一數(shù)字在2020年會(huì)上升到1000萬(wàn) 在中國(guó)，平均每天約有3 000人死于吸煙 世界衛(wèi)生組織煙草與衛(wèi)生規(guī)劃署煙草與衛(wèi)生：全球狀況報(bào)告 在美國(guó)，因吸煙引起的死亡，包括母親吸煙所致嬰兒早熟及被動(dòng)吸煙等間接的影響在內(nèi)，每年估計(jì)超過(guò)400 000人，約為全部死亡數(shù)的1/5，由此花費(fèi)的醫(yī)療和保健費(fèi)用約1500億美元,美國(guó)每年死于與吸煙有關(guān)的疾病人數(shù)（430,000人）,(引自：CDC, MMWR 1999; 48; 131-38),(199019

7、94年間年平均值),事實(shí),1994年美國(guó)與吸煙有關(guān)的疾病死亡情況 （引自：CDC，MMWR 1997, Vol. 48, No. 43; 993-996）,1995年英國(guó)因吸煙的疾病死亡人數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) (引自：Health Education Authority, 1998),在英國(guó)，估計(jì)每年有28.4萬(wàn) 人因吸煙引起的疾病住院治療，其中死亡人數(shù)約12萬(wàn)人。據(jù)估計(jì)，19502000年間，英國(guó)有600萬(wàn)人死于與吸煙有關(guān)的疾病，平均每年死于吸煙的人數(shù)是二戰(zhàn)前的12 倍。1995年，英國(guó)死于吸煙的人數(shù)為12.31萬(wàn)人，是交通事故(3444人)、吸毒(2663)、犯罪謀殺(503)、自殺(4379)、愛(ài)

8、滋病(195)以及其他意外死亡(8986)的總和（20170）的6倍,問(wèn)題,如果不進(jìn)行劑量分析和評(píng)價(jià)，單憑卷煙煙氣中存在的有害成分，就認(rèn)定其對(duì)健康有不良影響，是不科學(xué)的 “所有的物質(zhì)本身并非毒物，劑量才使一種物質(zhì)變成毒物” “毒物和藥物之間的區(qū)別在于正確的劑量” 16世紀(jì)著名醫(yī)學(xué)家Paracelsus 與城市空氣污染比較，人類(lèi)接觸有害環(huán)境因素中，來(lái)自于卷煙煙氣，相對(duì)來(lái)說(shuō)是較少的 目前，“吸煙有害健康”的“證據(jù)”主要來(lái)自于流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，存在商榷之處,,吸煙者的“誤區(qū)” 停止吸煙會(huì)導(dǎo)致體重增加 沒(méi)有直接證據(jù)表明吸煙能導(dǎo)致癌癥 肺癌是多因素疾病 絕大多數(shù)人都吸煙 吸煙的危害遠(yuǎn)沒(méi)有

9、政府宣傳和倡導(dǎo)的那么嚴(yán)重 許多重度吸煙者并沒(méi)有得病，且壽命很長(zhǎng) 目前市場(chǎng)是的煙焦油量都較低，每天吸煙少于20支應(yīng)該說(shuō)是安全的 環(huán)境煙草煙氣對(duì)不吸煙者并沒(méi)有嚴(yán)重的影響,問(wèn)題,中式卷煙的 生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù) 技術(shù)原理與方法,,,篩選對(duì)煙氣敏感的細(xì)胞系：用于實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞系有數(shù)百種，其中人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)富含P450酶，在無(wú)需代謝活化因子S9時(shí)能轉(zhuǎn)化利用NNK等煙氣中主要有害物質(zhì),研制中的細(xì)胞氣體中毒裝置：細(xì)胞在培養(yǎng)液中染毒，與人類(lèi)吸煙實(shí)際情況有差別，研制細(xì)胞氣體中毒裝置對(duì)煙氣評(píng)價(jià)意義重大,卷煙煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià),動(dòng)物吸煙中毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒ⅲ簞?dòng)物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻條件下自由吸

