動物墊料中大腸埃希氏菌O157H7NM檢測方法 編制說明

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編制說明 項目名稱：動物墊料中大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢測方法 項目編號：內質監(jiān)標函（2018）154號-109 編制單位：呼和浩特海關 編制時間：2018.6-2019.9 一、 工作簡況 本標準根據《關于下達2018年第一批內蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項目計劃的通知》[內質監(jiān)標函（2018）154號]，本標準是由呼和浩特海關提出并歸口，項目計劃編號為109。呼和浩特海關牽頭成立由相關領域的專業(yè)技術人員和具有標準化專業(yè)知識的人員組成的標準起草組。起草組在充分調查研究、綜合分析和試驗驗證的基礎上，起草標準初稿和編制說明，并廣泛征求意見。對意見進行匯總整理，修改完善標準初稿，形成地方標準征求意見稿。 第一起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關；第二起草單位：二連浩特市疾病預防控制中心；第三起草單位：內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院。主要起草人：趙治國、崔強、郭文麗、延涵、王海艷、陳林軍、敖威華、韓祎陟、羅曉平、李軍燕。 二、標準制定的背景及意義 動物墊料與動物關系密切。近年來隨著生物科學研究的飛速發(fā)展，動物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國政府的重視和科學家的關注。墊料為動物營造舒適的人工環(huán)境，進行環(huán)境控制的基礎條件和必要材料，是對動物產生直接作用和影響的環(huán)境因素。動物墊料與動物健康、福利息息相關，同時也對養(yǎng)殖業(yè)、動物及其相關科研方面甚至社會經濟發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質量評定與控制十分重要。 我國動物墊料標準化、商品化尚處于初級階段。歐美等發(fā)達國家早已實行墊料商品化生產，有專業(yè)的工廠，并且各道工序的質量控制要求非常嚴格。但我國對動物墊料的研究與應用還處于初級階段，與墊料相關的文獻報道甚少，墊料生產監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測標準缺乏。近年來我國政府及畜牧從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料中存在的問題，開始對墊料質量評價方面的問題進行改進。因此要想使動物的質量管理與國際接軌，動物墊料生產的標準化、商品化就變得至關重要。 我國動物墊料標準化和質量管理相對滯后，影響相關行業(yè)發(fā)展。我國對動物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國家標準和實驗動物相關管理條例中，對動物墊料的標準化規(guī)定幾乎空白，僅有的資料對于墊料的規(guī)定只有：應選用吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂的材料；須經消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國動物墊料標準不能緊跟國際標準，同時限制了藥品、生物制品、動物等相關產品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關學科競爭力，就必須加強墊料標準化和質量管理，從動物墊料微生物指標監(jiān)測入手。 我國動物墊料微生物檢測標準幾乎空白，亟待建立相關標準。近年來，我國政府及從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料對動物健康及下游產業(yè)的重大意義，墊料相關研究報道逐年增多，積累了一定的理論基礎。但目前，我國尚未對國內墊料質量建立統(tǒng)一評價體系、風險分析、國家標準及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物的含量對動物健康、福利和產品等影響重大，但目前動物墊料中微生物檢測標準屬于空白，亟待建立科學完善的動物墊料微生物檢測標準，該工作將對國內墊料建立統(tǒng)一 質量評價體系、風險分析及產品標準等有力促進。 大腸埃希氏菌O157 ( Escherichia coli O157) 是一種出血性致病性大腸桿菌, 能引起人類出血性腹瀉和溶血性尿毒綜合征, 其感染已成為世界性公共衛(wèi)生問題。我國于1987 年首次從出血性結腸炎患者中分離到O157：H7/NM 型大腸埃希氏菌。以后陸續(xù)有10 余個省份在市售食品、進口食品、家禽家畜和腹瀉病患者中檢出該菌。局部地區(qū)還發(fā)生了流行, 表明該病已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。