食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定（征求意見(jiàn)稿） 編制說(shuō)明

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附件2 廣西食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定（征求意見(jiàn)稿） 編制說(shuō)明 目　錄 一、工作簡(jiǎn)況 3 （一）任務(wù)來(lái)源與合同編號(hào)、起草單位、主要起草人 3 （二）簡(jiǎn)要起草過(guò)程 4 二、與我國(guó)、我區(qū)有關(guān)法律法規(guī)和其他標(biāo)準(zhǔn)情況的關(guān)系 4 三、標(biāo)準(zhǔn)制定必要性、目的及意義情況說(shuō)明 5 四、標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則 5 五、各項(xiàng)技術(shù)內(nèi)容的驗(yàn)證及說(shuō)明 6 1 目標(biāo)化合物的物理和化學(xué)性質(zhì) 6 1.1 鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì) 6 1.2 鉤吻堿和鉤吻堿子的應(yīng)用 6 1.3 鉤吻堿和鉤吻堿子的毒理作用 7 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及有效期驗(yàn)證 8 2.1 標(biāo)準(zhǔn)品信息 8 2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 8 2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液有效期驗(yàn)證 8 3本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)范圍及本方法檢測(cè)原理的說(shuō)明 9 3.1 檢測(cè)范圍 9 3.2 方法檢測(cè)原理 9 4 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（方法一） 10 4.1 質(zhì)譜測(cè)定條件 10 4.2 液相測(cè)定條件 12 4.3 前處理方法優(yōu)化 14 4.4 精密度試驗(yàn) 15 4.5 基質(zhì)效應(yīng)考察 16 4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 17 4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 18 4.8 回收率試驗(yàn) 19 4.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限 20 5 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法（方法二） 20 5.1 質(zhì)譜測(cè)定條件 20 5.2 氣相測(cè)定條件 21 5.3 前處理方法優(yōu)化 22 5.4 精密度試驗(yàn) 23 5.5 基質(zhì)效應(yīng)考察 23 5.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 24 5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 25 5.8 回收率試驗(yàn) 27 5.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限 27 6 高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法（方法三） 28 6.1 質(zhì)譜測(cè)定條件 28 6.2 液相測(cè)定條件 29 6.3 前處理方法 31 6.4 檢測(cè)方法的靈敏度和專屬性 31 一、工作簡(jiǎn)況 （一）任務(wù)來(lái)源與合同編號(hào)、起草單位、主要起草人 本檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制訂工作，是受廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)委托，由梧州市食品藥品檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)研制，合同編號(hào)為桂地標(biāo)食2019005。 標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位為梧州市食品藥品檢驗(yàn)所。主要起草人為：羅達(dá)龍、陳學(xué)松、劉慧妍、黃蘅、葉小強(qiáng)、賴秀梅、王華、陳翠玲、姚泳成、鐘家良，詳見(jiàn)表1。 表1 參加標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目人員情況 研制 人員 姓名 性別 年齡 職稱 職務(wù) 研究方向 單位 投入 時(shí)間 項(xiàng)目 負(fù)責(zé)人 羅達(dá)龍 男 36 副主任藥師 業(yè)務(wù)科主任兼科研管科主任 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 主要 參加 人員 陳學(xué)松 男 46 主任藥師 所長(zhǎng) 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 劉慧妍 女 37 副主任藥師 食品室主任 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 黃蘅 女 47 副主任藥師 副所長(zhǎng) 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 葉小強(qiáng) 男 56 副主任藥師 副所長(zhǎng) 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 賴秀梅 女 37 主管藥師 藥品室主任 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 王華 男 26 主管藥師 檢驗(yàn)員 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 陳翠玲 女 32 中藥師 檢驗(yàn)員 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 姚泳成 男 28 藥師 檢驗(yàn)員 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 鐘家良 男 25 藥師 檢驗(yàn)員 食品藥品檢驗(yàn) 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所 整個(gè)研究過(guò)程 （二）簡(jiǎn)要起草過(guò)程 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所接受制訂任務(wù)后，成立由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)技術(shù)人員組成的研制小組，全面負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的研制計(jì)劃和工作安排。主要成員由正高1人，副高4人，中級(jí)職稱2人，初級(jí)職稱3人，共10人組成。制訂本標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)《中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法》，GB/T 1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》、GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》等標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范。制標(biāo)小組為做好標(biāo)準(zhǔn)的制定工作，廣泛收集國(guó)內(nèi)外有關(guān)的檢測(cè)技術(shù)資料、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、限量指標(biāo)，以及相關(guān)的法律、法規(guī)，召開了有關(guān)座談會(huì)，聽(tīng)取各方建議。