《生物化學(xué)考研》PPT課件

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1、第三章 酶學(xué),主要內(nèi)容：介紹酶的概念、作用特點(diǎn)和分類、命名，討論酶的結(jié)構(gòu)特征和催化功能以及酶專一性及高效催化的策略，進(jìn)而討論影響酶作用的主要因素。對(duì)酶工程和酶的應(yīng)用作一般介紹。,,返回,思考,目 錄,,第一節(jié) 酶的概念及作用特點(diǎn) 第二節(jié) 酶的命名和分類 第三節(jié) 酶催化作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和 高效催化的策略 第四節(jié) 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué) 第五節(jié) 重要的酶類及酶活性的調(diào)控 第六節(jié) 酶工程簡(jiǎn)介,第一節(jié) 酶的概念及作用特點(diǎn),一 、酶及生物催化劑概念的發(fā)展,, 極高的催化效率 高度的專一性 易失活 活性可調(diào)控 有些酶需輔助因子,四、 酶專一性類型,二、 酶作用的特點(diǎn),三、 酶的化學(xué)本質(zhì),酶及生物催化劑概念的發(fā)

2、展,,克隆酶、遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶,蛋白質(zhì)類： Enzyme,(天然酶、生物工程酶),核酸類：Ribozyme ; Deoxyribozyme,模擬生物催化劑,,酶專一性類型,1 結(jié)構(gòu)專一性 概念：酶對(duì)所催化的分子（底物，Substrate）化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊要求和選擇 類別：絕對(duì)專一性和相對(duì)專一性 2 立體異構(gòu)專一性 概念：酶除了對(duì)底物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)有要求外，對(duì)其立體異構(gòu)也有一定的要求 類別：旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性,,絕對(duì)專一性和相對(duì)專一性,,,絕對(duì)專一性 有的酶對(duì)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求非常嚴(yán)格，只作用于一種底物，不作用于其它任何物質(zhì)。 相對(duì)專一性 有的酶對(duì)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)要求比

3、上述絕對(duì)專一性略低一些，它們能作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵。 1） 鍵專一性 有的酶只作用于一定的鍵，而對(duì)鍵 兩端的基團(tuán)并無嚴(yán)格要求。 2）基團(tuán)專一性 另一些酶，除要求作用于一定的鍵以外，對(duì)鍵兩端的基團(tuán)還有一定要求，往往是對(duì)其中一個(gè)基團(tuán)要求嚴(yán)格，對(duì)另一個(gè)基團(tuán)則要求不嚴(yán)格。,消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性,,,（芳香）,,,（鹼性）,（丙）,,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,彈性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,,,,,,,,氨肽酶,羧肽酶,消化道蛋白酶作用的專一性,據(jù)酶分子組成分類,單純蛋白質(zhì)酶類,結(jié)合蛋白質(zhì)酶類,酶蛋白質(zhì),輔助因子,金屬離子 金屬有機(jī)物 小分子有機(jī)物,據(jù)酶蛋白特征分類,單體酶 寡聚酶 多

4、酶復(fù)合體,,,,,,酶的化學(xué)本質(zhì)及類別,,,第二節(jié) 酶的命名和分類（略講）,一、 命名：習(xí)慣命名；系統(tǒng)命名 二、 國(guó)際系統(tǒng)分類法及編號(hào) *國(guó)際生物化學(xué)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)（Enzyme Commsion）將酶分成六大類：1.氧還原酶類，2.移換酶類，3.水解酶類，4.裂合酶類，5.異構(gòu)酶類，6.合成酶類 * 每一種酶有一個(gè)編號(hào),如乙醇脫氫酶 EC 1. 1. 1. 27 大類 亞類 亞亞類 序號(hào),,第三節(jié) 酶催化作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和 高效催化的策略,一、 酶催化的中間產(chǎn)物理論 二、 酶的活性中心 三、 酶作用專一性機(jī)理 四、 酶高效催化有關(guān)的策略