如何控制E.coli O157：H7/NM 的感染是目前公共衛(wèi)生學中的重要課題, 現(xiàn)已證實家畜( 禽) 是E.coli O157：H7/NM公認的宿主動物, 且?guī)Ь啪臅r間較長, 經食物傳播是E.coliO157：H7/NM的最主要的傳播途徑, 感染力強, 只要有1 000~10 000 個菌從口中進入就會在腸內大量繁殖, 呈食物中毒型暴發(fā)。近年來E.coliO157主要的疫情的發(fā)生地德國已有16個州發(fā)生疫情，確診病例和疑似病例超過4000人。另外，瑞典、丹麥、荷蘭、法國、英國、波蘭、奧地利等10多個歐洲國家和美國近期也都出現(xiàn)了上述病例報告，現(xiàn)已造成30多人死亡。E.coliO157感染是一種人畜共患病。凡是體內染有該菌的人及帶菌家畜、家禽等都可傳播。如牛肉、奶制品的污染大多來自帶菌牛；帶菌動物在其活動范圍內也可通過排泄的糞便污染。由E.coliO157引起的食物中毒已造成數十億美元的損失。因此對家畜( 禽) 及畜禽產品中E.coli O157：H7/NM的檢驗, 將有助于控制食物源致病菌的污染, 為人類健康提供服務。 動物墊料中E.coli O157：H7/NM對動物的危害極大。動物墊料E.coli O157：H7/NM是影響動物健康和動物實驗結果的國際公認的重要環(huán)境因素之一，因此動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測十分重要。E.coli O157：H7/NM常寄居在人和動物的消化道，感染后的主要癥狀正是出血性腹瀉，引起人和動物的出血性腹瀉和腸炎，嚴重者可伴發(fā)溶血尿毒綜合征，病原隨糞便排出體外，E.coli O157：H7/NM在37℃環(huán)境條件下可耐受5小時，耐低溫，能在冰箱等低溫條件下長期生存；在自然界的水中可存活數周至數月，其廣泛分布在水和土壤中。當機體免疫力降低或侵入腸道外組織時，成為條件致病菌而引起疾病，不但能通過污染食物導致人的食物中毒，而且還能引起家畜、家禽及其他動物發(fā)生急性、慢性或隱性感染，對動物造成很大的威脅。近年由E.coli O157：H7/NM大腸埃希氏菌引起的暴發(fā)流行日趨增多, 其較高的死亡率引起重視。隨著流行病學調查深入, 在不同宿主動物中發(fā)現(xiàn)了E.coli O157：H7/NM的存在, 在北美和歐洲, 健康牛和病牛的糞便帶菌率從不足1 %~10 %, 其它動物如羊、雞、豬、兔、鵝、馬、鹿、海鷗等動物亦是該菌的貯存宿主。動物體內排出的E.coli O157：H7/NM，也可能污染食物導致人的食物中毒。因此檢測墊料中E.coli O157：H7/NM成為重中之重。 建立動物墊料E.coli O157：H7/NM檢測標準，保障動物健康急不可待。動物墊料與動物糞便直接接觸，容易滋生細菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被E.coli O157：H7/NM污染，從而威脅動物的健康與福利，并且對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國際間動物及產品貿易帶來巨大的影響，甚至威脅到人類社會的生產與生活。對于動物墊料E.coli O157：H7/NM檢測標準幾乎空白，還沒有統(tǒng)一的標準和方法，所以建立動物墊料E.coli O157：H7/NM檢測標準已刻不容緩。 本實驗室具有多年微生物檢測的經驗，本方法的開發(fā)和應用，在檢測技術方面填補我區(qū)的空白、彌補了自治區(qū)沒有現(xiàn)行標準的不足，能夠使動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測更加高效、準確、安全。本方法的開發(fā)和應用將會使我區(qū)在動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測先進性方面達到國內領先水平，為我區(qū)動物墊料質量安全管理部門更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測對確保全區(qū)農業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。 三、主要起草過程 2018.06-2018.08 地標前期基礎工作：收集動物墊料樣本，查閱E.coli O157：H7/NM資料，檢索E.coli O157：H7/NM檢測的相關文獻及標準。 2018.09-2019.09 前期實驗條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對照，不同墊料中E.coli O157：H7/NM的檢出率，最終確定實驗方案，編寫編制說明。 2019.10-2019.11 驗證單位進行驗證。 2019.12 編寫地標并定初稿。 四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準的關系 本標準遵循GB/T 1.1-2009 《標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫》和GB/T 20001.4-2015 《標準編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標準》的規(guī)則編寫。