食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測定（征求意見稿） 編制說明

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附件2 廣西食品安全地方標準 食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測定（征求意見稿） 編制說明 目　錄 一、工作簡況 3 （一）任務來源與合同編號、起草單位、主要起草人 3 （二）簡要起草過程 4 二、與我國、我區(qū)有關法律法規(guī)和其他標準情況的關系 4 三、標準制定必要性、目的及意義情況說明 5 四、標準的制訂原則 5 五、各項技術內(nèi)容的驗證及說明 6 1 目標化合物的物理和化學性質(zhì) 6 1.1 鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì) 6 1.2 鉤吻堿和鉤吻堿子的應用 6 1.3 鉤吻堿和鉤吻堿子的毒理作用 7 2 標準溶液的配制及有效期驗證 8 2.1 標準品信息 8 2.2 標準溶液的配制 8 2.3 標準溶液有效期驗證 8 3本標準的檢測范圍及本方法檢測原理的說明 9 3.1 檢測范圍 9 3.2 方法檢測原理 9 4 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（方法一） 10 4.1 質(zhì)譜測定條件 10 4.2 液相測定條件 12 4.3 前處理方法優(yōu)化 14 4.4 精密度試驗 15 4.5 基質(zhì)效應考察 16 4.6 標準曲線 17 4.7 重復性試驗 18 4.8 回收率試驗 19 4.9 檢測方法的檢出限、定量限 20 5 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法（方法二） 20 5.1 質(zhì)譜測定條件 20 5.2 氣相測定條件 21 5.3 前處理方法優(yōu)化 22 5.4 精密度試驗 23 5.5 基質(zhì)效應考察 23 5.6 標準曲線 24 5.7 重復性試驗 25 5.8 回收率試驗 27 5.9 檢測方法的檢出限、定量限 27 6 高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法（方法三） 28 6.1 質(zhì)譜測定條件 28 6.2 液相測定條件 29 6.3 前處理方法 31 6.4 檢測方法的靈敏度和專屬性 31 一、工作簡況 （一）任務來源與合同編號、起草單位、主要起草人 本檢測方法標準的制訂工作，是受廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會委托，由梧州市食品藥品檢驗所負責研制，合同編號為桂地標食2019005。 標準主要起草單位為梧州市食品藥品檢驗所。主要起草人為：羅達龍、陳學松、劉慧妍、黃蘅、葉小強、賴秀梅、王華、陳翠玲、姚泳成、鐘家良，詳見表1。 表1 參加標準項目人員情況 研制 人員 姓名 性別 年齡 職稱 職務 研究方向 單位 投入 時間 項目 負責人 羅達龍 男 36 副主任藥師 業(yè)務科主任兼科研管科主任 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 主要 參加 人員 陳學松 男 46 主任藥師 所長 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 劉慧妍 女 37 副主任藥師 食品室主任 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 黃蘅 女 47 副主任藥師 副所長 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 葉小強 男 56 副主任藥師 副所長 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 賴秀梅 女 37 主管藥師 藥品室主任 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 王華 男 26 主管藥師 檢驗員 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 陳翠玲 女 32 中藥師 檢驗員 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 姚泳成 男 28 藥師 檢驗員 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 鐘家良 男 25 藥師 檢驗員 食品藥品檢驗 梧州市食品藥品檢驗所 整個研究過程 （二）簡要起草過程 梧州市食品藥品檢驗所接受制訂任務后，成立由實驗室專業(yè)技術人員組成的研制小組，全面負責標準的研制計劃和工作安排。主要成員由正高1人，副高4人，中級職稱2人，初級職稱3人，共10人組成。制訂本標準主要依據(jù)《中華人民共和國標準化法》，GB/T 1.1-2009《標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫》、GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》等標準或規(guī)范。制標小組為做好標準的制定工作，廣泛收集國內(nèi)外有關的檢測技術資料、檢測標準、限量指標，以及相關的法律、法規(guī)，召開了有關座談會，聽取各方建議。在研制過程中，遵循科學性、實用性和前瞻性等原則，尊重客觀規(guī)律，融合科學理論和標準化方法?？紤]到我國食品衛(wèi)生標準分析方法應逐步與國際接軌，以及分析方法應有較強的可操作性的要求，確定了標準制定的關鍵環(huán)節(jié)，對本項目作了以下主要制訂：（1）確定了檢測項目為食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測定；（2）制定了檢測方法為方法一：高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法、方法二：氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、方法三：高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法；（3）規(guī)定了檢測對象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測定，其它基質(zhì)食品可參照執(zhí)行。 