5、,,酶催化的中間產(chǎn)物理論,酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個(gè)低活化能的途徑進(jìn)行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。,,二、酶的活性中心,1、酶的活性中心和必需基團(tuán) 酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的區(qū)域叫酶的活性中心（active center）或活性部位（active site），參與構(gòu)成酶的活性中心和維持酶的特定構(gòu)象所必需的基團(tuán)為酶分子的必需基團(tuán)。 實(shí)例；胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 羧肽酶（ribonuclease）,,2、酶的活性的研究 活酶的專一性研究 酶分子的化學(xué)修飾：差示標(biāo)記法，

6、親和標(biāo)記法 X-射線衍射法,Asp,His,Ser,胰凝乳蛋白酶的活性中心,,活性中心重要基團(tuán): His57 , Asp102 , Ser195,,,,,為Tyr 248 為Arg 145 為Glu 270 為底物,,差示標(biāo)記法圖解,,,,,,R,A.非差示標(biāo)記,,B. 差示標(biāo)記,,R,,親和標(biāo)記法,根據(jù)酶與底物特異結(jié)合的性質(zhì)，設(shè)計(jì)或合成一種含有反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物作為活性部位基團(tuán)的標(biāo)記試劑。這種試劑象底物一樣進(jìn)入活性部位，接近結(jié)合位點(diǎn)，并以其活潑的化學(xué)基團(tuán)與活性部位的某一基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，而指示出酶活性部位的特征。,,+,X-Y,,三、酶作用專一性機(jī)理,鎖鑰學(xué)說(lock and key th

7、0ery)：將酶的活性中心比喻作鎖孔，底物分子象鑰匙，底物能專一性地插入到酶的活性中心。 誘導(dǎo)契合學(xué)說(induced-fit hypothesis)：酶的活性中心在結(jié)構(gòu)上具柔性，底物接近活性中心時(shí)，可誘導(dǎo)酶蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，這樣就使使酶活性中心有關(guān)基團(tuán)正確排列和定向，使之與底物成互補(bǔ)形狀有機(jī)的結(jié)合而催化反應(yīng)進(jìn)行。,,,酶專一性的“鎖鑰學(xué)說”,,酶專一性的“誘導(dǎo)契合學(xué)說”,四、酶高效催化的策略,1、 鄰近與定向效應(yīng) 2、 誘導(dǎo)契合與底物扭曲變形 3、 共價(jià)催化 4、 酸鹼催化 5、微環(huán)境影響,,實(shí)例: lysozyme chymotrypsin carboxypeptidas

8、e RNase,,,,,,,酶分子中可作為親核基團(tuán)和酸鹼催化的功能基團(tuán),,Glu270,Tyr248,Arg145,底物,羧肽酶結(jié)合底物前后構(gòu)象變化,,差示標(biāo)記法圖解,,,,,,R,A.非差示標(biāo)記,,B. 差示標(biāo)記,,R,,,溶菌酶催化的反應(yīng),NAG:N-乙酰氨基葡萄糖 NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸,,,,溶菌酶-底物復(fù)合物,,,,,A,,B,C,D,E,F,,酶切位點(diǎn),,溶菌酶活性中心與底物結(jié)合示意圖,,AsP52,Glu35,,（極性區(qū)）,（非極性區(qū)）,溶菌酶底物D環(huán)變形模型,,,溶菌酶催化反應(yīng)機(jī)理,C1+,,,,,,,非極性區(qū),,極性區(qū),,,,HO - E環(huán),,,,,,H,,,H2

9、O,（廣義酸堿催化）,,,,羧肽酶活性中心Zn2+的中心作用,,,羧肽酶活性中心必需基團(tuán)與底物間的結(jié)合,羧肽酶結(jié)合底物前后構(gòu)象變化,,羧肽酶活性中心的共價(jià)催化機(jī)理,,,羧肽酶活性中心的共價(jià)催化機(jī)理,,,,,RNase-底物復(fù)合物,,,RNase活性中心的酸鹼催化機(jī)理,,,核糖核酸鏈?zhǔn)躌nase水解的位點(diǎn),Py為嘧啶，B為嘌呤,,胰凝乳蛋白酶分子中催化三聯(lián)體構(gòu)象,,,胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制（1）,,,,,,結(jié)合底物,His57 質(zhì)子供體,形成共價(jià)ES復(fù)合物,C-N鍵斷裂,底物,胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制（2）,,,,,氨基產(chǎn)物釋放,四面體中間物的瓦解,水親核攻擊,,羧基產(chǎn)物釋放,,H2O,,