在研制過(guò)程中，遵循科學(xué)性、實(shí)用性和前瞻性等原則，尊重客觀規(guī)律，融合科學(xué)理論和標(biāo)準(zhǔn)化方法?？紤]到我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法應(yīng)逐步與國(guó)際接軌，以及分析方法應(yīng)有較強(qiáng)的可操作性的要求，確定了標(biāo)準(zhǔn)制定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)本項(xiàng)目作了以下主要制訂：（1）確定了檢測(cè)項(xiàng)目為食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定；（2）制定了檢測(cè)方法為方法一：高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法、方法二：氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、方法三：高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法；（3）規(guī)定了檢測(cè)對(duì)象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定，其它基質(zhì)食品可參照?qǐng)?zhí)行。 2、 與我國(guó)、我區(qū)有關(guān)法律法規(guī)和其他標(biāo)準(zhǔn)情況的關(guān)系 新制地方標(biāo)準(zhǔn)與相關(guān)法律、法規(guī)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致，沒(méi)有沖突。 第1， 新制地方標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)項(xiàng)目為食品中鉤吻堿和鉤吻堿子，國(guó)內(nèi)對(duì)于食品中鉤吻堿類生物堿中毒的應(yīng)急檢測(cè)仍未有相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法。 第2， 新制地方標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)范圍較寬。新制地方標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)對(duì)象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定，其它基質(zhì)食品可參照?qǐng)?zhí)行。 第三，新制地方標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度較優(yōu)。新制地方標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度等相關(guān)指標(biāo)滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中的規(guī)定。 第四，新制地方標(biāo)準(zhǔn)采用固相萃取凈化方法，運(yùn)用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行定性和定量測(cè)定，用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行篩查和定性確證。 三、標(biāo)準(zhǔn)制定必要性、目的及意義情況說(shuō)明 鉤吻堿類生物堿主要存在于馬錢科植物胡蔓藤Gelsemium elegans(Gardn.et Champ.)Benth.中，習(xí)稱斷腸草，民間有用藥史，一般用于跌打損傷，骨折，皮膚濕疹等，因其有大毒，一般外用，誤服能致命。2015-2016 年梧州地區(qū)共發(fā)生2 起因誤食鉤吻（斷腸草）引起的生物堿中毒事件，造成6人中毒1人死亡。查閱文獻(xiàn)，報(bào)道國(guó)內(nèi)廣東茂名市公安局早期曾發(fā)表過(guò)《鉤吻堿中毒40例尸檢分析》的文章，文章稱其中利用鉤吻投毒致死15人、服鉤吻自殺20人、為治病服藥5人，由此可見(jiàn)因誤食鉤吻導(dǎo)致中毒或死亡的案例時(shí)有發(fā)生。 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所作為梧州市食品安全委員會(huì)辦公室成員中唯一應(yīng)急檢驗(yàn)單位，近四年參與的轄區(qū)內(nèi)應(yīng)急檢驗(yàn)，確證兩例共29批樣品含鉤吻成分，應(yīng)急處理中發(fā)現(xiàn)國(guó)標(biāo)和地標(biāo)均未有相關(guān)的食品鉤吻中毒的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，故很有必要在食品中毒領(lǐng)域上找到可行、規(guī)范、準(zhǔn)確的質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)，為食品中毒鉤吻的應(yīng)急處理提供一個(gè)依據(jù)和對(duì)中毒物質(zhì)的定性定量做出準(zhǔn)確的判斷，由于鉤吻中含有特征性成分──鉤吻堿和鉤吻堿子，故本研究對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子運(yùn)用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行定性和定量測(cè)定，并以高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)疑似鉤吻中毒的樣品進(jìn)行篩查和定性確證。建立檢測(cè)法，制定明確標(biāo)準(zhǔn)，為中毒分析檢驗(yàn)提供法定依據(jù)，為人員搶救搶占時(shí)間。為醫(yī)院的后續(xù)治療處理或中毒物質(zhì)分析提供有效準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。 四、標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則 本標(biāo)準(zhǔn)的制定和起草工作遵循統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性。第一，本標(biāo)準(zhǔn)為現(xiàn)有檢測(cè)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的唯一標(biāo)準(zhǔn)。第二，方法確認(rèn)和驗(yàn)證嚴(yán)謹(jǐn)、全面，適用性強(qiáng)。本標(biāo)準(zhǔn)選擇了蜂蜜、酒、保健湯（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液）作為試樣進(jìn)行方法確認(rèn)，覆蓋鉤吻中毒事件中常見(jiàn)的食品。第三，標(biāo)準(zhǔn)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中的規(guī)定，要求進(jìn)行制定，具有一致性和規(guī)范性。 五、各項(xiàng)技術(shù)內(nèi)容的驗(yàn)證及說(shuō)明 1 目標(biāo)化合物的物理和化學(xué)性質(zhì) 1.1 鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì) 鉤吻堿和鉤吻堿子詳見(jiàn)表1-1 表1-1鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì) 名稱 鉤吻堿 鉤吻堿子 別稱 鉤吻素甲 鉤吻素子 英文名稱 Gelsemine Koumine 密度 1.33 g/cm3 1.330.1 g/cm3 沸點(diǎn) 493.4C at 760 mmHg 493.4C at 760 mmHg 熔點(diǎn) 178C 181-183C 分子式 C20H22N2O2 C20H22N2O 分子量 322.4 306.4 CAS號(hào) 509-15-9 1358-76-5 精確分子量 322.1681 306.1732 儲(chǔ)存條件 應(yīng)放有毒有害保險(xiǎn)箱常溫保存 應(yīng)放有毒有害保險(xiǎn)箱常溫保存 分子結(jié)構(gòu)式 1.2鉤吻堿和鉤吻堿子的應(yīng)用 1.2.1鉤吻堿應(yīng)用 文獻(xiàn)記載鉤吻堿是治療部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎（PSNL）小鼠的神經(jīng)性疼痛和睡眠障礙的有效藥物。