還參照相關國家標準編寫指南的要求。 在編制本標準的過程中參考了以下標準：ISO 16654:2017 《Microbiology Of Food And Animal Feeding Stuffs - Horizontal Method For The Detection Of Escherichia Coli O 157》、 AOAC Official Method 996.10 Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157：H7、《BAM:?Enumeration?of?Escherichia?coli?and?the?Coliform?Bacteria》、《美國FDA細菌學分析手冊第八版（BAM） E.coli O157：H7》、GB 14925-2010《實驗動物環(huán)境及設施》、GB 4789.6-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》、 GB 4789.36-2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗》、GB/T 22429-2008 《食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細胞增生李斯特菌的快速篩選檢驗 酶聯(lián)免疫法》、SNT 0973-2010 《進出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157:H7檢測方法》、江蘇省DB32/T 2599-2013 《畜禽腸出血性大腸桿菌O157:H7 的檢測》；綜合參考了國內外與E.coli O157：H7檢測相關的檢測標準，力求該標準能夠高效準確的檢測墊料中E.coli O157：H7，同時兼顧標準的廣泛應用。 本標準完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準相違背之處。相關強制性標準2項：GB 14925-2010 《實驗動物 環(huán)境及設施》，本標準規(guī)定了實驗動物及動物實驗設備和環(huán)境的技術要求及檢測方法，同時規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對墊料該標準僅規(guī)定了“墊料的材質應符合動物的健康和福利要求，應滿足吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經滅菌處理后方可使用” 。本地標適用于墊料中E.coli O157：H7/NM檢測，明確規(guī)定了不同類別墊料取樣方法，標準中E.coli O157：H7/NM鑒定過程增加了新的鑒定手段，確保檢測結果更加準確。 5、 主要內容及檢測方法的確定 5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化 根據動物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。 5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法 國內外食品和飼料中霉菌檢測法中常用的取樣方法為稱取法，本標準中針對顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱取25 g的方法進行取樣。 5.1.2 平面墊料樣品取樣方法 針對平面墊料（膠墊、托盤等）采用表面涂抹取樣法，無菌操作將涂抹25 cm2-100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL-100 mL mEC+n肉湯中，混勻作為原液。 5.2 培養(yǎng)基的選擇 5.2.1 選擇性增菌培養(yǎng)基 國內外標準和資料中用到的預增菌稀釋液主要有：改良EC肉湯(mEC+n)、滅菌生理鹽水、添加新生霉素的肉湯（EC）、胰酪胨大豆肉湯（TSB）、通用前增菌肉湯（UPB）和營養(yǎng)肉湯（NB）等。其中，改良EC肉湯的主要成分胰蛋白胨提供碳氮源；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是可發(fā)酵的糖類；磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀為緩沖劑，這些成分為E.coli O157：H7/NM的生長、繁殖提供了豐富的營養(yǎng)環(huán)境和良好的生長環(huán)境；其中三號膽鹽和新生霉素能夠抑制通常在飼料中存在的雜菌，所以改良EC肉湯的選擇性培養(yǎng)最好，而不同標準中使用最多的是改良EC肉湯，因此本標準也選用該預增菌稀釋液。 5.2.2 分離培養(yǎng)基 由于改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）中的三號膽鹽、結晶紫能夠抑制革蘭氏陽性菌的生長，亞碲酸鉀抑制非O157的大腸桿菌，而頭孢克肟抑制變形桿菌，因此本標準選用的E.coli O157：H7/NM分離培養(yǎng)基均為國內外標準中比較認可的CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基，同國家標準GB 4789.36-2016所用培養(yǎng)基相同，保證檢測結果的同時，兼顧不同標準所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實驗室成本。 