10、入卷煙煙氣,動(dòng)物吸煙試驗(yàn),煙氣細(xì)胞中毒試驗(yàn),急性毒性,評(píng)價(jià)方案,急性毒性,慢性毒性,蓄積毒性,生殖毒性,免疫毒性,增殖死亡,氧化損傷,膜損傷,致突致畸致癌,基因毒性,煙草煙氣中有數(shù)千種物質(zhì)，單一或數(shù)種有害成分的分析難以全面真實(shí)客觀地反映吸煙的健康影響。卷煙煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)是以吸煙產(chǎn)生的煙氣做為整體，通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞中毒試驗(yàn)，用毒理學(xué)的方法，對(duì)卷煙煙氣的健康影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，檢驗(yàn)降焦減害技術(shù)應(yīng)用于卷煙中提高卷煙安全性的效果。,其他功能檢測(cè),第一級(jí)，動(dòng)物要求2種，雌雄各半，細(xì)胞至少2種，代表人和動(dòng)物來(lái)源的支氣管和成纖維細(xì)胞各1種。最好是2種染毒途徑。如果兩種卷煙（一般是試驗(yàn)樣品煙和

11、對(duì)照煙）的急性毒性差異明顯，則無(wú)需進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，否則需進(jìn)行第二級(jí)和第三級(jí)，甚至其他評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),分級(jí)評(píng)價(jià)方案,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其吸煙染毒,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠和Wistar大鼠是我國(guó)“新藥審批辦法”推薦使用的動(dòng)物。動(dòng)物到達(dá)后，按SOPA034的要求接收。每籠5只，飼養(yǎng)在二級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度301，濕度605%。由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)。所有動(dòng)物按SOPA035要求檢疫觀察1-3天，在此時(shí)間內(nèi)觀察動(dòng)物的疾病和死亡指征，出現(xiàn)異?，F(xiàn)象需向?qū)ｎ}負(fù)責(zé)人和臨床獸醫(yī)報(bào)告。由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供標(biāo)準(zhǔn)飼料。從動(dòng)物到達(dá)至研究結(jié)束自由攝食。用飲水瓶供應(yīng)消毒自來(lái)水，由動(dòng)物自由飲用。每日沖洗飲水瓶 吸煙染毒 用吸煙器吸煙，將煙氣導(dǎo)入

12、中毒室（有機(jī)玻璃盒），動(dòng)物在恒氧、恒壓、恒濕、恒溫和煙氣均勻的條件下自由吸入卷煙煙氣，造成動(dòng)物吸煙中毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?用于實(shí)驗(yàn)研究的靶細(xì)胞主要有鼠或人來(lái)源的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞四大類(lèi) 敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞（SHE） 優(yōu)點(diǎn)：易獲得，易培養(yǎng)，穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì) 缺點(diǎn)：敏感性較差，結(jié)果難以外推到人 人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B） 優(yōu)點(diǎn)：敏感性好，與人類(lèi)接近 缺點(diǎn)：難培養(yǎng)，費(fèi)用高 將吸煙器抽煙的煙氣，分別經(jīng)過(guò)有機(jī)相（乙酸乙酯）和無(wú)機(jī)相（基本培養(yǎng)液）收集。將有機(jī)溶劑揮發(fā)后，與培養(yǎng)液混合，并將煙氣濃度調(diào)整為1支煙/ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，造成細(xì)胞煙氣中毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?細(xì)胞系及其暴露卷煙煙氣染毒,通常急性毒性是