鉤吻堿（4 mg / kg）對(duì)PSNL誘導(dǎo)的機(jī)械異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在PSNL小鼠中，鉤吻堿（4mg / kg）使機(jī)械閾值增加4小時(shí)并延長(zhǎng)熱潛伏期3小時(shí)。此外，鉤吻堿能增加非快速眼動(dòng)（非REM，NREM）睡眠，減少覺(jué)醒，但在前3小時(shí)內(nèi)不影響快速眼動(dòng)（REM）睡眠在PSNL小鼠。免疫組織化學(xué)研究表明，PSNL可增加前扣帶皮層神經(jīng)元中c-Fos的表達(dá)，而鉤吻堿（4 mg / kg）可使c-Fos表達(dá)降低58％。具有興奮中樞神經(jīng)作用，由于毒性很大，很少作藥用。 1.2.2鉤吻堿子應(yīng)用 鉤吻堿子是從鉤吻中得到的生物堿，具有高效抗腫瘤活性，在腫瘤細(xì)胞中能夠增加Bax/Bcl-2 的蛋白比例和 caspase-3 的表達(dá)。鉤吻堿子具有抗焦慮、抗應(yīng)激、抗銀屑病和鎮(zhèn)痛活性。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中，鉤吻堿子能夠預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。 1.3鉤吻堿和鉤吻堿子的毒理作用 1.3.1鉤吻堿 主要抑制延腦的呼吸中樞，引起呼吸中樞麻痹，呼吸衰竭而死亡，同時(shí)作用于迷走神經(jīng)和心肌，引起血液循環(huán)障礙，從而加劇了肝、腎等臟器的損害。 1.3.2鉤吻堿子 毒理作用與鉤吻堿相似。 1.3.3鉤吻生物堿的危害 鉤吻常見(jiàn)于廣東、廣西、貴州等地區(qū)，由于其型與金銀花相似，導(dǎo)致民間多見(jiàn)誤食鉤吻而導(dǎo)致鉤吻中毒，中毒患者多見(jiàn)為飲用含鉤吻中藥材的自釀中藥藥酒而導(dǎo)致中毒，或誤把鉤吻當(dāng)做藥用食材用于烹飪方面。鉤吻全株都有大毒，根、莖、枝、葉含有8種鉤吻生物堿，而當(dāng)中鉤吻堿和鉤吻堿子是毒理研究最多的成分，也是鉤吻的最具代表性成分。服食鉤吻堿過(guò)量，即導(dǎo)致消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的強(qiáng)烈反應(yīng)，腸發(fā)黑粘連。中毒癥狀包括流涎、惡心、口渴、吞咽困難、發(fā)熱、嘔吐、口吐白沫、抽搐、四肢麻木、肌肉無(wú)力、肌肉纖維顫動(dòng)、舌硬、言語(yǔ)不清、煩躁不安、心律失常等。 1.3.4 鉤吻的小鼠半數(shù)致死量 洪息君、陸文光等在《斷腸草不同部位毒性的研究》中指出用鉤吻植物的不同部位以1:10的煎劑來(lái)測(cè)定小鼠的半數(shù)致死量（LD50）植物中各部位的LD50分別為：鉤吻根0.0798g /kg，老莖1.309 g/kg，嫩莖1.830 g/kg，葉0.255 g/kg，花0.458 g/kg，果實(shí)1.275 g/kg。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鉤吻根3g左右或嫩芽7個(gè)，或流浸膏3.5mL，或鉤吻堿0.15～0.3g經(jīng)口攝入可使人致死。鉤吻堿攝入量在0.15～0.3g，人體即有中毒跡象。 張永志、何宏源等在《鉤吻素甲對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究》中指出使用鉤吻堿灌胃的小鼠30分鐘內(nèi)半數(shù)致死濃度為78.23mg/kg，95%置信區(qū)間69.75~87.75mg/kg，而使用51.2mg/kg濃度灌胃的小鼠30分鐘內(nèi)小鼠無(wú)死亡，并且較低濃度的鉤吻堿子（10mg/kg）亦對(duì)小鼠具有抗焦慮的治療作用，說(shuō)明低劑量的鉤吻堿與鉤吻堿子對(duì)機(jī)體基本無(wú)毒性影響。 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及有效期驗(yàn)證 2.1 標(biāo)準(zhǔn)品信息 鉤吻堿和鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，詳見(jiàn)表2-1 表2-1 鉤吻堿、鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品信息 名稱 別稱 貨號(hào) 狀態(tài) 純度 劑型劑量 生產(chǎn)單位 鉤吻堿 鉤吻素甲 NACC60513 粉末 ≥98% 20mg/瓶 中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 鉤吻堿子 鉤吻素子 NACC60512 粉末 ≥98% 20mg/瓶 中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 2.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/mL） 分別精密稱取鉤吻堿、鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并稀釋至10mL，搖勻，制成濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20 ℃避光貯存，有效期6個(gè)月。 2.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液（1 g/mL） 分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/mL）（2.2.1）各0.10 mL，用甲醇稀釋至100mL，搖勻，制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。 2.2.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（1 g/mL）（2.2.2）適量，用甲醇稀釋，搖勻，作為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各化合物濃度依次為1 g/L～200 g/L，臨用新制或依儀器響應(yīng)情況配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液有效期驗(yàn)證 分別取適量標(biāo)準(zhǔn)品粉末（對(duì)照組）、儲(chǔ)存時(shí)間為1個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（含單標(biāo)和混標(biāo)）和儲(chǔ)存時(shí)間為6個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（含單標(biāo)和混標(biāo)），分別按“2.2”的方法配制成10g/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行。在相同條件下同時(shí)進(jìn)樣檢測(cè)，每組單標(biāo)和每組混標(biāo)均檢測(cè)鉤吻堿、鉤吻堿子。 分析比較不同儲(chǔ)存時(shí)間的每種單標(biāo)同時(shí)檢測(cè)兩種化合物的峰面積結(jié)果。該結(jié)果提示鉤吻堿、鉤吻堿子在正常儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液不影響定量。 分析比較不同儲(chǔ)存時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)混合液檢測(cè)兩種化合物的峰面積結(jié)果，詳見(jiàn)表2-2，存儲(chǔ)1個(gè)月和6個(gè)月的各個(gè)化合物的峰面積與對(duì)照組的峰面積比較，均沒(méi)有顯著性差異（p > 0.05）。結(jié)果表明鉤吻堿、鉤吻堿子可以穩(wěn)定儲(chǔ)存于甲醇等介質(zhì)中，高濃度的儲(chǔ)備液有效期至少為6個(gè)月，標(biāo)準(zhǔn)中間液有效期至少為1個(gè)月。 