5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標準對典型或可疑菌落的鑒定過程，參考了國內外E.coli O157：H7/NM檢測標準和藥典等成熟做法，綜合了生化反應、血清學試驗等必要鑒定過程，并囊括了全自動微生物檢測系統(tǒng)和酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)快速方法，增加了飛行時間質譜檢測方法，做到了與國際接軌，縮短檢測時間，增加檢測通量，減少檢測人員工作量。 5.4 培養(yǎng)時間和溫度 最新的ISO 16654:2017采納了美國和日本標準中常用的36℃1℃的增菌溫度，而我國常用的E.coli O157：H7/NM培養(yǎng)溫度為36℃1℃，也在這一范圍內，本標準將繼續(xù)采用我國常用的36℃1℃對E.coli O157：H7/NM進行檢測培養(yǎng)。本標準各種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間也與國內外標準常用時間相統(tǒng)一。 六、方法驗證 為驗證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測機構對本方法進行驗證，驗證內容為方法的適用性、準確度、檢出率及相關樣品的檢測，結果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關要求。 七、結論 綜上所述，本標準在制定過程中所涉及到的各項技術指標均經過方法學的驗證，并切實可行，完全達到了編制標準的要求。 八、重大意見分歧的處理依據和結果 未發(fā)生。 九、國內外情況簡要說明 國內尚沒有建立統(tǒng)一的國家標準檢測方法。檢索國家標準1項和地方標準2項：GB 14925-2010 《實驗動物 環(huán)境及設施》、江蘇省地方標準DB32/T 2129-2012 《實驗動物 墊料》、北京市地方標準DB11/T 1126-2014《實驗動物 墊料》。 根據文獻報道尚未發(fā)現(xiàn)內蒙古自治區(qū)內有相關單位從事這項研究。 10、 標準草稿征求意見情況匯總表 序號 意見 提出單位/專家 采納 不采納（說明原因） 1 建議在標準適當位置增加“E.coli O157：H7/NM檢測流程圖”。 二連海關技術中心/王伊琴 采納 2 建議將新型“飛行時間質譜法”加入到標準。 赤峰海關技術中心/趙敏 采納 3 無修改建議。 蘭州海關技術中心/張宇霞 4 無修改建議。 包頭海關綜合技術服務中心/張鵬翔 參考文獻： [1] GB/T 1.1-2009標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則. [2] GB/T 20001.4-2015標準編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標準. [3] GB 14925-2010實驗動物環(huán)境及設施. [4] GB 4789.36-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗. [5] GB/T 22429-2008食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細胞增生李斯特菌的快速篩選檢驗 酶聯(lián)免疫法. [6] GB 4789.6-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗. [7] DB32/T 2599-2013畜禽腸出血性大腸桿菌O157:H7 的檢測. [8] SNT 0973-2010進出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157:H7檢測方法. [9] DB32/T 2129-2012實驗動物 墊料. [10] DB11/T 1126-2014實驗動物 墊料. [11] 王燕，謝貴林，杜琳. 大腸桿菌O157:H7感染流行概況[J]. 微生物學免疫學進展, 2008, 36(1):51-58. [12] 周雯，陳雨欣，蘇粉良,等. 大腸埃希氏茵O157∶H7三種標準中的檢測方法比較[J]. 農產品加工月刊，2016(11). [13] ISO 16654:2017《Microbiology Of Food And Animal Feeding Stuffs - Horizontal Method For The Detection Of Escherichia Coli O 157》. [14] AOAC Official Method 996.10 Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157：H7. [15] 美國FDA細菌學分析手冊第八版（BAM） Escherichia Coli O 157.