10、R-NH2,第四節(jié) 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué),二、影響酶作用的因素 1、酶濃度 2、底物濃度 3、pH 4、 溫度 5、激活劑 6、抑制劑,,一、酶的活力與測(cè)定,酶促反應(yīng)速度的測(cè)定與酶的活力單位,1、酶促反應(yīng)速度的測(cè)定 初速度的概念 2、酶活力,,3、酶活力的表示方法 4、酶活力測(cè)定方法：終點(diǎn)法 動(dòng)力學(xué)法,檢測(cè)酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、 濃度）來表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。,酶促反應(yīng)初速度的概念,,酶活力測(cè)定方法,終點(diǎn)法: 酶反應(yīng)進(jìn)行到一

11、定時(shí)間后終止其反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。 動(dòng)力學(xué)法:連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過程中產(chǎn)物底物或輔酶的變化量，直接測(cè)定出酶反應(yīng)的初速度。,,酶活力的表示方法,活力單位（active unit） 習(xí)慣單位（U）: 底物(或產(chǎn)物)變化量 / 單位時(shí)間 國(guó)際單位（IU）: 1moL變化量 / 分鐘 Katal（Kat）：1moL變化量 / 秒,,轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每個(gè)酶分子,比活力（specific activity）,2、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線 （MichaelisMenten曲線） 米氏方程的提出及推導(dǎo) 米氏

12、常數(shù)的意義 米氏常數(shù)的測(cè)定,,單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km,推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照 “穩(wěn)態(tài)平 衡”假說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。,,米氏方程:,米氏常數(shù):,,酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線,米氏方程的推導(dǎo),令：,將（4）代入（3），則：,,ES生成速度：,，ES分解速度：,即：,則：,由于酶促反應(yīng)速度由ES決定，即,將（2）代入（1）得：,(3),當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：,當(dāng)Et=ES時(shí)，,,米氏常數(shù)的意義,* 當(dāng)v=Vmax/2時(shí)，Km=S（ Km的單位為濃度單位） * 是酶在一定條件下的特征物理常數(shù)，通過測(cè)定Km的數(shù)值，可鑒別酶。 * 可近似表示酶和底物親合力，Km愈

13、小，E對(duì)S的親合力愈大，Km愈大，E對(duì)S的親合力愈小。 在已知Km的情況下，應(yīng)用米氏方程可計(jì)算任意s時(shí)的v，或任何v下的s。（用Km的倍數(shù)表示） 練習(xí)題：已知某酶的Km值為0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的80時(shí)底物的濃度應(yīng)為多少？,,米氏常數(shù)的測(cè)定,基本原則：將米氏方程變化成相當(dāng)于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。 例：雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法） 米氏方程的雙倒數(shù)形式：,,1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,,酶動(dòng)力學(xué)的雙倒數(shù)圖線,3、pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,,過酸

14、過鹼導(dǎo)致酶蛋白變性 影響底物分子解離狀態(tài) 影響酶分子解離狀態(tài) 影響酶的活性中心構(gòu)象,pH,最適 pH,v,,,,,4、溫度與酶反應(yīng)速度的關(guān)系, 在達(dá)到最適溫度以前，反應(yīng)速度隨溫度升高而加快 酶是蛋白質(zhì)，其變性速度亦隨溫度上升而加快 酶的最適溫度不是一個(gè)固定不變的常數(shù),v,,,溫度,5、激活劑對(duì)酶作用的影響,類別 金屬離子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 陰離子： Cl-、Br- 有機(jī)分子 還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金屬螯合劑：EDTA,,凡是能提高酶活性的物質(zhì)，稱為酶的激活劑（activator）