表2-2 不同儲(chǔ)存時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)混合液檢測(cè)結(jié)果 儲(chǔ)存時(shí)間 對(duì)照組 1個(gè)月 6個(gè)月 化合物名稱 Area 1 Area 2 Area 3 Area 1 Area 2 Area 3 P值 Area 1 Area 2 Area 3 P值 鉤吻堿 28789 29547 31201 31001 31520 30411 0.221 30141 29898 30112 0.789 鉤吻堿子 30259 31544 32211 30443 29201 31985 0.466 29210 29985 32144 0.443 3本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)范圍及本方法檢測(cè)原理的說(shuō)明 3.1 檢測(cè)范圍 3.1.1 酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)的選取 2015年，在梧州地區(qū)發(fā)生一起農(nóng)民工中毒事件，通過(guò)檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)收集疑似引起中毒材料，包括鉤吻植物、鉤吻植物泡制的酒、以及中毒時(shí)農(nóng)民工所飲用的用鉤吻作為食材煮的“保健湯”，最終確認(rèn)為鉤吻中毒，據(jù)相關(guān)人員反饋，農(nóng)民工在山上采集的“鉤吻”植物誤認(rèn)為雞血藤，繼而通過(guò)泡酒，煲湯，以想達(dá)到活血補(bǔ)血，舒筋活絡(luò)等功效，但由于植物鑒定知識(shí)和技能限制，誤認(rèn)植物而引起了食物中毒。而鉤吻最長(zhǎng)用的誤服途徑為泡酒和煲湯，所以本標(biāo)準(zhǔn)選取了酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)為主要研究對(duì)象。 3.1.2 蜂蜜基質(zhì)的選取 2016年，在梧州地區(qū)也發(fā)生一起食品中毒事件，經(jīng)過(guò)檢測(cè)與有關(guān)部門的調(diào)查，其中毒樣品為野生蜂蜜，蜜蜂經(jīng)采集蜂巢附近的鉤吻花蜜回巢形成了有毒蜂蜜，從而引起采集野生蜂蜜中毒事件，故本標(biāo)準(zhǔn)也選取了蜂蜜基質(zhì)作為主要研究對(duì)象。 由于近年來(lái)，我們接收到的案件樣品有蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)等。規(guī)定了檢測(cè)對(duì)象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定，其它基質(zhì)食品可參照?qǐng)?zhí)行。 3.2 方法檢測(cè)原理 由于鉤吻含鉤吻堿、鉤吻堿子等生物堿，其可在酸性條件下形成非離子狀態(tài)，更容易溶解于水中，繼而經(jīng)過(guò)與強(qiáng)陽(yáng)離子交換反相吸附劑固相萃取柱的作用吸附，用水與有機(jī)相淋洗除去雜質(zhì)后，用堿性溶液洗脫，收集洗脫液，達(dá)到凈化的作用。 由于高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為實(shí)驗(yàn)室常配儀器，故本標(biāo)準(zhǔn)還采用了高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分別作為方法一和方法二使用，根據(jù)歐盟委員會(huì)2002/ 657/ EC 決議的“四分法原則”，高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法選取一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子可得到較好的定性，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選取四個(gè)特征離子也可得到較好的定性，同時(shí)該兩個(gè)方法也是常用的定量方法，經(jīng)方法適用性考察后，兩個(gè)方法的定性與定量效果也能滿足日常使用要求，且兩個(gè)方法的檢出限與定量限設(shè)定遠(yuǎn)低于鉤吻堿和鉤吻堿子的經(jīng)口攝入中毒劑量，能滿足食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的常量與痕量分析。 由于高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜可得到目標(biāo)物的準(zhǔn)確分子量，根據(jù)歐盟委員會(huì)2002/ 657/ EC 決議的“四分法原則”，只需有2個(gè)準(zhǔn)確分子匹配，即可快速、準(zhǔn)確的定性，故本標(biāo)準(zhǔn)方法三僅作為定性方法。 經(jīng)優(yōu)化，本標(biāo)準(zhǔn)選用試樣經(jīng)1%鹽酸超聲提取，經(jīng)MCX柱凈化后，運(yùn)用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行定性和定量測(cè)定，用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行篩查和定性確證。 4 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（方法一） 4.1 質(zhì)譜測(cè)定條件 本試驗(yàn)使用質(zhì)譜儀為Agilent QQQ-6490儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，濃度分別為1μg/mL。在儀器調(diào)諧通過(guò)后分別對(duì)上述兩個(gè)物質(zhì)進(jìn)行全掃描，得到全掃描一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)后再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，對(duì)所得到的子離子的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行逐個(gè)優(yōu)化，最終儀器參數(shù)如下：離子源為ESI源，MRM正離子模式；毛細(xì)管電壓3000V；離子源溫度150℃；干燥氣流量15L/min；霧化氣壓力25Psi；鞘氣溫度350℃；鞘氣（N2）流量12L/min。化合物質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表4-1，二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4-2～4-3。 表4-1化合物名稱、分子式、母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞電壓 序號(hào) 化合物名稱 分子式 母離子(m/z) 子離子(m/z) 碎裂電壓/V 碰撞能量/V 1 鉤吻堿 C20H22N2O2 323.1 70.0a/236.1 380 35/25 2 鉤吻堿子 C20H22N2O 307.2 220.1a/180.0 380 35/40 注：a為定量離子 圖4-2鉤吻堿二級(jí)質(zhì)譜圖 圖4-3鉤吻堿子二級(jí)質(zhì)譜圖 4.2 液相測(cè)定條件 4.2.1色譜柱條件 色譜柱：ACE UltraCore 2.5μm C18 2.1x75 mm；柱溫: 35℃。 4.2.2 流動(dòng)相選擇 本試驗(yàn)使用液相色譜儀為Agilent LC-1290儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。使用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）配制100 ng/mL和1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6平行（進(jìn)樣量0.5 μL）。在液相色譜儀上以乙腈為有機(jī)相，0.1%甲酸水溶液為水相，泵系統(tǒng)自動(dòng)灌注10 min，初始流動(dòng)相平衡30 min后進(jìn)樣。待進(jìn)樣完畢后，以100%乙腈沖洗柱子30 min，然后更換0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）為水相，泵系統(tǒng)自動(dòng)灌注10 min，初始流動(dòng)相平衡30 min后重復(fù)進(jìn)樣。比較分析乙腈+0.1%甲酸水溶液和乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）兩組流動(dòng)相下各檢測(cè)項(xiàng)目的峰面積，結(jié)果以乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）作為流動(dòng)相時(shí)鉤吻堿的峰面積明顯高于乙腈+0.1%甲酸水溶液組，而鉤吻堿子無(wú)明顯差異，因此本檢測(cè)方法選擇乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）作為流動(dòng)相。 