動物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A含量的測定 編制說明

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動物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 動物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 編制說明） 湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所 2013 年 10 月 動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 2 目 錄 1 編制過程 國內外的概況 方法研究內容及結果 化特性 品前處理 標物流出體積的確定 動相 的選擇 譜條件的優(yōu)化 0 性范圍 0 準曲線 的 相對響應因子 0 出限 與 定量限 1 收率與精密度 法的可行性 2 際考核樣驗證試驗 3 4 主要參考文獻 物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 3 1. 編制經(jīng)過 “動物性食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 的測定 ”地方 標準制訂項目由 湖北省 衛(wèi) 生 與 計 劃 生 育 委 員 會 立項（ ），該測定方法的研究由 湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所 承擔。在充分收集和分析國內外現(xiàn)有資料的基礎上，經(jīng)現(xiàn)場調研、實驗室方法研究、現(xiàn)場試驗、資料整理分析統(tǒng)計，完成征求意見稿?，F(xiàn)將該標準方法制訂的依據(jù)作如下說明。 2．國內外的概況 六溴環(huán)十二烷 (和四溴雙酚 A (， 世界上消費量最大的兩種 溴系阻燃劑，廣泛應用于聚合物生產(chǎn)、印刷電路板阻燃、建筑隔熱板材、軟墊家具、室內裝潢紡織品等領域。 2010年全球 3000 噸［ 1］， 2004年 70000 噸［ 2］。 臟毒性、神經(jīng)毒性和內分泌毒性， 可導致老鼠肝臟增重、甲狀腺增大等 ，而 2001年 5月聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署（ 稱斯德哥爾摩簽署了具有劃時代的意義關于持久性有機污染物 (國際公約《斯德哥爾摩公約》，是人類保護環(huán)境的一個里程碑 [3]。作為阻燃劑市場上最常見的溴系阻燃劑首當其充與 2013年 5月，聯(lián)合國《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》（ 票一致通過一項禁令：在全球范圍內禁止生產(chǎn)和使用六溴環(huán)十二烷（ 這標志著六溴環(huán)十二烷成為繼四溴聯(lián)苯醚和五溴聯(lián)苯醚之后，又一個列入《公約》禁用化學制品黑名單的溴系阻燃劑 [4]。潛在的 溴雙酚 A(短鏈氯化石蠟 (溴代二噁英、多氯代萘 (德克隆 ( [5]。 含有六個溴原子的環(huán)狀化合物，有多種異構體 。 點在160～ 190 之間，具有對熱和紫外光的穩(wěn)定性好、用量低、阻燃效果好和 對材料物理性能影響小等特點； 是一種添加型阻燃劑，可以通過生產(chǎn)、使用和產(chǎn)品的廢棄而進入到環(huán)境中，被廣泛用作多溴聯(lián)苯醚 (替代品。歐洲主要用于及紡織品涂層阻燃處理上。