15、,6、抑制劑對(duì)酶作用的影響,凡是使酶的必需基因或酶的活性部位中的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，叫酶的抑制劑（inhibitor） 。 類型：可逆抑制劑 不可逆抑制劑 應(yīng)用：研制殺蟲劑、藥物 研究酶的作用機(jī)理，確定代謝途徑,,抑制劑類型和特點(diǎn),競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 可逆抑制劑 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,,非專一性不可逆抑制劑 不可逆抑制劑 專一性不可逆抑制劑,,,,,,+ I,EI,ES,P+ E,E+S,競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,,非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,,+ I,EI+S,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,實(shí)例：重金屬離子（C

16、u2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金屬絡(luò)合劑（EDTA、F-、CN-、N3-）,反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,,,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,,競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用機(jī)理示意圖,,競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線,非競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線,,反競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線,,有無抑制劑存在時(shí)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程,,非專一性不可逆抑制劑,抑制劑作用于酶分子中的一類或幾類基團(tuán)，這些基團(tuán)中包含了必需基團(tuán)，因而引起酶失活。,,類型：,專一性不可逆抑制劑,這類抑制劑選擇性很強(qiáng)，它只能專一性地與酶活性中心的某些基團(tuán)不可逆結(jié)合，引起酶的活性喪失。 實(shí)例：有機(jī)磷殺蟲劑,-Ser-OH,,,第五節(jié) 重要的酶類及酶活性的調(diào)節(jié)控制,一、多酶體

17、系(multienzyme system) 二、別構(gòu)酶(allosteric enzyme) 三、共價(jià)調(diào)節(jié)酶(covalent regulatory enzyme) 四、酶原(enzymogen或proenzyme)的激活 五、同工酶(isoenzyme) 六、抗體酶(abzyme),,一、多酶體系和多酶復(fù)合體,,細(xì)胞中的許多酶常常是在一個(gè)連續(xù)的反應(yīng)鏈中起作用，即前一個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物是后一個(gè)反應(yīng)的底物，在完整細(xì)胞內(nèi)的某一代謝過程中，由幾個(gè)酶形成的反應(yīng)體系，稱為多酶體系（multienzyme system）。 如果體系中幾種酶彼此有機(jī)地組合在一起。精巧地鑲嵌成一定的結(jié)構(gòu)，即形成多酶復(fù)合體。這種結(jié)

18、構(gòu)即能提高反應(yīng)途徑的效率，又能增強(qiáng)調(diào)控的準(zhǔn)確性。,分散多酶體系與中間物示意圖,多酶復(fù)合體示意圖,二、酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)和別構(gòu)酶,概念：酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價(jià)結(jié)合后導(dǎo)致酶分子發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而改變酶的活性狀態(tài)，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)(allosteric regulation)，具有這種調(diào)節(jié)作用的酶稱別構(gòu)酶(allosteric enzyme)。別構(gòu)酶促反應(yīng)底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系不符合米氏方程，呈S型曲線。 凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為效應(yīng)物(effector)，通常為小分子代謝物或輔因子。如因別構(gòu)導(dǎo)致酶活性增加的物質(zhì)稱為正效應(yīng)物(positive effector)或

19、別構(gòu)激活劑，反之稱負(fù)效應(yīng)物(negative effector)或別構(gòu)抑制劑。 別構(gòu)調(diào)節(jié)普遍存在于生物界，許多代謝途徑的關(guān)鍵酶利用別構(gòu)調(diào)節(jié)來控制代謝途徑之間的平衡，研究別構(gòu)調(diào)控有重要的生物學(xué)意義。 實(shí)例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 （anspartate transcarbamoylase，ATCase） 別構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)機(jī)理：序變模型和齊變模型,,酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)示意圖,別構(gòu)酶的反饋調(diào)控機(jī)理,,別構(gòu)酶與米氏酶的動(dòng)力學(xué)曲線比較,,正、負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶與非調(diào)節(jié)酶的動(dòng)力學(xué)曲線比較,,,,ATCase,ATCase所催化的反應(yīng),氨甲酰磷酸,天冬氨酸,氨甲酰天冬氨酸,,E.coli的ATCase的亞基排