4.2.3洗脫程序優(yōu)化 以乙腈為有機(jī)相（A），以0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）為水相（B）。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的最終流動(dòng)相洗脫程序詳見(jiàn)表4-4，0 min有機(jī)相為5%，為初平衡；0～1.00 min有機(jī)相由5%升至10%，1.00～1.50 min有機(jī)相由10%升至35%，1.50～2.50 min有機(jī)相由35%升至90%為分離階段；2.50～3.00 min有機(jī)相升到95%，為沖洗階段；3.01～5.50 min有機(jī)相降至5%；為后平衡。在該條件下各物質(zhì)的峰形對(duì)稱、銳利，能完全分離，保留時(shí)間落在2.0～2.3 min，詳見(jiàn)圖4-5～4-7。 表4-4 梯度洗脫程序表 梯度時(shí)間/min 流動(dòng)相A/% 流動(dòng)相B/% 0.00 5 95 1.00 10 90 1.50 35 65 2.50 90 10 3.00 95 5 3.01 5 95 5.50 5 95 圖4-5鉤吻堿提取離子色譜圖 圖4-6鉤吻堿子提取離子色譜圖 圖4-7鉤吻堿、鉤吻堿子提取離子色譜疊加圖 4.3 前處理方法優(yōu)化 4.3.1提取液優(yōu)化 我們對(duì)比了純化水、0.5%鹽酸水溶液、1%鹽酸水溶液、1.5%鹽酸水溶液和2%鹽酸水溶液對(duì)同一株鉤吻莖的粉碎樣進(jìn)行鉤吻堿和鉤吻堿子堿同步提取、稀釋后，通過(guò)比較在高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜上測(cè)得的響應(yīng)值來(lái)對(duì)比提取效率，由于鉤吻堿和鉤吻堿子均為生物堿物質(zhì)，在酸性溶液提取下物質(zhì)轉(zhuǎn)為非離子化狀態(tài)，使其在水中不易解離，提高了其溶解性。本試驗(yàn)結(jié)果表明用1%鹽酸水溶液提取的鉤吻堿和鉤吻堿子響應(yīng)最高，故選用1%鹽酸水溶液作為提取溶劑。不同溶劑提取下的響應(yīng)值詳見(jiàn)表4-8。 表4-8不同溶劑提取下的響應(yīng)值 溶劑 鉤吻堿響應(yīng)值 鉤吻堿子響應(yīng)值 純化水 110650 13523 0.5%鹽酸水溶液 200650 20899 1%鹽酸水溶液 277056 31569 1.5%鹽酸水溶液 266044 30547 2%鹽酸水溶液 266945 30449 4.3.2凈化方法優(yōu)化 我們對(duì)比了1%鹽酸水直接提取樣品（無(wú)凈化）、經(jīng)MCX固相萃取柱凈化和C18固相萃取柱凈化后的樣品。結(jié)果顯示，在1%鹽酸水直接提取的基礎(chǔ)上通過(guò)MCX固相萃取柱將生物堿成分富集后再凈化的效果非常明顯，C18固相萃取柱使生物堿損失量較大，生物堿含量明顯低于用MCX凈化的樣品；而1%鹽酸水直接提取樣品（無(wú)凈化），則干擾物質(zhì)較多，且酸水作為提取溶劑對(duì)氣相用毛細(xì)管色譜柱損傷較大，因此不宜采用。本實(shí)驗(yàn)最后采用MCX固相萃取柱作為凈化方式。MCX固相萃取柱以混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換反相吸附劑為基礎(chǔ)，由PLS吸附劑鍵合磺酸基團(tuán)得到，兼具陽(yáng)離子交換和反相兩種保留模式，適用于其共軛酸的pKa值處于2～10之間的堿性化合物。其保留機(jī)理以強(qiáng)陽(yáng)離子交換相互作用和非極性相互作用為主，極性相互作用為次。適用于堿性化合物萃取。通過(guò)把待測(cè)物富集在MCX柱上，用水、甲醇淋洗除去除去試樣中的糖和酯類等非極性干擾物，用堿性溶液洗脫收集，濃縮后溶解上機(jī)測(cè)定，最終優(yōu)化的前處理方法如下： 對(duì)無(wú)結(jié)晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過(guò) 60℃的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5kg作為試樣置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，室溫保存，待用。保健湯樣品應(yīng)將湯與湯渣混合均勻后作為試樣。制備均勻的試樣應(yīng)置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，置于2～8℃保存，待用。 稱取1g（精確至0.01g）制備均勻的樣品置于100mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50mL，渦旋振蕩2min后超聲處理（100 W，40 kHz）30分鐘，3000r/mim離心5分鐘，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脫，收集洗脫液，并于40℃氮吹至干，加入溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）1.00mL溶解殘?jiān)^(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，備用?；蚋鶕?jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋，備用。MCX填料結(jié)構(gòu)詳見(jiàn)圖4-9。 圖 4-9 MCX填料圖 4.4 精密度試驗(yàn) 鉤吻堿在28～70μg/kg、鉤吻堿子在20～50μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～3.0%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～2.5%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～2.5%；鉤吻堿子的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～2.7%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～2.2%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～3.2%。該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的精密度試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明儀器精密度良好。結(jié)果詳見(jiàn)表4-10。 表4-10高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法精密度試驗(yàn) 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度/（μg/kg） 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 鉤吻堿 28 3.0% 2.5% 2.5% 56 2.7% 1.1% 2.0% 70 0.9% 0.6% 1.0% 鉤吻堿子 20 2.7% 2.2% 3.2% 40 2.5% 1.0% 1.7% 50 0.8% 0.7% 1.5% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 4.5 基質(zhì)效應(yīng)考察 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)是指在樣品測(cè)試過(guò)程中，目標(biāo)化合物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響質(zhì)譜檢測(cè)的現(xiàn)象。目前一般采用空白樣品前處理凈化后添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)｜ME︱≤10％，提示基質(zhì)效應(yīng)較小，可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；當(dāng)10％<｜ME︱≤50％，提示基質(zhì)效應(yīng)較大，若用溶劑外標(biāo)法定量回收率達(dá)不到要求，則需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響；當(dāng)｜ME︱> 50％，提示基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)，嚴(yán)重影響定量，需要重新優(yōu)化樣品前處理方法。 