13、指動(dòng)物1d內(nèi)單次或多次染毒后在714d中連續(xù)觀察動(dòng)物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況?？紤]到吸煙的實(shí)際情況，在吸煙的急性毒性實(shí)驗(yàn)中，我們采用所有動(dòng)物同時(shí)開(kāi)始吸煙，連續(xù)染毒，直至全部動(dòng)物死亡為止，觀察動(dòng)物吸煙的反應(yīng)，準(zhǔn)確記錄每只動(dòng)物的死亡時(shí)間和吸煙量，計(jì)算平均活存時(shí)間和平均致死吸煙量，提供以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 第一只動(dòng)物和最后一只動(dòng)物死亡的時(shí)間和致死吸煙量（即死亡時(shí)間和劑量的范圍） 一半動(dòng)物發(fā)生死亡的時(shí)間和吸煙量（T1/2和LD50） 對(duì)照煙動(dòng)物全部死亡時(shí)，實(shí)驗(yàn)煙動(dòng)物的活存率 必要時(shí)，需對(duì)急性致死動(dòng)物的進(jìn)行病理觀察,動(dòng)物暴露卷煙煙氣的急性毒性試驗(yàn),細(xì)胞存活試驗(yàn),細(xì)胞在正常情況下按一定生長(zhǎng)速度倍增，當(dāng)受到有害因

14、素作用時(shí)，細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，表現(xiàn)出直接死亡或增殖性死亡 接種效率試驗(yàn) 細(xì)胞在低密度接種條件下，受損傷細(xì)胞不能存活，而正常細(xì)胞在一定時(shí)間后形成集落（克?。ㄟ^(guò)計(jì)數(shù)克隆數(shù)，可以計(jì)算活存細(xì)胞百分?jǐn)?shù) MTT試驗(yàn) 噻唑蘭（MTT）是一種細(xì)胞染料，能被活細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中利用并在細(xì)胞內(nèi)沉積，因此，MTT試驗(yàn)可用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖死亡率，評(píng)價(jià)有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒性作用,細(xì)胞氧化損傷活性氧檢測(cè),幾乎所有的環(huán)境有害因素均能通過(guò)直接或間接作用，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生包括活性氧在內(nèi)的自由基，這一方面是由于外源性化合物的代謝活化，并與其細(xì)胞或基因毒性密切相關(guān)；另一方面是細(xì)胞應(yīng)激性啟動(dòng)抗氧化防御機(jī)制以對(duì)抗外源性有害因素可能導(dǎo)致的細(xì)胞損

15、傷。細(xì)胞活性氧水平反應(yīng)了細(xì)胞對(duì)外源性有害因素作用時(shí)的毒性應(yīng)答，也就是外源性化合物的毒性 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 細(xì)胞中，分子探針DCFH-DA和HE可分別與H2O2和O2.反應(yīng)，生成二氯熒光黃（DCF）和溴乙錠（EB），并產(chǎn)生綠色和紅色熒光，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DCF和/或EB的熒光強(qiáng)度，即可相對(duì)定量細(xì)胞內(nèi)H2O2和O2.水平 細(xì)胞外活性含量 過(guò)氧化氫（H2O2）用辣根過(guò)氧化物酶和酚紅捕獲，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；超氧陰離子（O2.）用細(xì)胞色素C捕獲，通過(guò)測(cè)定吸光度改變進(jìn)行定量；羥自由基（.OH）用番紅花紅捕獲，通過(guò)測(cè)定吸光度改變進(jìn)行定量過(guò)氧化氫,細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界的屏蔽，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與物質(zhì)交換的重要功能。

16、有人提出膜損傷是疾病發(fā)生甚至癌變的標(biāo)志。細(xì)胞膜損傷可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)： 膜的通透性 乳酸脫氫酶（LDH）是胞漿中的一種常見(jiàn)酶，通常情況下不能透過(guò)細(xì)胞膜外逸，因此，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外LDH的活性，可以評(píng)價(jià)膜通透性的改變 膜的結(jié)構(gòu)與功能 腺苷三磷酸酶（ATPase）是細(xì)胞膜上的一種重要酶，負(fù)責(zé)重要離子的主動(dòng)跨膜運(yùn)輸。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜ATPase的活性，可以評(píng)價(jià)膜功能性的改變 膜的流動(dòng)性 采用熒光偏振法，細(xì)胞經(jīng)DPH熒光探針標(biāo)記后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光偏振度。Kex 362nm , Kem 432nm ,狹縫10nm ,測(cè)溫25 ,細(xì)胞膜損傷,長(zhǎng)期毒性（也稱(chēng)為亞急性毒性、亞慢性毒性、慢性毒性或終生