20、列,催化(C)亞基（catalytic subunit）,調(diào)節(jié)(R)亞基（ regulative subunit）,,,,,,ATCase的半分子結(jié)構(gòu),ATCase半分子（C3R3)的結(jié)構(gòu),,,CTP site,,catalytic site,,,,ATCase alone,ATCase -PALA complex,,,ATCase的別構(gòu)過度作用,PALA,,,PALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)結(jié)合到ATCase活性中心的模型,,ATCase變構(gòu)效應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征,,,,Vmax,1/2Vmax,Km,,別構(gòu)酶的序變模型,,別構(gòu)酶的齊變模型,,,三、酶的共價(jià)修飾,某些酶可以通過其它酶對(duì)其多肽鏈

21、上某些基團(tuán)進(jìn)行可逆的共價(jià)修飾，使其處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶活性。這類酶稱為共價(jià)修飾酶。目前發(fā)現(xiàn)有數(shù)百種酶被翻譯后都要進(jìn)行共價(jià)修飾，其中一部分處于分支代謝途徑，成為對(duì)代謝流量起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶或限速酶。 由于這種調(diào)節(jié)的生理意義廣泛，反應(yīng)靈敏，節(jié)約能量，機(jī)制多樣，在體內(nèi)顯得十分靈活，加之它們常受激素甚至神經(jīng)的指令，導(dǎo)致級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，所以日益引人注目。,,A,,P1,G,E,D,C,B,,H,,,,,,,Ea-b,Ec-d,Ec-g,關(guān)鍵酶（限速酶）,,,,P2,蛋白質(zhì)的磷酸化和脫磷酸化,第一類：Ser/Thr型 第二類：Tyr型,第一類：Ser/Thr型 第二類：Tyr型 第三類：

22、雙重底物型,,,反應(yīng)類型 共價(jià)修飾 被修飾的氨基酸殘基,,,,,共價(jià)修飾反應(yīng)的例子,,,磷酸化,腺苷?；?尿苷?；?,,Tyr,Ser,Thr.His,Tyr,Tyr,,甲基化,,Glu,,S-腺苷-Met,S-腺苷-同型 Cys,,級(jí)聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控糖原分解示意圖,意義：由于酶的共價(jià)修飾反應(yīng)是酶促反應(yīng)，只要有少量信號(hào)分子（如激素）存在，即可通過加速這種酶促反應(yīng)，而使大量的另一種酶發(fā)生化學(xué)修飾，從而獲得放大效應(yīng)。這種調(diào)節(jié)方式快速、效率極高。,腎上腺素或胰高血糖素,1、腺苷酸環(huán)化酶（無活性）,腺苷酸環(huán)化酶（活性）,2、ATP,cAMP,R、cAMP,3、蛋白激酶（無活性）,

23、蛋白激酶（活性）,4、磷酸化酶激酶（無活性）,磷酸化酶激酶（活性）,5、磷酸化酶 b（無活性）,磷酸化酶 a（活性）,6、糖原,6-磷酸葡萄糖,1-磷酸葡萄糖,葡萄糖,血液,,,,,,,,,,,,（極微量）,（大量）,四、酶 原 的 激 活,體內(nèi)合成出來的酶，有時(shí)不具有生物活性，經(jīng)過蛋白水解酶專一作用后，構(gòu)象發(fā)生變化，形成活性中心，變成有活性的酶。這個(gè)不具活性的蛋白質(zhì)稱為酶原（zymogen或proenzyme），這個(gè)過程稱為酶原的激活。 該變化過程，是生物體的一種調(diào)控機(jī)制 。這種調(diào)控作用的特點(diǎn)是，蛋白質(zhì)由 無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變成活性狀態(tài)是不可逆的。 實(shí)例：消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活 凝血機(jī)制（自