將空白基質(zhì)試樣按標(biāo)準(zhǔn)前處理方法進(jìn)行提取、凈化后獲得空白基質(zhì)提取液，分別使用空白基質(zhì)提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制為濃度2 ng/mL、8ng/mL、20ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液；進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果都在95%～105%范圍內(nèi)，說(shuō)明經(jīng)本方法提取和凈化后，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，故標(biāo)準(zhǔn)曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度也適用于本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)?？疾旖Y(jié)果詳見(jiàn)表4-11。 表4-11基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 項(xiàng)目 添加濃度(ng/mL) S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% 鉤吻堿 2 101.7 99.7 98.7 8 99.6 98.6 97.5 10 102.3 98.7 99.6 鉤吻堿子 2 104.7 102.3 99.2 8 101.4 101.6 101.5 10 102.6 100.7 100.6 *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在14μg/kg～284μg/kg（濃度為1.4ng/mL～28.4ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=5116.072769x-1015.616631，相關(guān)系數(shù)R=0.999；鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在10μg/kg～200μg/kg（濃度為1.0ng/mL～20.0ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=644.826518x- 56.355908，相關(guān)系數(shù)R=0.999，詳見(jiàn)圖4-12，圖4-13。 圖4-12鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 圖4-13鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 4.7重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取三種基質(zhì)各5份1.00g樣品置于離心管中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)液使鉤吻堿含量為280μg/kg，鉤吻堿子含量為200μg/kg。按4.3.2前處理方法，提取，凈化并檢測(cè)。結(jié)果蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%，酒基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%；蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%，酒基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%。該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。詳見(jiàn)表4-14。 表4-14重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 蜂蜜基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 265 260 259 270 266 RSD/% 1.8 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 190 188 185 196 200 RSD/% 3.2 酒基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 258 276 269 262 273 RSD/% 2.9 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 201 198 203 209 194 RSD/% 2.8 保健湯基質(zhì)（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液） 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 259 269 272 282 277 RSD/% 3.2 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 210 210 208 200 204 RSD/% 2.2 4.8 回收率試驗(yàn) 鉤吻堿在28～280μg/kg、鉤吻堿子在20～200μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度回收率詳見(jiàn)下表4-15，該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的回收率試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度高。 表4-15 鉤吻堿、鉤吻堿子在不同基質(zhì)中的回收率 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度/（μg/kg） 回收率 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 回收率 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 回收率 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 鉤吻堿 28 89.3%～95.9% 2.0%～3.9% 90.3%～95.0% 1.3%～2.9% 89.6%～93.0% 2.5%～3.6% 56 91.0%～96.1% 2.0%～3.4% 94.1%～98.1% 1.1%～2.4% 90.2%～96.0% 2.3%～3.4% 280 92.3%～98.1% 2.0%～2.9% 96.2%～98.1% 1.0%～2.0% 91.6%～98.1% 2.1%～2.8% 鉤吻堿子 20 86.2%～91.2% 2.2%～4.0% 89.9%～95.1% 1.1%～3.0% 85.9%～92.1% 1.7%～3.8% 40 88.2%～93.2% 2.2%～3.5% 90.2%～96.2% 1.2%～2.8% 88.2%～94.1% 1.6%～2.9% 200 89.6%～95.1% 2.1%～2.8% 91.0%～97.3% 1.1%～2.2% 90.0%～95.4% 1.7%～2.1% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 4.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限 以加標(biāo)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比≥3來(lái)確定檢出限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出濃度可做到0.28ng/mL（2.8μg/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到0.2ng/mL（2μg/kg）。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比≥10來(lái)確定定量限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出濃度可做到0.56ng/mL（5.6μg/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到0.4ng/mL（4μg/kg）。