17、毒性）是指動(dòng)物反復(fù)多次染毒的毒性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，動(dòng)物每天固定時(shí)間吸煙1次，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求控制吸煙時(shí)間和吸煙量，持續(xù)3個(gè)月后活殺一批，余下動(dòng)物繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月進(jìn)行恢復(fù)期觀察。分別在吸煙前、吸煙期間的1個(gè)月和2個(gè)月、停止吸煙時(shí)（吸煙后3個(gè)月）、停止吸煙后1個(gè)月（吸煙后4個(gè)月）觀察動(dòng)物體重變化、血液學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，全部處死動(dòng)物，進(jìn)行肺組織病理學(xué)觀察。觀察指標(biāo)包括 一般觀察 外觀體征和行為活動(dòng)（如神態(tài)萎靡、倦縮不動(dòng)或過(guò)度興奮、躁動(dòng)驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常等），皮毛帖身或稀疏豎散，糞便性狀、顏色，食量及體重變化等 血液學(xué)指標(biāo) 紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞細(xì)胞數(shù)，血紅蛋白含量，白細(xì)胞及其分類(lèi)細(xì)胞數(shù)，血小板計(jì)數(shù)

18、，凝血時(shí)間等 血液生化指標(biāo) 天氡氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、肝酐（CREA）、總膽固醇（TCH）、鈣濃度（CA）等 病檢器官 心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、胸腺、睪丸(子宮)、腦、交列腺等的重量及其系數(shù)，以及部分器官的病理學(xué)檢查,動(dòng)物暴露卷煙煙氣的慢性毒性試驗(yàn),細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn) 即Ames試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用菌株為鼠傷寒沙門(mén)氏菌不同組氨酸缺陷型突變株，根據(jù)致突變物能靈敏而特異地使組氨酸缺陷型突變株回變成原型的特點(diǎn)，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，只有少數(shù)自發(fā)回變菌落

19、生長(zhǎng)，而能誘發(fā)細(xì)菌回變的致突變物可使細(xì)菌生長(zhǎng)增多，從而可判斷被試物是否具有致突變性 染色體畸變分析 染色體數(shù)目畸變 非整倍體（亞二倍體和超二倍體）、多倍體和內(nèi)復(fù)制 染色體結(jié)構(gòu)畸變 裂隙、斷裂、斷片、著絲粒環(huán)和無(wú)著絲粒環(huán)等 姐妹染色體交換 微核試驗(yàn),致突變?cè)囼?yàn),Hchr 11分帶,AL細(xì)胞 (400),AL細(xì)胞染色體核型,次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）主要參與嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合途徑，正常細(xì)胞能從頭合成DNA，因此HPRT酶對(duì)細(xì)胞存活繁殖是非必需的，HPRT基因突變后仍能較長(zhǎng)期活存。利用正常細(xì)胞中HPRT酶活性，加入毒性嘌呤類(lèi)似物6-巰基鳥(niǎo)嘌呤（6-TG）培養(yǎng)，細(xì)胞死亡，而HPRT基因突變的