2、 與我國、我區(qū)有關法律法規(guī)和其他標準情況的關系 新制地方標準與相關法律、法規(guī)及相關標準協(xié)調(diào)一致，沒有沖突。 第1， 新制地方標準的檢測項目為食品中鉤吻堿和鉤吻堿子，國內(nèi)對于食品中鉤吻堿類生物堿中毒的應急檢測仍未有相關的技術標準和檢測方法。 第2， 新制地方標準的檢測范圍較寬。新制地方標準檢測對象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測定，其它基質(zhì)食品可參照執(zhí)行。 第三，新制地方標準的靈敏度、準確度和精密度較優(yōu)。新制地方標準的靈敏度、準確度和精密度等相關指標滿足國家標準GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中的規(guī)定。 第四，新制地方標準采用固相萃取凈化方法，運用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進行定性和定量測定，用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進行篩查和定性確證。 三、標準制定必要性、目的及意義情況說明 鉤吻堿類生物堿主要存在于馬錢科植物胡蔓藤Gelsemium elegans(Gardn.et Champ.)Benth.中，習稱斷腸草，民間有用藥史，一般用于跌打損傷，骨折，皮膚濕疹等，因其有大毒，一般外用，誤服能致命。2015-2016 年梧州地區(qū)共發(fā)生2 起因誤食鉤吻（斷腸草）引起的生物堿中毒事件，造成6人中毒1人死亡。查閱文獻，報道國內(nèi)廣東茂名市公安局早期曾發(fā)表過《鉤吻堿中毒40例尸檢分析》的文章，文章稱其中利用鉤吻投毒致死15人、服鉤吻自殺20人、為治病服藥5人，由此可見因誤食鉤吻導致中毒或死亡的案例時有發(fā)生。 梧州市食品藥品檢驗所作為梧州市食品安全委員會辦公室成員中唯一應急檢驗單位，近四年參與的轄區(qū)內(nèi)應急檢驗，確證兩例共29批樣品含鉤吻成分，應急處理中發(fā)現(xiàn)國標和地標均未有相關的食品鉤吻中毒的檢測標準，故很有必要在食品中毒領域上找到可行、規(guī)范、準確的質(zhì)量檢測技術，為食品中毒鉤吻的應急處理提供一個依據(jù)和對中毒物質(zhì)的定性定量做出準確的判斷，由于鉤吻中含有特征性成分──鉤吻堿和鉤吻堿子，故本研究對食品中鉤吻堿和鉤吻堿子運用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進行定性和定量測定，并以高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對疑似鉤吻中毒的樣品進行篩查和定性確證。建立檢測法，制定明確標準，為中毒分析檢驗提供法定依據(jù)，為人員搶救搶占時間。為醫(yī)院的后續(xù)治療處理或中毒物質(zhì)分析提供有效準確的數(shù)據(jù)支持。 四、標準的制訂原則 本標準的制定和起草工作遵循統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性。第一，本標準為現(xiàn)有檢測食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的唯一標準。第二，方法確認和驗證嚴謹、全面，適用性強。本標準選擇了蜂蜜、酒、保健湯（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液）作為試樣進行方法確認，覆蓋鉤吻中毒事件中常見的食品。第三，標準按照國家標準GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中的規(guī)定，要求進行制定，具有一致性和規(guī)范性。 五、各項技術內(nèi)容的驗證及說明 1 目標化合物的物理和化學性質(zhì) 1.1 鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì) 鉤吻堿和鉤吻堿子詳見表1-1 表1-1鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì) 名稱 鉤吻堿 鉤吻堿子 別稱 鉤吻素甲 鉤吻素子 英文名稱 Gelsemine Koumine 密度 1.33 g/cm3 1.330.1 g/cm3 沸點 493.4C at 760 mmHg 493.4C at 760 mmHg 熔點 178C 181-183C 分子式 C20H22N2O2 C20H22N2O 分子量 322.4 306.4 CAS號 509-15-9 1358-76-5 精確分子量 322.1681 306.1732 儲存條件 應放有毒有害保險箱常溫保存 應放有毒有害保險箱常溫保存 分子結構式 1.2鉤吻堿和鉤吻堿子的應用 1.2.1鉤吻堿應用 文獻記載鉤吻堿是治療部分坐骨神經(jīng)結扎（PSNL）小鼠的神經(jīng)性疼痛和睡眠障礙的有效藥物。鉤吻堿（4 mg / kg）對PSNL誘導的機械異常性疼痛和熱痛覺過敏產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在PSNL小鼠中，鉤吻堿（4mg / kg）使機械閾值增加4小時并延長熱潛伏期3小時。此外，鉤吻堿能增加非快速眼動（非REM，NREM）睡眠，減少覺醒，但在前3小時內(nèi)不影響快速眼動（REM）睡眠在PSNL小鼠。免疫組織化學研究表明，PSNL可增加前扣帶皮層神經(jīng)元中c-Fos的表達，而鉤吻堿（4 mg / kg）可使c-Fos表達降低58％。具有興奮中樞神經(jīng)作用，由于毒性很大，很少作藥用。 1.2.2鉤吻堿子應用 鉤吻堿子是從鉤吻中得到的生物堿，具有高效抗腫瘤活性，在腫瘤細胞中能夠增加Bax/Bcl-2 的蛋白比例和 caspase-3 的表達。鉤吻堿子具有抗焦慮、抗應激、抗銀屑病和鎮(zhèn)痛活性。在類風濕性關節(jié)炎動物模型中，鉤吻堿子能夠預防關節(jié)炎的發(fā)展。 1.3鉤吻堿和鉤吻堿子的毒理作用 1.3.1鉤吻堿 主要抑制延腦的呼吸中樞，引起呼吸中樞麻痹，呼吸衰竭而死亡，同時作用于迷走神經(jīng)和心肌，引起血液循環(huán)障礙，從而加劇了肝、腎等臟器的損害。 1.3.2鉤吻堿子 毒理作用與鉤吻堿相似。 1.3.3鉤吻生物堿的危害 鉤吻常見于廣東、廣西、貴州等地區(qū)，由于其型與金銀花相似，導致民間多見誤食鉤吻而導致鉤吻中毒，中毒患者多見為飲用含鉤吻中藥材的自釀中藥藥酒而導致中毒，或誤把鉤吻當做藥用食材用于烹飪方面。