由于考慮各執(zhí)行單位儀器靈敏度的差異以及鉤吻堿和鉤吻堿子為常量檢測(cè)指標(biāo)，經(jīng)口攝入引起中毒量為毫克級(jí)，最終確定當(dāng)稱樣量為1 g（精確至0.01g），稀釋倍數(shù)為10時(shí)，本方法中鉤吻堿檢出限為14μg/kg，鉤吻堿子檢出限為10μg/kg，鉤吻堿定量限為28μg/kg，鉤吻堿子定量限為20μg/kg。詳見(jiàn)下表4-16。 表4-16 鉤吻堿、鉤吻堿子在食品中的檢出限、定量限 序號(hào) 化合物名稱 檢出限（μg/kg） 定量限（μg/kg） 1 鉤吻堿 14 28 2 鉤吻堿子 10 20 5 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法（方法二） 5.1 質(zhì)譜測(cè)定條件 本試驗(yàn)使用質(zhì)譜儀為Agilent 7000C儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。用溶劑甲醇分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，濃度分別為1μg/mL。在儀器調(diào)諧通過(guò)后分別對(duì)上述兩個(gè)物質(zhì)在EI源70 eV轟擊下進(jìn)行全掃描記錄所產(chǎn)生的子離子，最終優(yōu)化得到的儀器參數(shù)如下：離子源電子轟擊源(EI) 70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃； 全掃描（SCAN）質(zhì)量范圍40-350 amu；詳見(jiàn)表5-1，圖5-2。 接口溫度需保證目標(biāo)物完全汽化到質(zhì)譜端，故選用280℃，而質(zhì)譜掃描范圍需盡可能包含兩個(gè)目標(biāo)物的碎片離子分子量，低質(zhì)量端從40amu開始可避免采集如氧氣、氮?dú)獾瓤諝飧蓴_，高質(zhì)量端截止至350amu可包含了鉤吻堿的分子離子322amu。 表5-1 化合物名稱、分子式、定量離子、定性離子 序號(hào) 化合物名稱 分子式 定量離子 （m/z） 定性離子 （m/z） 1 鉤吻堿 C20H22N2O2 322.0 279.0，251.0，108.0 2 鉤吻堿子 C20H22N2O 306.0 263.0，223.0，70.0 圖5-2鉤吻堿、鉤吻堿子全掃描圖 5.2 氣相測(cè)定條件 圖5-3鉤吻堿子提取離子色譜圖 本試驗(yàn)使用氣相色譜儀Agilent GC 7890B儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。用HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 μm 色譜柱在作為分離色譜柱通過(guò)調(diào)節(jié)氣相色譜條件使鉤吻堿和鉤吻堿子達(dá)到完全分離，最終儀器參數(shù)如下：色譜柱HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 μm；載氣高純氦氣；進(jìn)樣口溫度280℃；進(jìn)樣量1.0μL不分流進(jìn)樣；程序升溫(初始溫度為150 ℃，保持2 min，然后15℃min-1升至280 ℃，保持4 min)，詳見(jiàn)圖5-3～5-5。 圖5-4鉤吻堿提取離子色譜圖 圖5-5鉤吻堿、鉤吻堿子提取離子色譜疊加圖 5.3 前處理方法優(yōu)化 考慮到含水的溶劑汽化后會(huì)體積膨脹引起過(guò)載，容易造成反沖，以致目標(biāo)物損失，另外含水的溶劑也容易造成非極性色譜柱（HP-5）的損害，故在方法氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法中最后的定容溶劑選擇用甲醇替代50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸），最終前處理方法為： 對(duì)無(wú)結(jié)晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過(guò) 60℃的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5kg作為試樣置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，室溫保存，待用。保健湯樣品應(yīng)將湯與湯渣混合均勻后作為試樣。制備均勻的試樣應(yīng)置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，置于2～8℃保存，待用。 稱取1g（精確至0.01g）樣品置于100mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50mL，渦旋振蕩2min后超聲處理（100 W，40 kHz）30分鐘，3000r/mim離心5分鐘，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脫，收集洗脫液，并于40℃氮吹至干，加入溶劑甲醇1.00mL溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，備用?；蚋鶕?jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋，備用。 5.4 精密度試驗(yàn) 鉤吻堿在140～350μg/kg、鉤吻堿子在100～250μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～3.7%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～3.1%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～2.9%；鉤吻堿子的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.8%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～2.2%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～3.1%。詳見(jiàn)表5-6。 表5-6氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法精密度試驗(yàn) 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度 /（μg/kg） 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 鉤吻堿 140 3.2% 2.5% 2.9% 280 3.7% 3.1% 2.4% 350 1.9% 1.7% 1.9% 鉤吻堿子 100 3.8% 2.2% 2.8% 200 3.5% 1.0% 3.1% 250 1.6% 1.8% 1.9% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 5.5 基質(zhì)效應(yīng)考察 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)是指在樣品測(cè)試過(guò)程中，目標(biāo)化合物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響質(zhì)譜檢測(cè)的現(xiàn)象。目前一般采用空白樣品前處理凈化后添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)｜ME︱≤10％，提示基質(zhì)效應(yīng)較小，可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；當(dāng)10％<｜ME︱≤50％，提示基質(zhì)效應(yīng)較大，若用溶劑外標(biāo)法定量回收率達(dá)不到要求，則需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響；當(dāng)｜ME︱> 50％，提示基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)，嚴(yán)重影響定量，需要重新優(yōu)化樣品前處理方法。 