20、細(xì)胞對(duì)6-TG有抗性而活存，并形成克隆，以此可以檢測(cè)HPRT基因突變 人類(lèi)11號(hào)染色體基因突變分析用人-中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢雜交細(xì)胞（AL細(xì)胞）檢測(cè)人類(lèi)11號(hào)染色體（Hchr 11）基因突變是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測(cè)基因突變的實(shí)驗(yàn)方法,基因突變,細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)化是是細(xì)胞失去原有正常形態(tài)和功能的表型特征，是細(xì)胞癌前病變的重要標(biāo)志，表現(xiàn)在細(xì)胞增殖速度加快（倍增時(shí)間縮短），細(xì)胞間接觸抑制消失（疊層生長(zhǎng)），并具有異種組織的浸潤(rùn)性（轉(zhuǎn)移）。檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力是評(píng)價(jià)外源性化合物致癌性的基本方法 動(dòng)物致癌試驗(yàn) 選擇腫瘤易感性高和腫瘤自然發(fā)生率低的純品系動(dòng)物，常用小鼠和大鼠。年齡以剛斷

21、乳為宜，因它們的易感性較高，同時(shí)也可具有較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間。計(jì)算癌瘤發(fā)生率，一般以病理組織診斷為依據(jù)，并與對(duì)照組相比較，以確定致癌的顯著性。確定誘癌潛伏期的長(zhǎng)短以第一例癌瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)間或平均癌瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)間計(jì)。判定癌瘤多發(fā)性，應(yīng)計(jì)數(shù)包括同一機(jī)體內(nèi)發(fā)生兩種或兩種以上類(lèi)型的腫瘤，或同一臟器、同一系統(tǒng)中出現(xiàn)多個(gè)同類(lèi)型的癌瘤,致癌試驗(yàn),生殖毒性試驗(yàn),雄性生殖毒性檢測(cè)方法 精子活動(dòng)度和精子計(jì)數(shù)分析 精子形態(tài)學(xué)試驗(yàn) 親代雄鼠睪丸(附睪)重量系數(shù) 系列交配與擴(kuò)展交配試驗(yàn) 雌性生殖毒性檢測(cè)方法 一代繁殖試驗(yàn) 多代繁殖試驗(yàn) 其它輔助試驗(yàn) （如雌性動(dòng)物動(dòng)情周期觀察、性激素水平的測(cè)定等 ） 胚胎毒性評(píng)定方法 胚胎死亡率 生

22、長(zhǎng)遲緩率 功能不全率 畸形率,免疫功能評(píng)價(jià),體液免疫 血對(duì)胸腺依賴(lài)抗原SRBC的抗體空斑反應(yīng)(PFC) 血清抗體滴度(血凝法、ELISA法) 有絲分裂原LPS刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 細(xì)胞免疫 T細(xì)胞數(shù)(ANAE染色法) 遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)(DTH) 有絲分裂原PHA、ConA刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 非特異免疫 自然殺傷細(xì)胞 單核細(xì)胞及T、B淋巴細(xì)胞標(biāo)記 腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)CRBC的吞噬作用 單核細(xì)胞對(duì)炭粒的廓清,代表性中式卷煙 安全性評(píng)價(jià)舉例 煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害 使用SRM生物濾嘴降低卷煙危害,煙絲添加神農(nóng)液 降低卷煙危害的生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià) 五葉神卷煙,試驗(yàn)樣品,五葉神品牌卷煙 煙絲中添加2.5神農(nóng)萃取液

23、制成的卷煙(編號(hào)205#) 同品牌對(duì)照煙 未使用神農(nóng)萃取液的空白煙,煙絲添加神農(nóng)液降低卷煙危害,與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，吸五葉神煙組，小鼠的平均活存時(shí)間和平均致死吸煙量分別增加了29.4%和34.1% 吸煙210 min，五葉神煙組小鼠100%存活，而對(duì)照煙組小鼠存活率僅為40%，當(dāng)對(duì)照煙組小鼠全都死亡時(shí)，五葉神煙組小鼠的存活率為高達(dá)86.7%,小鼠吸煙急性致死毒性試驗(yàn),n=6, 與空白煙比較，*p<0.05, **p<0.005,吸煙急性致死小鼠肺組織病理改變,n=6, 與空白煙比較，*p<0.05, ***p<0.001,吸煙急性致死大鼠肺組織病理改變,小鼠,大鼠,正常肺組織,對(duì)照煙,五葉神