我國主要用于發(fā)泡聚苯乙烯、聚丙烯纖維、苯乙烯樹脂、聚乙烯、聚碳酸酯等的阻燃添加劑，及對織物、粘合劑、動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 4 涂料及不飽和聚酯樹脂進行阻燃處理等。研究表明 有很 強的生物蓄積性和持久性，被認為是一種新型的環(huán)境持久有機污染物，已經(jīng)受到了國際社會的廣泛關注。 導致血清甲狀腺激素濃度下降、抑制神經(jīng)遞質正常吸收、引起肝組織病理學改變等生物毒性，歐盟在 將其定為管控物質， 類為高關注度物質，同時持久性有機污染物審查委員會已 將其列入《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》。 遍存在于環(huán)境中，生長在格蘭陵 (斯瓦爾巴特群島 (北極熊、海鳥及海豹身上均可檢測到 商品 3 種非對映異構 體 (α， β， γ組成， 結構式見圖 1。 其中 γ含量最高，為 75%～ 89%， α含量為 10%～ 13%， β 12%。同時發(fā)現(xiàn)在環(huán)境樣品 (土壤、污泥、污水等樣品 )中 總 60%以上；在空氣中的 要為α γβ量很少；而在水生生物和鳥類體內組織里α 量的 80%以上。可見對 危險性評價需要對 3 種異構體分別進行精確定量。 構中有兩個活 潑的酚羥基，呈強極性 ,結構式見圖 2。 目前使用量最大的一種溴系阻燃劑，其總用量約占全球阻燃劑用量的 1/3，年消耗量達 120000 T。它被廣泛應用于電子電機設備中，如印刷電路版和塑料零件中，以強化阻燃防火的功能，全球有超過 70％的電子電機設備含有 盡管它是反應型阻燃劑，但是在產(chǎn)品中仍然有大量的非聚合的 在，并且有可能釋放、污染環(huán)境。由于 甲狀腺荷爾蒙 (結構相似， 現(xiàn)階段被認為是一種潛在的內分泌干擾物。有研究表明， 夠與人類的轉甲狀腺 素蛋白 ((前白蛋白 )緊密結合 ,是一種免疫毒素。 (a) (b) (c) 動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 5 圖 1 α、 β、 γ構示意圖， (a) α (b) β(c) γ H 3C H 3B B rB B r 圖 2 構示意圖 2007 年 6 月，挪威污染控制管理局向世界貿易組織（ 報提議，一旦產(chǎn)品中某些特定物質的含量大于或等于最高限量時應嚴格 控制該類消費產(chǎn)品的生產(chǎn)、進口、出口和銷售。 挪威污染控制管理局 發(fā)布了《消費性產(chǎn)品中禁用特定有害物質》禁令，即 令，該指令于 2007 年 12 月 15 日通過， 2008 年 1 月 1 日生效。規(guī)定建議限制 的 18 種物質 中包括 令規(guī)定限量為 限量為 1％。我國目前沒有 量標準。 目前國內沒有針對 項單獨檢測標準， 目前， 分析方法在前處理方面一般采取酸化硅膠或濃硫酸或凝膠色譜分離法 (去脂肪，再用硅膠柱 /酸化硅膠柱凈化；分析 結構不難發(fā)現(xiàn)， 弱極性，所以洗脫液一般選取弱極性的混合溶劑正己烷 :二氯甲烷 (1:1， v/v)；儀器檢測方面， 種異構體的分析測定基本上是采用 針對水體、土壤、空氣等環(huán)境基質 方面有較完善的前處理方法，即索式提取后采用固相萃取進行純化； 而針對動物性基質前處理方法的報道較少 。常見的固相萃取 (化法利 用的是目標物極性的不同來達到分離的目的，然而 種極性強的物質會與硅膠牢固結合，所以需要采取極性強的有機溶劑如甲醇、乙腈等來洗脫 。在 儀器檢測方面， 單快捷，且靈敏度較高。 總體來說，目前單獨對 分析方法已經(jīng)較為成熟了。由于兩種物質的用途大，用量廣，具有一定的危害且分析檢測方法相近，故 考慮將這兩種物質進行同時分析。 