24、學(xué)）,,,,,,,,,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,腸激酶,活性中心,胰蛋白酶原的激活示意圖,,,,,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,腸激酶,胰蛋白酶對(duì)各種胰臟蛋白酶的激活作用,,,五、酶的多種分子形式同工酶,概念：存在于同一種屬或不同種屬，同一個(gè)體的不同組織或同一組織、同一細(xì)胞，具有不同分子形式但卻能催化相同的化學(xué)反應(yīng)的一組酶，稱之為同工酶（isoenzyme）。乳酸脫氫酶是研究的最多的同工酶。 生物學(xué)功能：遺傳的標(biāo)志 和個(gè)體發(fā)育及組織分化密切相關(guān) 適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要 在各學(xué)科中的應(yīng)用,,乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖,多肽,亞基,mRNA,,,

25、,,,,,,,,,,四聚體,,,,,,,結(jié)構(gòu)基因,a b,,不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜,,,,,,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,腸激酶,胰蛋白酶對(duì)各種胰臟蛋白酶的激活作用,,,同工酶在各學(xué)科中的應(yīng)用,(1) 遺傳學(xué)和分類學(xué)：提供了一種精良的判別遺傳標(biāo)志的工具。,,(2) 發(fā)育學(xué)：有效地標(biāo)志細(xì)胞類型及細(xì)胞在不同條件下的分化情況，以及個(gè)體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系。,(3) 生物化學(xué)和生理學(xué)：根據(jù)不同器官組織中同工酶的動(dòng)力學(xué)、底物專一性、輔助因子專一性、酶的變構(gòu)性等性質(zhì)的差異，從而解釋它們代謝功能的差別。,（4）醫(yī)學(xué)和臨床診斷：體內(nèi)同工酶的變化，可看作機(jī)體組織損傷，或遺傳缺陷，或腫瘤分

26、化的的分子標(biāo)志。,六、抗體酶,抗體酶（abzyme）又稱催化抗體（catalytic antibody）,是指通過一系列化學(xué)與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學(xué)性質(zhì)，還類似于酶，能催化某種活化反應(yīng)。 抗體與酶相似，都是蛋白質(zhì)分子，酶與底物的結(jié)合及抗體與抗原的結(jié)合都是高度專一性的，但這兩種結(jié)合的基本區(qū)別在于酶與高能的過度態(tài)分子向結(jié)合，而抗體則與抗原（基態(tài)分子）相結(jié)合。利用抗體能與抗原特異結(jié)合的原理可用過度態(tài)類似物作為半抗原來誘發(fā)抗體，這樣產(chǎn)生的抗體便能特異地識(shí)別反應(yīng)過程中真正的過渡分子，從而降低反應(yīng)的活化能。達(dá)到催化反應(yīng)的目的，這種具有催化功能的抗體就被稱為催化抗體

27、或抗體酶。,,,B.酯的羧基碳原子受到親核攻擊形成四面體過渡態(tài),C.設(shè)計(jì)的磷酸酯類似物,作為抗原去免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,磷酸酯類似物(半抗原),對(duì)酯水解反應(yīng)有催化作用的單克隆抗體,,免疫,免疫反應(yīng),誘導(dǎo)法制備具有酯酶活性的抗體,,,,基因工程抗體酶的制備,對(duì)已產(chǎn)生的單抗，分析氨基酸的組成或相應(yīng)基因的堿基序列，對(duì)抗體結(jié)合的部位的基因進(jìn)行定位突變，在抗體結(jié)合部位換上有催化活性的氨基酸，基因工程的技術(shù)使得建立抗體基因的組合文庫(kù)，并根據(jù)需要構(gòu)建適當(dāng)程序的基因片段成為可能。,,抗體酶的篩選,在抗體酶研究中，一個(gè)不可少的步驟是在細(xì)胞融合后篩選到能分泌催化抗體的細(xì)胞克隆。一般的方法是先篩選其抗體能結(jié)合特異抗原的細(xì)胞