24、,吸煙急性致死動(dòng)物肺組織病理形態(tài)改變,肺組織病理觀察結(jié)果表明，同為吸煙急性致死動(dòng)物，五葉神煙組肺損傷程度明顯減輕，表現(xiàn)在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚、出血、氣管擴(kuò)張、上皮變薄、肺囊泡和管周水腫等多項(xiàng)病理?yè)p傷指標(biāo)均明顯好于對(duì)照煙組,五葉神及其對(duì)照煙的細(xì)胞毒性比較,,,,,,,,五葉神煙誘發(fā)SHE和BEAS-2B細(xì)胞增殖的半數(shù)致死劑量分別是對(duì)照煙的1.7倍和4倍。提示： 五葉神煙的細(xì)胞毒性明顯降低 不同細(xì)胞系對(duì)卷煙煙氣敏感性不同 BEAS-2B細(xì)胞對(duì)空白煙的敏感性約是SHE細(xì)胞的11.5倍；而對(duì)五葉神煙的敏感性僅為SHE細(xì)胞的4.5倍：提示： 五葉神卷煙煙氣中能被P450酶活化的有害物質(zhì)降低？,過(guò)氧化

25、氫（H2O2）,超氧陰離子（O2.-）,五葉神及其對(duì)照煙誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS增高,,,五葉神卷煙誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧經(jīng)氫和超氧陰離子增高的能力分別僅為對(duì)照煙的65%和60%。提示五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞的氧化損傷顯著降低。 不同種類(lèi)活性氧對(duì)煙氣的敏感性不同：超氧陰離子的增高為過(guò)氧化氫的2.3倍,五葉神煙誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和超氧陰離子含量含量增高分別僅為同品質(zhì)對(duì)照煙的40%和29%，羥自由基含量不僅明顯低于同品質(zhì)對(duì)照煙，而且觀察到對(duì)羥自由基的清除(?)作用。表明五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞的氧化損傷顯著降低。,五葉神及其對(duì)照煙誘發(fā)細(xì)胞外ROS含量增高,五葉神及其對(duì)照煙對(duì)膜通透性影響,乳酸脫氫酶（LDH）是胞漿中一種常見(jiàn)酶

26、，通常情況下不能透過(guò)細(xì)胞膜外逸，因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外LDH的活性，可以評(píng)價(jià)膜通透性的改變 五葉神卷煙誘發(fā)細(xì)胞釋放的LDH活性增高僅為同品質(zhì)對(duì)照煙的36%，表明五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞膜損傷顯著降低。,五葉神及其對(duì)照煙對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能影響,腺苷三磷酸酶（ATPase）是細(xì)胞膜上的一種重要酶，負(fù)責(zé)重要離子的主動(dòng)跨膜運(yùn)輸。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜ATPase的活性，可以評(píng)價(jià)膜功能性的改變 對(duì)照煙誘發(fā)細(xì)胞膜ATP酶活性的降低程度為五葉神煙的1.5倍，表明五葉神卷煙對(duì)細(xì)胞膜損傷明顯減輕。,總ATP ase活性,五葉神及其對(duì)照煙對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能影響,不同ATP酶活性,鈉/鉀-ATP酶,鎂-ATP酶,鈣-ATP酶,鈣/鎂-