施致雄等 [6]建立了一套同時測定 動物性食品中 品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 6 和 超高效液相色譜 S)的測定方法，前處理方面采取自動 脂結合濃硫酸脫脂的凈化方法，洗脫劑選取 正己烷 :二氯甲烷 (1:1，v/v)，實驗證明 方法靈敏度、準確度和精密 度均符合痕量檢測的要求； 然而凈化方法采取濃硫酸脫脂，可能 會 產(chǎn)生 安全性、前處理過程中發(fā)生 乳化現(xiàn)象 從而 影響檢測 結果等問題。 對于 由于他們的生物蓄積性和脂溶性， 于食物鏈較高點的動物和人類體內的富集程度相對環(huán)境基質要 高， 有的甚至高出上千倍。 因此，需要建立一個適合各種食品 (主要為動物源性食品 )的 方便、 快捷 、 安全且 高靈敏 的 檢 測方法來滿足同時對 便今后對這兩種物質的檢測與風險水平的評估 ，保障湖北及全國動物源性食品質量安全。 本標準在現(xiàn)有的取穩(wěn)定性同位素稀釋技術，在動物樣品中加入 13用索氏提取法提取動物基質中目標化合物，用自制的酸化硅膠固相萃取柱凈化， 高效液相色譜 質譜(S)的多反應離子監(jiān)測 (式進行測定，內標法定量，實現(xiàn)了對種 、 β、 γ 同時測定，從而為 險水平評估 工作奠定基礎。 3 方法研究內容及結果 化性質 六溴環(huán)十二烷： 1,2,5,6,9,10： 3194子量： 子式： 四溴雙酚 A： 3,3,5,5： 79子量： 子式： 品前處理 采用索氏提取的方法提取樣品， 自制 酸化硅膠固相萃取柱凈化 提取液。 具體操作如下： 干凈的固相萃取玻璃 柱底部塞一小撮棉花，從下往上依次倒入 1 無水硫酸鈉、 5 g 硅膠、 15 g 44%酸化硅膠、 5 g 硅膠、 1 無水硫酸鈉。用洗耳球輕震管壁以使填料表面水平，正己烷倒入管內排除氣泡后，再用200 己烷活化柱子備用。將提取的樣品旋蒸至近干，用正己烷復溶，每次動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 7 2~4 入酸化硅膠柱上部，如此重復清洗燒瓶 3~4 次， 100 己烷淋洗去除多余雜質， 100 己烷 :二氯甲烷混合溶液 (1:1， v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干，再用正己烷復溶，每次 2~4 復清洗燒瓶 3~4 次，轉移至 10 管，氮氣吹干后加入 200 μ渦振蕩 1 以上提取凈化方法針對魚肉、雞蛋、牛奶等固體、半固態(tài)和液態(tài)樣品，而對于油脂樣品，如植物油，則不需要索式提取，直接 1~2 加內標 混合標準應用液 B 200 μ L， 100 00 二氯甲烷混合溶液 (1:1， v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干，再用正己烷復溶，每次 2~4 復清洗燒瓶 3~4次，轉移至 10 氣吹干后加入 200 μ 渦振蕩 1 本方法 動物源性食品的提取 選擇了傳統(tǒng)的索氏提取方法，索氏提取雖然費時費溶劑，但是索氏提取裝置簡單經(jīng)濟，操作簡單，洗脫效率與回收率高，也是540（索式萃取法） 中使用的標準方法。 查閱文獻試驗對比了 5 種凈化方法后， 最終 采用的是 自制酸化硅膠固相萃取柱 凈化法 。 采用理由如下： 在凈化過程中，去除動物源性食品樣品中的油脂是最為重要的一步，如果不能有效地除盡脂肪，會影響檢測結果且污染儀器；如果在除去油脂的同時造成了目標物的損失同樣會影響檢測結果。 現(xiàn)階段除脂方法主要分兩類，一類是破壞性方法，如酸化硅膠處理、硫酸處理等；另一類是非破壞性方法，如凝膠滲透色譜(，吸附色譜等。絕對回收率衡量的是整個的分析方法對目標物會造成多大的損失。作為痕量分析方法，一般要求其值大于 50%。對于本檢測方法，能滿足 時分析的要求有兩點：一是能將樣品中的油脂能否有效被清除；二是兩種物質經(jīng)前處理之后絕對回收率均能達到 50%以上，以此來評判方法的可行與否。