鉤吻全株都有大毒，根、莖、枝、葉含有8種鉤吻生物堿，而當中鉤吻堿和鉤吻堿子是毒理研究最多的成分，也是鉤吻的最具代表性成分。服食鉤吻堿過量，即導致消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的強烈反應，腸發(fā)黑粘連。中毒癥狀包括流涎、惡心、口渴、吞咽困難、發(fā)熱、嘔吐、口吐白沫、抽搐、四肢麻木、肌肉無力、肌肉纖維顫動、舌硬、言語不清、煩躁不安、心律失常等。 1.3.4 鉤吻的小鼠半數(shù)致死量 洪息君、陸文光等在《斷腸草不同部位毒性的研究》中指出用鉤吻植物的不同部位以1:10的煎劑來測定小鼠的半數(shù)致死量（LD50）植物中各部位的LD50分別為：鉤吻根0.0798g /kg，老莖1.309 g/kg，嫩莖1.830 g/kg，葉0.255 g/kg，花0.458 g/kg，果實1.275 g/kg。據(jù)相關文獻報道鉤吻根3g左右或嫩芽7個，或流浸膏3.5mL，或鉤吻堿0.15～0.3g經(jīng)口攝入可使人致死。鉤吻堿攝入量在0.15～0.3g，人體即有中毒跡象。 張永志、何宏源等在《鉤吻素甲對小鼠的急性毒性實驗研究》中指出使用鉤吻堿灌胃的小鼠30分鐘內(nèi)半數(shù)致死濃度為78.23mg/kg，95%置信區(qū)間69.75~87.75mg/kg，而使用51.2mg/kg濃度灌胃的小鼠30分鐘內(nèi)小鼠無死亡，并且較低濃度的鉤吻堿子（10mg/kg）亦對小鼠具有抗焦慮的治療作用，說明低劑量的鉤吻堿與鉤吻堿子對機體基本無毒性影響。 2 標準溶液的配制及有效期驗證 2.1 標準品信息 鉤吻堿和鉤吻堿子標準品均購自中國廣州分析測試中心，詳見表2-1 表2-1 鉤吻堿、鉤吻堿子標準品信息 名稱 別稱 貨號 狀態(tài) 純度 劑型劑量 生產(chǎn)單位 鉤吻堿 鉤吻素甲 NACC60513 粉末 ≥98% 20mg/瓶 中國廣州分析測試中心 鉤吻堿子 鉤吻素子 NACC60512 粉末 ≥98% 20mg/瓶 中國廣州分析測試中心 2.2 標準溶液的配制 2.2.1標準儲備液（1mg/mL） 分別精密稱取鉤吻堿、鉤吻堿子標準品各10 mg，用甲醇溶解并稀釋至10mL，搖勻，制成濃度為1mg/mL標準儲備液。-20 ℃避光貯存，有效期6個月。 2.2.2混合標準中間工作溶液（1 g/mL） 分別準確吸取標準儲備液（1mg/mL）（2.2.1）各0.10 mL，用甲醇稀釋至100mL，搖勻，制成1 μg/mL的混合標準中間工作液。 2.2.3混合標準工作溶液 分別準確吸取混合標準中間工作液（1 g/mL）（2.2.2）適量，用甲醇稀釋，搖勻，作為系列混合標準工作溶液，各化合物濃度依次為1 g/L～200 g/L，臨用新制或依儀器響應情況配制適當濃度的混合標準工作溶液。 2.3 標準溶液有效期驗證 分別取適量標準品粉末（對照組）、儲存時間為1個月的標準儲備液（含單標和混標）和儲存時間為6個月的標準儲備液（含單標和混標），分別按“2.2”的方法配制成10g/L標準工作液，每個組設置3個平行。在相同條件下同時進樣檢測，每組單標和每組混標均檢測鉤吻堿、鉤吻堿子。 分析比較不同儲存時間的每種單標同時檢測兩種化合物的峰面積結果。該結果提示鉤吻堿、鉤吻堿子在正常儲存條件下穩(wěn)定，配制成混合標準溶液不影響定量。 分析比較不同儲存時間的標準混合液檢測兩種化合物的峰面積結果，詳見表2-2，存儲1個月和6個月的各個化合物的峰面積與對照組的峰面積比較，均沒有顯著性差異（p > 0.05）。結果表明鉤吻堿、鉤吻堿子可以穩(wěn)定儲存于甲醇等介質(zhì)中，高濃度的儲備液有效期至少為6個月，標準中間液有效期至少為1個月。 表2-2 不同儲存時間的標準混合液檢測結果 儲存時間 對照組 1個月 6個月 化合物名稱 Area 1 Area 2 Area 3 Area 1 Area 2 Area 3 P值 Area 1 Area 2 Area 3 P值 鉤吻堿 28789 29547 31201 31001 31520 30411 0.221 30141 29898 30112 0.789 鉤吻堿子 30259 31544 32211 30443 29201 31985 0.466 29210 29985 32144 0.443 3本標準的檢測范圍及本方法檢測原理的說明 3.1 檢測范圍 3.1.1 酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)的選取 2015年，在梧州地區(qū)發(fā)生一起農(nóng)民工中毒事件，通過檢測現(xiàn)場收集疑似引起中毒材料，包括鉤吻植物、鉤吻植物泡制的酒、以及中毒時農(nóng)民工所飲用的用鉤吻作為食材煮的“保健湯”，最終確認為鉤吻中毒，據(jù)相關人員反饋，農(nóng)民工在山上采集的“鉤吻”植物誤認為雞血藤，繼而通過泡酒，煲湯，以想達到活血補血，舒筋活絡等功效，但由于植物鑒定知識和技能限制，誤認植物而引起了食物中毒。而鉤吻最長用的誤服途徑為泡酒和煲湯，所以本標準選取了酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)為主要研究對象。 3.1.2 蜂蜜基質(zhì)的選取 2016年，在梧州地區(qū)也發(fā)生一起食品中毒事件，經(jīng)過檢測與有關部門的調(diào)查，其中毒樣品為野生蜂蜜，蜜蜂經(jīng)采集蜂巢附近的鉤吻花蜜回巢形成了有毒蜂蜜，從而引起采集野生蜂蜜中毒事件，故本標準也選取了蜂蜜基質(zhì)作為主要研究對象。 由于近年來，我們接收到的案件樣品有蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)等。規(guī)定了檢測對象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測定，其它基質(zhì)食品可參照執(zhí)行。 3.2 方法檢測原理 由于鉤吻含鉤吻堿、鉤吻堿子等生物堿，其可在酸性條件下形成非離子狀態(tài)，更容易溶解于水中，繼而經(jīng)過與強陽離子交換反相吸附劑固相萃取柱的作用吸附，用水與有機相淋洗除去雜質(zhì)后，用堿性溶液洗脫，收集洗脫液，達到凈化的作用。 