27、ATP酶,鈣、鎂-ATP酶是對(duì)煙氣敏感的指標(biāo) 除鈣-ATP酶外，五葉神煙對(duì)其他ATP酶的損傷作用明顯輕于對(duì)照煙 神農(nóng)萃取液含有活化鈉/鉀-ATP酶的活性成分(?),,,,,五葉神及其對(duì)照煙對(duì)Hchr 11基因突變的影響,人類(lèi)11號(hào)染色體(Hchr 11)對(duì)包含單拷貝Hchr 11的人-中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢雜交細(xì)胞(AL細(xì)胞)的存活無(wú)明顯影響。利用Hchr 11表達(dá)CD59表面抗原的特性，用CD59抗體可以篩選Hchr 11基因突變的AL突變細(xì)胞，從而檢測(cè)Hchr 11基因突變率。,五葉神卷煙誘發(fā)Hchr 11基因突變率明顯低于同品質(zhì)對(duì)照煙，提示五葉神煙具有較低的基因毒作用。,五葉神及其對(duì)照煙對(duì)HPRT

28、基因突變的影響,次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）對(duì)正常細(xì)胞DNA合成是非必需的，而HPRT基因突變體對(duì)基因毒物6-巰基鳥(niǎo)嘌呤具有抗性，以此可檢測(cè)HPRT基因突變。 低劑量時(shí)，五葉神卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率與對(duì)照煙無(wú)明顯差異 高劑量時(shí)，五葉神卷煙誘發(fā)HPRT基因突變率明顯低于同品質(zhì)對(duì)照煙,五葉神及其對(duì)照煙誘發(fā)SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化的比較,細(xì)胞轉(zhuǎn)化是細(xì)胞失去原有正常形態(tài)和功能的表型特征，是細(xì)胞癌前病變的重要標(biāo)志。檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力是評(píng)價(jià)外源性化合物致癌性的基本方法。 五葉神有2個(gè)連續(xù)劑量組（0.008和0.010）轉(zhuǎn)化率明顯增高，對(duì)照煙有3個(gè)連續(xù)劑量組（0.006、0.008和0.010）轉(zhuǎn)化率明顯增

29、高。 相同劑量下五葉神誘發(fā)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯低于對(duì)照煙，誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增高的能力比對(duì)照煙減少50%。,減少氨水刺激小鼠致咳反應(yīng)（治咳）,延長(zhǎng)喘息性抽搐潛伏期（平喘）,增加離體氣管酚紅排泌量（祛痰）,改善瘀血組織的血液流動(dòng)性,降低吸煙所致細(xì)胞染色單體交換（SCE）率,,,,抑制吸煙所致細(xì)胞微核形成,神農(nóng)萃取液應(yīng)用于卷煙中，使小鼠和大鼠吸煙急性死亡的時(shí)間和致死吸煙量分別增加了約60%和30%；特別是當(dāng)吸對(duì)照煙組動(dòng)物全部死亡時(shí)，五葉神煙組動(dòng)物存活率高達(dá)85%以上 同為吸煙急性致死動(dòng)物，五葉神煙組肺損傷程度明顯減輕，表現(xiàn)在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚、出血、氣管擴(kuò)張、上皮變薄、肺囊泡和管周水腫等多項(xiàng)病理?yè)p傷

30、指標(biāo)均明顯好于對(duì)照煙組。 與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，五葉神卷煙的細(xì)胞毒性降低了約24倍，誘發(fā)的細(xì)胞氧化損傷、膜損傷、染色體基因突變和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等細(xì)胞生物學(xué)改變均明顯減輕 與同品質(zhì)對(duì)照煙比較，五葉神卷煙減少動(dòng)物的刺激性咳嗽反應(yīng)，延長(zhǎng)喘息性抽搐的潛伏期，增加離體氣管酚紅排泌量，改善瘀血的血液流動(dòng)性，降低了吸煙所致染色單體交換率，抑制吸煙所致微核形成,結(jié)論,使用SRM生物濾嘴 降低卷煙危害的生物醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià) 5mg中南?；旌闲途頍?SRM降低卷煙煙氣自由基的效果及穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)樣品,1#煙 普通香煙 2#煙 5 mg 中南海香煙 4#煙 5 mg 中南海SRM低自由基香煙 (以上樣品均由北京卷煙廠提供),細(xì)胞毒作