在 采用金龍魚植物油為空白基質，加入 合標準應用液 B 作為模擬樣品， 5 種 凈化方法 及 效果 如下： 方法 1 酸化硅膠柱 。 于干凈的固相萃取玻璃柱底部塞一小撮棉花，從下往上依次倒入 1 無水硫酸鈉、 5 g 硅膠、 15 g 44%酸化硅膠、 5 g 硅膠、 1 洗耳球輕震管壁以使填料表面水平，倒入正己烷排盡氣泡，再用 200 己烷活化柱子備用。 動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 8 將提取的樣品旋蒸至近干，用正己烷復溶，每次 2-4 入酸化硅膠柱上部，如此重復清洗燒瓶 3， 100 己烷淋洗去除多余雜質， 250 己烷 :二氯甲烷 (1:1， v/v)洗脫，收集洗脫液并旋蒸至近干，再用正己烷復溶，每次 2-4 復清洗燒瓶 3，轉移至 10 管，氮氣吹干后加入 200 μ渦振蕩 1 經(jīng)三次平行測定知 絕對回收率可達 50%以上，但 回收率只有 15%主要原因可能是 活潑酚羥基的存在，硅膠會與其牢固結合，導致洗脫液不能將其有效地洗脫下來，因此方法 1 不能滿足分析需要。 方法 2 手動填裝 于燒杯中用甲苯將活化的 即倒入干凈的玻璃管 (50 0 ，再接著用甲苯將 殘留的填料混勻倒入玻璃管，如此重復多次，待填料沉淀下來與液相分層后，用環(huán)己烷 :乙酸乙酯混合溶液 (1:1， v/v)置換出甲苯，備用。 將提取好的樣品用環(huán)己烷 :乙酸乙酯混合溶液 (1:1， v/v)復溶，每次 2-4 入 上部，如此重復清洗燒瓶 3， 400 己烷 :乙酸乙酯 (1:1， v/v)洗脫，收集 190間的洗脫液 (之前的洗脫液中不含目標物 )，旋蒸至近干，再用正己烷復溶，每次 2-4 復清洗燒瓶 3，轉移至 10 管，氮氣吹干后加入 200 μ渦振蕩 1 采用該方法時的實驗現(xiàn)象為接收液旋蒸后燒瓶內仍有極少量粘稠油分，在氮吹干過后現(xiàn)象更加明顯，該現(xiàn)象表明此方法不能完全除盡脂肪，需要進行進一步凈化才能進行后續(xù)測定。 方法 3 濃硫酸處 理 [6]。 將提取好的樣品用正己烷復溶，每次 2-4 此重復清洗燒瓶 3并至 50 入過量的濃硫酸，渦旋震蕩 1 3000 上層有機層轉移至試管中，旋蒸至近干，再用正己烷復溶，每次 2-4 復清洗燒瓶 3移至 10 氣吹干后加入 200 μ渦振蕩 1 該方法實驗現(xiàn)象為加入濃硫酸充分搖勻并離心之后，上清液與濃硫酸層中間會有一層橘黃色的乳狀物出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該乳化現(xiàn)象的嚴重程度與絕對回收率成負相關，采用加鹽去乳化處理會與濃酸反應釋放氣體，導致溶液噴出。分析其原因是動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 9 由于油分遇到強酸會發(fā)生乳化現(xiàn)象，導致部分有機層與濃硫酸層不能有效分離，而加鹽會與濃硫酸發(fā)生化學反應釋放出氣體。雖然 得到較好的回收率 (40%，但需考慮到不 同樣品基質復雜程度不同，若有些樣品遇強酸發(fā)生嚴重的乳化反應，回收率就不一定能滿足分析要求了，況且此方法要多次連續(xù)的進行液液萃取操作，耗時費力，強酸處理也容易發(fā)生危險，所以此方法并不理想。 方法 4 結合法 。 方法 2 繼續(xù)采用方法 1和方法 3，直至油脂完全除凈。 凝膠色譜分離法與濃硫酸法相結合除脂，先用凝膠色譜除去大量脂肪，接收液再加入濃硫酸去除剩余脂肪，回收率在 40%間，結果較為理想，但操作復雜，費時費力，不便于大量處理樣品。 方法 5 自制酸化硅膠固相萃取柱凈化法 。 