由于高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為實驗室常配儀器，故本標準還采用了高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分別作為方法一和方法二使用，根據(jù)歐盟委員會2002/ 657/ EC 決議的“四分法原則”，高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法選取一個母離子和兩個子離子可得到較好的定性，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選取四個特征離子也可得到較好的定性，同時該兩個方法也是常用的定量方法，經(jīng)方法適用性考察后，兩個方法的定性與定量效果也能滿足日常使用要求，且兩個方法的檢出限與定量限設定遠低于鉤吻堿和鉤吻堿子的經(jīng)口攝入中毒劑量，能滿足食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的常量與痕量分析。 由于高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜可得到目標物的準確分子量，根據(jù)歐盟委員會2002/ 657/ EC 決議的“四分法原則”，只需有2個準確分子匹配，即可快速、準確的定性，故本標準方法三僅作為定性方法。 經(jīng)優(yōu)化，本標準選用試樣經(jīng)1%鹽酸超聲提取，經(jīng)MCX柱凈化后，運用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進行定性和定量測定，用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進行篩查和定性確證。 4 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（方法一） 4.1 質(zhì)譜測定條件 本試驗使用質(zhì)譜儀為Agilent QQQ-6490儀器購于安捷倫科技有限公司。用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，濃度分別為1μg/mL。在儀器調(diào)諧通過后分別對上述兩個物質(zhì)進行全掃描，得到全掃描一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)后再進行二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，對所得到的子離子的質(zhì)譜參數(shù)進行逐個優(yōu)化，最終儀器參數(shù)如下：離子源為ESI源，MRM正離子模式；毛細管電壓3000V；離子源溫度150℃；干燥氣流量15L/min；霧化氣壓力25Psi；鞘氣溫度350℃；鞘氣（N2）流量12L/min。化合物質(zhì)譜參數(shù)詳見表4-1，二級質(zhì)譜圖見圖4-2～4-3。 表4-1化合物名稱、分子式、母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞電壓 序號 化合物名稱 分子式 母離子(m/z) 子離子(m/z) 碎裂電壓/V 碰撞能量/V 1 鉤吻堿 C20H22N2O2 323.1 70.0a/236.1 380 35/25 2 鉤吻堿子 C20H22N2O 307.2 220.1a/180.0 380 35/40 注：a為定量離子 圖4-2鉤吻堿二級質(zhì)譜圖 圖4-3鉤吻堿子二級質(zhì)譜圖 4.2 液相測定條件 4.2.1色譜柱條件 色譜柱：ACE UltraCore 2.5μm C18 2.1x75 mm；柱溫: 35℃。 4.2.2 流動相選擇 本試驗使用液相色譜儀為Agilent LC-1290儀器購于安捷倫科技有限公司。使用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）配制100 ng/mL和1000 ng/mL標準混合溶液，每個濃度設置6平行（進樣量0.5 μL）。在液相色譜儀上以乙腈為有機相，0.1%甲酸水溶液為水相，泵系統(tǒng)自動灌注10 min，初始流動相平衡30 min后進樣。待進樣完畢后，以100%乙腈沖洗柱子30 min，然后更換0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）為水相，泵系統(tǒng)自動灌注10 min，初始流動相平衡30 min后重復進樣。比較分析乙腈+0.1%甲酸水溶液和乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）兩組流動相下各檢測項目的峰面積，結果以乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）作為流動相時鉤吻堿的峰面積明顯高于乙腈+0.1%甲酸水溶液組，而鉤吻堿子無明顯差異，因此本檢測方法選擇乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）作為流動相。 4.2.3洗脫程序優(yōu)化 以乙腈為有機相（A），以0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）為水相（B）。經(jīng)過優(yōu)化的最終流動相洗脫程序詳見表4-4，0 min有機相為5%，為初平衡；0～1.00 min有機相由5%升至10%，1.00～1.50 min有機相由10%升至35%，1.50～2.50 min有機相由35%升至90%為分離階段；2.50～3.00 min有機相升到95%，為沖洗階段；3.01～5.50 min有機相降至5%；為后平衡。在該條件下各物質(zhì)的峰形對稱、銳利，能完全分離，保留時間落在2.0～2.3 min，詳見圖4-5～4-7。 表4-4 梯度洗脫程序表 梯度時間/min 流動相A/% 流動相B/% 0.00 5 95 1.00 10 90 1.50 35 65 2.50 90 10 3.00 95 5 3.01 5 95 5.50 5 95 圖4-5鉤吻堿提取離子色譜圖 圖4-6鉤吻堿子提取離子色譜圖 圖4-7鉤吻堿、鉤吻堿子提取離子色譜疊加圖 4.3 前處理方法優(yōu)化 4.3.1提取液優(yōu)化 我們對比了純化水、0.5%鹽酸水溶液、1%鹽酸水溶液、1.5%鹽酸水溶液和2%鹽酸水溶液對同一株鉤吻莖的粉碎樣進行鉤吻堿和鉤吻堿子堿同步提取、稀釋后，通過比較在高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜上測得的響應值來對比提取效率，由于鉤吻堿和鉤吻堿子均為生物堿物質(zhì)，在酸性溶液提取下物質(zhì)轉(zhuǎn)為非離子化狀態(tài)，使其在水中不易解離，提高了其溶解性。本試驗結果表明用1%鹽酸水溶液提取的鉤吻堿和鉤吻堿子響應最高，故選用1%鹽酸水溶液作為提取溶劑。不同溶劑提取下的響應值詳見表4-8。 