將空白基質(zhì)試樣按標(biāo)準(zhǔn)前處理方法進(jìn)行提取、凈化后獲得空白提取液，分別使用空白基質(zhì)提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制為濃度5 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液；進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果都在95%～105%范圍內(nèi)，說(shuō)明經(jīng)本方法提取和凈化后，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，故標(biāo)準(zhǔn)曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度也適用于本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)。考察結(jié)果詳見(jiàn)表5-7。 表5-7基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 項(xiàng)目 添加濃度(ng/mL) S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% S+空白基質(zhì)/S /% 鉤吻堿 5 103.7 102.4 103.3 20 100.2 102.1 102.5 25 98.6 99.4 100.6 鉤吻堿子 5 103.4 102.4 101.6 20 100.5 100.3 101.1 25 99.4 98.6 97.3 *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 5.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在142μg/kg～2842μg/kg（濃度為14.2ng/mL～284.2ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=1527.868234x+42475.917066，相關(guān)系數(shù)R=0.999；鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在101μg/kg～2018μg/kg（濃度為10.1ng/mL～201.8ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=3138.588520x- 2940.386876，相關(guān)系數(shù)R=0.999，詳見(jiàn)圖5-8，圖5-9。 圖5-8鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 圖5-9鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取三種基質(zhì)各5份1.00g樣品置于離心管中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)液使鉤吻堿含量為284μg/kg，鉤吻堿子含量為201.6μg/kg。按5.3前處理方法，提取，凈化并檢測(cè)。結(jié)果蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%，酒基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%；蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，酒基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，詳見(jiàn)表5-10。 表5-10重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 蜂蜜基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 273 268 284 278 280 RSD/% 2.3 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 203 206 205 192 198 RSD/% 2.9 酒基質(zhì) 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 276 280 282 280 288 RSD/% 1.6 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 208 204 209 198 207 RSD/% 2.2 保健湯基質(zhì)（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液） 名稱 CF1 CF2 CF3 CF4 CF5 取樣量m/g 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鉤吻堿 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 279 271 285 287 292 RSD/% 2.9 鉤吻堿子 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 檢出量 /(μg/kg) 203 198 195 199 208 RSD/% 2.5 5.8 回收率試驗(yàn) 鉤吻堿在280～2800μg/kg、鉤吻堿子在200～2000μg/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度回收率詳見(jiàn)下表5-11，該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的回收率試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度高。 表5-11 鉤吻堿、鉤吻堿子在不同基質(zhì)中的回收率 基質(zhì)類型 蜂蜜 酒 保健湯* 物質(zhì)種類 添加濃度/（μg/kg） 回收率 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 回收率 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 回收率 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 鉤吻堿 280 84.3%～90.9% 2.0%～4.2% 85.3%～91.2% 2.0%～3.5% 83.9%～91.2% 2.7%～3.8% 560 86.2%～90.7% 2.0%～3.4% 88.2%～92.1% 1.8%～3.0% 85.2%～91.6% 2.5%～3.4% 2800 90.2%～93.6% 2.0%～3.0% 89.8%～93.9% 1.9%～2.6% 88.5%～93.1% 2.1%～2.9% 鉤吻堿子 200 84.2%～89.6% 2.1%～4.2% 86.9%～90.2% 1.6%～3.2% 85.9%～91.1% 1.9%～3.9% 400 86.3%～91.2% 2.3%～3.7% 87.2%～91.3% 1.5%～2.9% 87.3%～92.2% 1.8%～3.5% 2000 88.5%～92.1% 2.1%～2.9% 89.0%～92.3% 1.13%～2.8% 89.7%～92.3% 1.7%～2.9% *保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。 5.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限 以加標(biāo)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比≥3來(lái)確定檢出限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出濃度可做到2.8ng/mL（28μg/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到2.0ng/mL（20μg/kg）。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比≥10來(lái)確定定量限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿定量濃度可做到5.6ng/mL（56μg/kg），鉤吻堿子定量濃度可做到4.0ng/mL（40μg/kg），由于考慮各執(zhí)行單位儀器靈敏度的差異以及鉤吻堿和鉤吻堿子為常量檢測(cè)指標(biāo)，經(jīng)口攝入引起中毒量為毫克級(jí)，最終確定當(dāng)稱樣量為1 g（精確至0.01g），稀釋倍數(shù)為10時(shí)，本方法中鉤吻堿檢出限為140μg/kg，鉤吻堿子檢出限為100μg/kg，鉤吻堿定量限為280μg/kg，鉤吻堿子定量限為200μg/kg。詳見(jiàn)表5-12。 表5-12 鉤吻堿、