通過理論分析發(fā) 現(xiàn) 結構中有兩個活潑的酚羥基，屬于強極性物質， 硅膠會 緊密 結合 ，若洗脫液的極性不足以將其洗脫下來，則目標物 失很大。制作酸化硅膠時，酸化后的硅膠已被濃硫酸磺基化，將活潑的氫離子取代，使其喪失了強極性，因此酸化硅膠層不會與 生牢固的結合，而未酸化的硅膠層會強烈地吸附此對傳統(tǒng)的酸化硅膠柱 (共五層：從下往上依次為無水硫酸鈉層、硅膠層、酸化硅膠層、硅膠層和無水硫酸鈉 )進行了大膽改進，將酸化硅膠柱中的硅膠層去除，新型的酸化硅膠柱從下往上依次為： 2水硫酸鈉、 15g 44%酸化硅膠 (過量 )、 2水硫酸鈉。 試驗結果證明，采用這個凈化方法， 取得了較為理想的絕對回收率 (50%；而且此方法簡單快捷，油脂可以完全去除，能滿足后續(xù)液質分析的需要 ，故采用自制酸化硅膠固相萃取柱進行凈化處理 。 標物流出體積的確定 手動填充的酸化硅膠柱滿柱體積為 150 此設定 150 將目標物100%洗脫下來。在將加標的空白基質上柱之后，每次加入 10 脫液，分 15次加入，編號為 1樣后測定 1濃縮液中目標物的含量。發(fā)現(xiàn) 2 號 5 號 有極少量的目標物流出，所以，流出體積確動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 10 定為 80 是為了確保目標物完全流出，所以本試驗將目標物流出體積定為100 動相 的選擇 根據(jù)相關資料，選擇了 18 柱（ 2.1 mm ×50 m）色譜柱。 由于電噴霧質譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，因此流動相的組成和添加劑除了影響目標化合物的保留時間和峰形外，還明顯影響到目標化合物的離子化效率。從而影響目標化合物的檢測靈敏度。實驗在滿足較好的色譜分離的同時，比較了甲醇 /乙腈 (V/V: 1/1)腈 種流動相對目標化合物離子化程度的影響。結果表明，當流動相為甲醇 /乙腈 應值明顯高于乙腈 約為 2～ 4 倍 )。因此，實驗選用甲醇 /乙腈 (V/V: 1/1)行 80 除了考察了流動相組成外，還比較了流動相為甲醇 /乙腈 (V/V: 1/1)加入一定量的醋酸銨或氨水后，目標化合物的響應值均有所降低，因此，實驗中采用甲醇 /乙腈 (V/V: 1/1) 譜條件的優(yōu)化 分析 要用到多反應監(jiān)測（ 式。首先，利用流動注射泵連續(xù)進樣。在正離子和負離子模式下進行全掃描以選擇適當?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結果表明：在負離子模式下，全掃描的分子離子 [M - H ]- m/z 理想。因此選用 [M 作碰撞誘導解離的母離子。二級質譜圖中，觀察到m/z 中 m/z -， m/z -。 分析 ，同樣利用流動注射泵連續(xù)進樣。在正離子和負離子模式下進行全掃描以選擇適當?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結果表明：在負離子模式下，同樣是全掃描的分子離子 [M - H ]- m/z 理想，但是對于二級質譜，該化合物只能檢測 以用選擇離子（ 式即可。但是本著高效的原則，希望和四溴雙酚 A 同時檢測，所以選擇了 m/z m/z 為其子離子，與四溴雙酚 A 一起使用多反應監(jiān)測（ 式。 在確定了母離子和子離子的基礎上，對毛細管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 11 脫溶劑溫 度等條件進行了優(yōu)化 。 性范圍 以 500.0 ng/ 合標準溶液進樣， 根據(jù)待測物和內標的峰面積比（ y）和對應的標準溶液中待測物的質量（ x）進行線性回歸，得出線性方程為： y = 關系數(shù)： αy = 關系數(shù)： βy = 關系數(shù)： γy = 關系數(shù)： 準曲線 的相對響應因子 計算線性曲線圖中每個點上的相對響應因子 出平均相對響應因子 (見表 1)，計算公式如下： ? 