31、用,小鼠急性毒性,雄性小鼠吸煙1個(gè)月后生殖器官改變,吸煙組動(dòng)物體重、睪丸重量及附睪重量均低于不吸煙組，其中體重和附睪重量降低明顯，但各吸煙組間無(wú)差異,雄性小鼠吸煙1個(gè)月后精子活性改變,精子總數(shù),吸1#煙組動(dòng)物精子總數(shù)明顯減少 吸2#煙組動(dòng)物精子總數(shù)減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 吸4#煙組動(dòng)物精子總數(shù)與不吸煙組相當(dāng),活潑(I類(lèi))和較活潑(II類(lèi))的精子數(shù) 吸1#煙組動(dòng)物最少，2#煙次之，4#煙最多，但均明顯低于不吸煙組,吸4#煙組動(dòng)物的活性精子數(shù)明顯多于1#煙組和2#煙組,死精子(IV類(lèi))數(shù) 吸煙組，1#煙和2#煙差不多，4#組較少，但均高于不吸煙組 吸4#煙組動(dòng)物的死精子數(shù)明顯少于2#煙和1#煙,活動(dòng)

32、不良精子(III類(lèi)) 3個(gè)吸煙組相近，稍高于不吸煙組，但統(tǒng)計(jì)上無(wú)明顯差異,不吸煙小鼠,吸2#煙小鼠,吸1#煙小鼠,吸4#煙小鼠,小鼠吸煙3個(gè)月后器官免疫功能,小鼠免疫功能,吸煙組動(dòng)物體重、脾臟重量及胸腺重量均低于不吸煙組，其1#和2#煙組減輕明顯，4#煙組與不吸煙組統(tǒng)計(jì)上差異列明顯，且4#煙組胸腺重量及其指數(shù)均明顯高于1#和2#煙組,非特異免疫,體液免疫,細(xì)胞免疫,3項(xiàng)免疫指標(biāo)吸煙組均低于不吸煙組，除外#煙的體液和細(xì)胞免疫外，均與不吸煙組有顯著性差異 4#煙組所檢測(cè)的3項(xiàng)免疫指標(biāo)均明顯高于1#和2#煙組,小鼠骨髓微核形成試驗(yàn),與不吸煙組比較，吸煙組微核發(fā)生率明顯增高，紅系造血功能顯著下降 吸煙

33、組間比較，4#煙組微核發(fā)生率明顯低于1#和2#煙組，紅系造血功能也明顯高于1#和2#煙組,結(jié)論,SRM能高效穩(wěn)定地降低卷煙煙氣中自由基含量 SRM低自由基香煙與同品牌同焦油含量香煙比較，安全性明顯提高，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 細(xì)胞毒效應(yīng)減少50%以上 動(dòng)物急性毒性反應(yīng)明顯減輕(活存時(shí)間延長(zhǎng)30% 致死劑量減少33%，肺組織病理?yè)p傷程度也明顯減輕) 精細(xì)胞總數(shù)高17%，活潑精子多120%，死精子減少27% 體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異免疫功能 分別增加30%、25%和60% 骨髓微發(fā)生率下降41%，紅系造血功能增高27%,結(jié)語(yǔ),吸煙與健康關(guān)系密切，并越來(lái)越受到社會(huì)各界，特別是煙草行業(yè)和衛(wèi)生部門(mén)的廣泛關(guān)注 發(fā)展以低危害卷煙為代表的中式卷煙成為關(guān)系到煙草行業(yè)生存與發(fā)展的重大問(wèn)題 煙醫(yī)結(jié)合開(kāi)展卷煙的安全性評(píng)價(jià)將為研發(fā)低危害卷煙提供重要的技術(shù)支撐，必將產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益,謝謝大家 Thank for your attention,以上部分內(nèi)容純屬個(gè)人觀點(diǎn)，特此聲明,