表4-8不同溶劑提取下的響應值 溶劑 鉤吻堿響應值 鉤吻堿子響應值 純化水 110650 13523 0.5%鹽酸水溶液 200650 20899 1%鹽酸水溶液 277056 31569 1.5%鹽酸水溶液 266044 30547 2%鹽酸水溶液 266945 30449 4.3.2凈化方法優(yōu)化 我們對比了1%鹽酸水直接提取樣品（無凈化）、經(jīng)MCX固相萃取柱凈化和C18固相萃取柱凈化后的樣品。結果顯示，在1%鹽酸水直接提取的基礎上通過MCX固相萃取柱將生物堿成分富集后再凈化的效果非常明顯，C18固相萃取柱使生物堿損失量較大，生物堿含量明顯低于用MCX凈化的樣品；而1%鹽酸水直接提取樣品（無凈化），則干擾物質(zhì)較多，且酸水作為提取溶劑對氣相用毛細管色譜柱損傷較大，因此不宜采用。本實驗最后采用MCX固相萃取柱作為凈化方式。MCX固相萃取柱以混合型強陽離子交換反相吸附劑為基礎，由PLS吸附劑鍵合磺酸基團得到，兼具陽離子交換和反相兩種保留模式，適用于其共軛酸的pKa值處于2～10之間的堿性化合物。其保留機理以強陽離子交換相互作用和非極性相互作用為主，極性相互作用為次。適用于堿性化合物萃取。通過把待測物富集在MCX柱上，用水、甲醇淋洗除去除去試樣中的糖和酯類等非極性干擾物，用堿性溶液洗脫收集，濃縮后溶解上機測定，最終優(yōu)化的前處理方法如下： 對無結晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對有結晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過 60℃的水浴中溫熱，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5kg作為試樣置于樣品瓶中，密封，并標明標記，室溫保存，待用。保健湯樣品應將湯與湯渣混合均勻后作為試樣。制備均勻的試樣應置于樣品瓶中，密封，并標明標記，置于2～8℃保存，待用。 稱取1g（精確至0.01g）制備均勻的樣品置于100mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50mL，渦旋振蕩2min后超聲處理（100 W，40 kHz）30分鐘，3000r/mim離心5分鐘，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脫，收集洗脫液，并于40℃氮吹至干，加入溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）1.00mL溶解殘渣，過0.22μm有機濾膜，備用?；蚋鶕?jù)實際濃度適當稀釋，備用。MCX填料結構詳見圖4-9。 圖 4-9 MCX填料圖 4.4 精密度試驗 鉤吻堿在28～70μg/kg、鉤吻堿子在20～50μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個加標濃度，連續(xù)進樣6針，計算其相對標準偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質(zhì)相對標準偏差為0.9%～3.0%，酒基質(zhì)的相對標準偏差為0.6%～2.5%，保健湯基質(zhì)的相對標準偏差為1.0%～2.5%；鉤吻堿子的蜂蜜基質(zhì)相對標準偏差為0.8%～2.7%，酒基質(zhì)的相對標準偏差為0.7%～2.2%，保健湯基質(zhì)的相對標準偏差為1.5%～3.2%。該試驗中3種基質(zhì)的精密度試驗RSD均小于5%，說明儀器精密度良好。結果詳見表4-10。 表4-10高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法精密度試驗 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度/（μg/kg） 相對標準偏差(RSD) 相對標準偏差(RSD) 相對標準偏差(RSD) 鉤吻堿 28 3.0% 2.5% 2.5% 56 2.7% 1.1% 2.0% 70 0.9% 0.6% 1.0% 鉤吻堿子 20 2.7% 2.2% 3.2% 40 2.5% 1.0% 1.7% 50 0.8% 0.7% 1.5% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 4.5 基質(zhì)效應考察 基質(zhì)效應(matrix effect，ME)是指在樣品測試過程中，目標化合物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響質(zhì)譜檢測的現(xiàn)象。目前一般采用空白樣品前處理凈化后添加標準品的方法來評價基質(zhì)效應。當｜ME︱≤10％，提示基質(zhì)效應較小，可用溶劑標準曲線進行定量；當10％<｜ME︱≤50％，提示基質(zhì)效應較大，若用溶劑外標法定量回收率達不到要求，則需要用基質(zhì)標準曲線進行定量以消除基質(zhì)效應對結果的影響；當｜ME︱> 50％，提示基質(zhì)效應很強，嚴重影響定量，需要重新優(yōu)化樣品前處理方法。 將空白基質(zhì)試樣按標準前處理方法進行提取、凈化后獲得空白基質(zhì)提取液，分別使用空白基質(zhì)提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制為濃度2 ng/mL、8ng/mL、20ng/mL的基質(zhì)標準溶液和溶劑標準溶液；進行檢測，計算基質(zhì)效應，結果都在95%～105%范圍內(nèi)，說明經(jīng)本方法提取和凈化后，基質(zhì)效應不明顯，故標準曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標準系列濃度也適用于本標準的檢測?？疾旖Y果詳見表4-11。 表4-11基質(zhì)效應考察結果 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 項目 添加濃度(ng/mL) S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% 鉤吻堿 2 101.7 99.7 98.7 8 99.6 98.6 97.5 10 102.3 98.7 99.6 鉤吻堿子 2 104.7 102.3 99.2 8 101.4 101.6 101.5 10 102.6 100.7 100.6 *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 4.6 標準曲線 鉤吻堿標準品溶液工作曲線在14μg/kg～284μg/kg（濃度為1.4ng/mL～28.4ng/mL）線性關系良好，線性方程y=5116.072769x-1015.616631，相關系數(shù)R=0.999；鉤吻堿子標準品溶液工作曲線在10μg/kg～200μg/kg（濃度為1.0ng/mL～20.0ng/mL）線性關系良好，線性方程y=644.826518x- 56.355908，相關系數(shù)R=0.999，詳見圖4-12，圖4-13。 