公式中： 表 1 合 標準系列溶液相對響應因子 f1 f2 f3 f4 f5 f 平均 - - 出限與定量限 檢測限根據(jù)對基質空白的測定確定噪聲，以 3倍噪聲峰高對應的濃度為檢測限 (計算公式如下： D ?? ??? 3動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 12 式中： 試驗 N 值為 1； 加入定量內標的量； 而以 10倍噪聲峰高對應的濃度為定量限 (計算公式如下： Q ?? ??? 10取 5經(jīng)檢測確定不含 作為不含目標物的基質樣，加入 20 同位素 內標混合標準應用溶液 B 200μL)，按前述 機測定 (三組平行，取平均值 )。結果如表 2所示。 確定 βng/g， ng/g， ng/g(以脂肪計 )；ng/g (以脂肪計 )。 表 2 檢測限和定量限測定結果 (ng/g，以脂肪計 ) α γ 出限 定量限 檢出限 定量限 檢出限 定量限 檢出限 定量限 平行 1 行 2 行 3 值 收率與 精密度 采用市售的金龍魚植物油為空白基質，在樣品中添加低、中、高三個不同質量濃度的標準溶液進行 析，每個添加水平平行測定 6 次?；厥章时硎痉椒ǖ目尚行裕韵鄬藴什?(示方法的重現(xiàn)率即精密度，結果見表 3。結果顯示三種 平均回收率在 間， 圍為 間。表明該方法可行，且精密度良好。 表 3 回收率和精密度 加標 水平 平均回收率 (%) n=6) α0物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 13 法的可行性 為了驗證方法在實際樣品中的可行性，采用建立的方法，在魚類、肉類、蛋類、乳類這四種實際的空白樣品 (樣品經(jīng)測定不含目標物 )中添加質量濃度為 20 析，每個添加水平平行測定 6 次。以回收率表示方法的可行性，以相對標準差 (示方法的重現(xiàn)性即精密度，結果見表 4。 結果顯示三種 平均回收率在 間， 間，表明該方法可行，且精密度良好。 表 4 實際樣品中加標回收 結果 實際樣品 平均回收率 (%) n=6) α類 類 類 類 際考核樣品 驗證試驗 采用所建立的方法，測定了從挪威 采購的鱒魚肉 (品，并用此方法測得的樣品值與 2010年 挪威公共衛(wèi)生學院組織的食品中 出的均值進行了比對。 樣品中 α， β， γ所示。 檢測結果 均以濕重計，結果如表 5所示。 采用本方法分析的 結果與國際不同試驗室的均值相接近，說明本方法測定結果準確，該分析方法可行。但實測值均低于國際均值，其原因可能是：同時分析兩種物質時，前處理方法的目標物損失率較單獨分析 動物性 食品中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚 A 含量的測定 編制說明 14 圖 3 挪威鱒魚樣品 中 構體、 同位素內標的色譜圖 1- 132- 133- 134- 13 5- α 6- β 7- γ 表 5 本方法對 實測值與 2010 年國際比對考核中鱒魚樣品均值的比較 目標物質 本方法實測值 (pg/g) 國際均值 (pg/g) α5864 176 422 0 19014 192 440 0 4. 參考文獻 [1] 焦杏春，路國慧，王曉春，等． 環(huán)境中溴系阻燃劑六溴環(huán)十二烷的水平及分析進展［ J］． 巖礦測試， 2012， 31( 2) : 210[2] S， F． J］． 2004， 112( 1) : 9[3] 江桂斌 . 持久性有機化學污染物 (定性與定量分析 [J]. 分析試驗室 , 2003, 22. 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