28、克隆，再?gòu)募兓目贵w中篩選出有催化能力的單抗。主要篩選方法有生物學(xué)篩選法和純化學(xué)篩選法。,,抗體酶的研究和應(yīng)用前景,催化抗體的出現(xiàn)不僅為人們開創(chuàng)了一條人工設(shè)計(jì)酶的新方法，也使人們對(duì)催化過程中催化劑的作用機(jī)理和催化劑和底物的相互識(shí)別有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有催化作用的自身抗體在生物體內(nèi)的存在，其不僅和疾病相關(guān)，可能還參與了生物體內(nèi)的某些或基本的生物學(xué)反應(yīng)。有可能成為抗體酶研究的新熱點(diǎn)。 充分利用抗體的種類繁多以及抗體酶的可誘導(dǎo)、可改造的特點(diǎn)，可望制備出具有治療和輔助治療某些疾病或催化某類具有特殊意義反應(yīng)的抗體酶。 抗體酶的研究無疑會(huì)對(duì)化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。,,第六節(jié)

29、 酶工程簡(jiǎn)介,一、化學(xué)酶工程 天然酶 固定化酶 化學(xué)修飾酶 人工模擬酶 二、生物酶工程 克隆酶 突變酶 新酶,,將酶學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合，產(chǎn)生了酶工程(enzyme engineering)這樣一個(gè)新的領(lǐng)域。酶工程主要研究酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造以及在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和理論研究等方面的應(yīng)用。,固定化酶,將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理，固定于高分子支持物(或載體)上而成為不溶于水，但仍有酶活性的一種酶制劑形式，稱固定化酶(immobilized enzyme)。,,共價(jià)偶聯(lián)法,交聯(lián)法,溴化氰亞氨碳酸基偶聯(lián)法,OH,OH,,,,BrCN,H2O,,,,,

30、,,O,O,,,C=N-E,,O-CO-NH-E,,,,OH,,O-C-NH-E NH,,,,OH,H2N-E,（多羥基載體）,O-CONH2,,,,OH,,（惰性）,,,,O,O,,,C=NH,（活潑）,,,OC N,,,,OH,戊二醛交聯(lián)法,H2N-E,,,酶的改造和模擬,酶的改造：功能基團(tuán)的化學(xué)修飾酶 酶蛋白側(cè)鏈的化學(xué)修飾 酶分子內(nèi)或間的交聯(lián)反應(yīng) 酶的模擬：根據(jù)酶作用的原理摸擬酶的活性中心和催化機(jī)理，用化學(xué)方法制備結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單,高效、高選擇性、穩(wěn)定性能好的新型催化劑,可以是無機(jī)化合物、有機(jī)化合物或小肽。,,人工模擬酶-benzyme,,環(huán)糊精,,催化側(cè)鏈,催化側(cè)鏈連接到環(huán)糊精上，

31、可模擬胰凝乳蛋白酶,生物酶工程示意圖,,酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能,新酶分子藍(lán)圖,選擇性修飾方案,突變酶,新酶,克隆酶,產(chǎn)品,效用,發(fā)展,酶基因,遺傳設(shè)計(jì),遺傳修飾,DNA重組技術(shù),DNA重組技術(shù),問答題,,1、影響酶促反應(yīng)的因素有哪些？它們是如何影響的？ 2、試比較酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的異同。 3、什么是米氏方程，米氏常數(shù)Km的意義是什么？試求酶反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的99時(shí)，所需求的底物濃度（用Km表示） 4、什麼是同工酶？為什麼可以用電泳法對(duì)同工酶進(jìn)行分離？同工酶在科學(xué)研究和實(shí)踐中有何應(yīng)用？ 5、舉例說明酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系。 6、稱取25毫克某蛋白酶制劑配成25毫升溶液，取出1毫升該酶液以酪蛋白為底物,用Folin-酚比色法測(cè)定酶活力,得知每小時(shí)產(chǎn)生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凱式定氮法測(cè)得蛋白氮為0.2毫克。若以每分鐘產(chǎn)生1微克酪氨酸的酶量為一個(gè)活力單位計(jì)算，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，求出（1）1毫升酶液中含有的蛋白質(zhì)和酶活力單位數(shù)；（2）該酶制劑的比活力；（3）1克酶制劑的總蛋白含量和酶活力單位數(shù)。 名詞解釋 活性中心 全酶 酶原 活力單位 比活力 米氏方程 Km 誘導(dǎo)契合變構(gòu)效應(yīng) ribozyme 輔酶和輔基 固定化酶,