圖4-12鉤吻堿標準工作曲線 圖4-13鉤吻堿子標準工作曲線 4.7重復性試驗 分別稱取三種基質(zhì)各5份1.00g樣品置于離心管中，分別加入標準液使鉤吻堿含量為280μg/kg，鉤吻堿子含量為200μg/kg。按4.3.2前處理方法，提取，凈化并檢測。結果蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿的相對標準偏差為1.8%，酒基質(zhì)中鉤吻堿的相對標準偏差為2.9%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿的相對標準偏差為2.2%；蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿子的相對標準偏差為3.2%，酒基質(zhì)中鉤吻堿子的相對標準偏差為2.8%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿子的相對標準偏差為2.2%。該試驗中3種基質(zhì)的重復性試驗RSD均小于5%，說明方法重現(xiàn)性良好。詳見表4-14。 表4-14重復性試驗結果 蜂蜜基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 265 260 259 270 266 RSD/% 1.8 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 190 188 185 196 200 RSD/% 3.2 酒基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 258 276 269 262 273 RSD/% 2.9 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 201 198 203 209 194 RSD/% 2.8 保健湯基質(zhì)（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液） 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 259 269 272 282 277 RSD/% 3.2 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 210 210 208 200 204 RSD/% 2.2 4.8 回收率試驗 鉤吻堿在28～280μg/kg、鉤吻堿子在20～200μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個加標濃度回收率詳見下表4-15，該試驗中3種基質(zhì)的回收率試驗RSD均小于5%，說明方法準確度高。 表4-15 鉤吻堿、鉤吻堿子在不同基質(zhì)中的回收率 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度/（μg/kg） 回收率 相對標準偏差(RSD) 回收率 相對標準偏差(RSD) 回收率 相對標準偏差(RSD) 鉤吻堿 28 89.3%～95.9% 2.0%～3.9% 90.3%～95.0% 1.3%～2.9% 89.6%～93.0% 2.5%～3.6% 56 91.0%～96.1% 2.0%～3.4% 94.1%～98.1% 1.1%～2.4% 90.2%～96.0% 2.3%～3.4% 280 92.3%～98.1% 2.0%～2.9% 96.2%～98.1% 1.0%～2.0% 91.6%～98.1% 2.1%～2.8% 鉤吻堿子 20 86.2%～91.2% 2.2%～4.0% 89.9%～95.1% 1.1%～3.0% 85.9%～92.1% 1.7%～3.8% 40 88.2%～93.2% 2.2%～3.5% 90.2%～96.2% 1.2%～2.8% 88.2%～94.1% 1.6%～2.9% 200 89.6%～95.1% 2.1%～2.8% 91.0%～97.3% 1.1%～2.2% 90.0%～95.4% 1.7%～2.1% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 4.9 檢測方法的檢出限、定量限 以加標試驗來進行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比≥3來確定檢出限，經(jīng)試驗鉤吻堿檢出濃度可做到0.28ng/mL（2.8μg/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到0.2ng/mL（2μg/kg）。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比≥10來確定定量限，經(jīng)試驗鉤吻堿檢出濃度可做到0.56ng/mL（5.6μg/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到0.4ng/mL（4μg/kg）。由于考慮各執(zhí)行單位儀器靈敏度的差異以及鉤吻堿和鉤吻堿子為常量檢測指標，經(jīng)口攝入引起中毒量為毫克級，最終確定當稱樣量為1 g（精確至0.01g），稀釋倍數(shù)為10時，本方法中鉤吻堿檢出限為14μg/kg，鉤吻堿子檢出限為10μg/kg，鉤吻堿定量限為28μg/kg，鉤吻堿子定量限為20μg/kg。詳見下表4-16。 表4-16 鉤吻堿、鉤吻堿子在食品中的檢出限、定量限 序號 化合物名稱 檢出限（μg/kg） 定量限（μg/kg） 1 鉤吻堿 14 28 2 鉤吻堿子 10 20 5 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法（方法二） 5.1 質(zhì)譜測定條件 本試驗使用質(zhì)譜儀為Agilent 7000C儀器購于安捷倫科技有限公司。用溶劑甲醇分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，濃度分別為1μg/mL。在儀器調(diào)諧通過后分別對上述兩個物質(zhì)在EI源70 eV轟擊下進行全掃描記錄所產(chǎn)生的子離子，最終優(yōu)化得到的儀器參數(shù)如下：離子源電子轟擊源(EI) 70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃； 全掃描（SCAN）質(zhì)量范圍40-350 amu；詳見表5-1，圖5-2。 接口溫度需保證目標物完全汽化到質(zhì)譜端，故選用280℃，而質(zhì)譜掃描范圍需盡可能包含兩個目標物的碎片離子分子量，低質(zhì)量端從40amu開始可避免采集如氧氣、氮氣等空氣干擾，高質(zhì)量端截止至350amu可包含了鉤吻堿的分子離子322amu。 表5-1 化合物名稱、分子式、定量離子、定性離子 序號 化合物名稱 分子式 定量離子 （m/z） 定性離子 （m/z） 1 鉤吻堿 C20H22N2O2 322.0 279.0，251.0，108.0 2 鉤吻堿子 C20H22N2O 306.0 263.0，223.0，70.0 圖5-2鉤吻堿、鉤吻堿子全掃描圖 5.2 氣相測定條件 圖5-3鉤吻堿子提取離子色譜圖 本試驗使用氣相色譜儀Agilent GC 7890B儀器購于安捷倫科技有限公司。用HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 μm 色譜柱在作為分離色譜柱通過調(diào)節(jié)氣相色譜條件使鉤吻堿和鉤吻堿子達到完全分離，最終儀器參數(shù)如下：色譜柱HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 μm；載氣高純氦氣；進樣口溫度280℃；進樣量1.0μL不分流進樣；程序升溫(初始溫度為150 ℃，保持2 min，然后15℃min-1升至280 ℃，保持4 min)，詳見圖5-3～5-5。 圖5-4鉤吻堿提取離子色譜圖 圖5-5鉤吻堿、鉤吻堿子提取離子色譜疊加圖 5.3 前處理方法優(yōu)化 考慮到含水的溶劑汽化后會體積膨脹引起過載，容易造成反沖，以致目標物損失，另外含水的溶劑也容易造成非極性色譜柱（HP-5）的損害，故在方法氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法中最后的定容溶劑選擇用甲醇替代50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸），最終前處理方法為： 對無結晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對有結晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過 60℃的水浴中溫熱，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5kg作為試樣置于樣品瓶中，密封，并標明標記，室溫保存，待用。保健湯樣品應將湯與湯渣混合均勻后作為試樣。制備均勻的試樣應置于樣品瓶中，密封，并標明標記，置于2～8℃保存，待用。 稱取1g（精確至0.01g）樣品置于100mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50mL，渦旋振蕩2min后超聲處理（100 W，40 kHz）30分鐘，3000r/mim離心5分鐘，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脫，收集洗脫液，并于40℃氮吹至干，加入溶劑甲醇1.00mL溶解殘渣，過0.22μm有機濾膜，備用。或根據(jù)實際濃度適當稀釋，備用。 5.4 精密度試驗 鉤吻堿在140～350μg/kg、鉤吻堿子在100～250μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個加標濃度，連續(xù)進樣6針，計算其相對標準偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質(zhì)相對標準偏差為1.9%～3.7%，酒基質(zhì)的相對標準偏差為1.7%～3.1%，保健湯基質(zhì)的相對標準偏差為1.9%～2.9%；鉤吻堿子的蜂蜜基質(zhì)相對標準偏差為1.6%～3.8%，酒基質(zhì)的相對標準偏差為1.0%～2.2%，保健湯基質(zhì)的相對標準偏差為1.9%～3.1%。詳見表5-6。 表5-6氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法精密度試驗 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度 /（μg/kg） 相對標準偏差(RSD) 相對標準偏差(RSD) 相對標準偏差(RSD) 鉤吻堿 140 3.2% 2.5% 2.9% 280 3.7% 3.1% 2.4% 350 1.9% 1.7% 1.9% 鉤吻堿子 100 3.8% 2.2% 2.8% 200 3.5% 1.0% 3.1% 250 1.6% 1.8% 1.9% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 5.5 基質(zhì)效應考察 基質(zhì)效應(matrix effect，ME)是指在樣品測試過程中，目標化合物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響質(zhì)譜檢測的現(xiàn)象。目前一般采用空白樣品前處理凈化后添加標準品的方法來評價基質(zhì)效應。當｜ME︱≤10％，提示基質(zhì)效應較小，可用溶劑標準曲線進行定量；當10％<｜ME︱≤50％，提示基質(zhì)效應較大，若用溶劑外標法定量回收率達不到要求，則需要用基質(zhì)標準曲線進行定量以消除基質(zhì)效應對結果的影響；當｜ME︱> 50％，提示基質(zhì)效應很強，嚴重影響定量，需要重新優(yōu)化樣品前處理方法。 將空白基質(zhì)試樣按標準前處理方法進行提取、凈化后獲得空白提取液，分別使用空白基質(zhì)提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制為濃度5 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL的基質(zhì)標準溶液和溶劑標準溶液；進行檢測，計算基質(zhì)效應，結果都在95%～105%范圍內(nèi)，說明經(jīng)本方法提取和凈化后，基質(zhì)效應不明顯，故標準曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標準系列濃度也適用于本標準的檢測?？疾旖Y果詳見表5-7。 表5-7基質(zhì)效應考察結果 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 項目 添加濃度(ng/mL) S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% 鉤吻堿 5 103.7 102.4 103.3 20 100.2 102.1 102.5 25 98.6 99.4 100.6 鉤吻堿子 5 103.4 102.4 101.6 20 100.5 100.3 101.1 25 99.4 98.6 97.3 *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 5.6 標準曲線 鉤吻堿標準品溶液工作曲線在142μg/kg～2842μg/kg（濃度為14.2ng/mL～284.2ng/mL）線性關系良好，線性方程y=1527.868234x+42475.917066，相關系數(shù)R=0.999；鉤吻堿子標準品溶液工作曲線在101μg/kg～2018μg/kg（濃度為10.1ng/mL～201.8ng/mL）線性關系良好，線性方程y=3138.588520x- 2940.386876，相關系數(shù)R=0.999，詳見圖5-8，圖5-9。 圖5-8鉤吻堿標準工作曲線 圖5-9鉤吻堿子標準工作曲線 5.7 重復性試驗 分別稱取三種基質(zhì)各5份1.00g樣品置于離心管中，分別加入標準液使鉤吻堿含量為284μg/kg，鉤吻堿子含量為201.6μg/kg。按5.3前處理方法，提取，凈化并檢測。結果蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿的相對標準偏差為2.3%，酒基質(zhì)中鉤吻堿的相對標準偏差為1.6%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿的相對標準偏差為2.9%；蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿子的相對標準偏差為2.9%，酒基質(zhì)中鉤吻堿子的相對標準偏差為2.2%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿子的相對標準偏差為2.5%，詳見表5-10。 表5-10重復性試驗結果 蜂蜜基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 273 268 284 278 280 RSD/% 2.3 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 203 206 205 192 198 RSD/% 2.9 酒基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 276 280 282 280 288 RSD/% 1.6 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 208 204 209 198 207 RSD/% 2.2 保健湯基質(zhì)（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液） 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 279 271 285 287 292 RSD/% 2.9 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 203 198 195 199 208 RSD/% 2.5 5.8 回收率試驗 鉤吻堿在280～2800μg/kg、鉤吻堿子在200～2000μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個加標濃度回收率詳見下表5-11，該試驗中3種基質(zhì)的回收率試驗RSD均小于5%，說明方法準確度高。 表5-11 鉤吻堿、鉤吻堿子在不同基質(zhì)中的回收率 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度/（μg/kg） 回收率 相對標準偏差(RSD) 回收率 相對標準偏差(RSD) 回收率 相對標準偏差(RSD) 鉤吻堿 280 84.3%～90.9% 2.0%～4.2% 85.3%～91.2% 2.0%～3.5% 83.9%～91.2% 2.7%～3.8% 560 86.2%～90.7% 2.0%～3.4% 88.2%～92.1% 1.8%～3.0% 85.2%～91.6% 2.5%～3.4% 2800 90.2%～93.6% 2.0%～3.0% 89.8%～93.9% 1.9%～2.6% 88.5%～93.1% 2.1%～2.9% 鉤吻堿子 200 84.2%～89.6% 2.1%～4.2% 86.9%～90.2% 1.6%～3.2% 85.9%～91.1% 1.9%～3.9% 400 86.3%～91.2% 2.3%～3.7% 87.2%～91.3% 1.5%～2.9% 87.3%～92.2% 1.8%～3.5% 2000 88.5%～92.1% 2.1%～2.9% 89.0%～92.3% 1.13%～2.8% 89.7%～92.3% 1.7%～2.9% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 5.9 檢測方法的檢出限、定量限 以加標試驗來進行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比≥3來確定檢出限，經(jīng)試驗鉤吻堿檢出濃度可做到2.8ng/mL（28μg/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到2.0ng/mL（20μg/kg）。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比≥10來確定定量限，經(jīng)試驗鉤吻堿定量濃度可做到5.6ng/mL（56μg/kg），鉤吻堿子定量濃度可做到4.0ng/mL（40μg/kg），由于考慮各執(zhí)行單位儀器靈敏度的差異以及鉤吻堿和鉤吻堿子為常量檢測指標，經(jīng)口攝入引起中毒量為毫克級，最終確定當稱樣量為1 g（精確至0.01g），稀釋倍數(shù)為10時，本方法中鉤吻堿檢出限為140μg/kg，鉤吻堿子檢出限為100μg/kg，鉤吻堿定量限為280μg/kg，鉤吻堿子定量限為200μg/kg。詳見表5-12。 表5-12 鉤吻堿、