食品中玉米赤霉烯酮的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法(KJ201913)
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附件13 食品中玉米赤霉烯酮快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法 (KJ201913) 1. 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)膠體金免疫層析法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用玉米、小麥及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速篩選測(cè)定。 第一法 比色法 2. 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合,抑制抗體和試紙條中檢測(cè)線(T線)上的抗原結(jié)合,從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過檢測(cè)線(T線)與控制線(C線)顏色深淺的比較,對(duì)樣品中玉米赤霉烯酮進(jìn)行結(jié)果判定。 3. 試劑及材料 除另有規(guī)定外,本方法所用試劑均為分析純,試驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 3.1. 試劑 3.1.1. 乙腈。 3.1.2. 甲醇+水(7+3,體積比)。 3.1.3. 稀釋緩沖液(膠體金免疫層析檢測(cè)試劑盒專用提取液或根據(jù)產(chǎn)品使用說明書配置)。 3.2. 參考物質(zhì) 玉米赤霉烯酮的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見表1,純度≥95%。 表1 玉米赤霉烯酮參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號(hào) 分子式 相對(duì)分子量 玉米赤霉烯酮 Zearalenone 17924-92-4 C18H22O5 318.36 注:或等同可溯源物質(zhì)。 3.3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 3.3.1. 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈(3.1.1)溶解,配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。﹣18 ℃避光保存,有效期6個(gè)月。 3.3.2. 標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)(3.3.1)100 μL,置于10 mL容量瓶中,用乙腈(3.1.1)稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為1 μ稀/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液,2 ℃~8 ℃避光保存,有效期1個(gè)月。 3.4. 材料 玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試劑盒,適用基質(zhì)為玉米、小麥及其碾磨加工品。 4. 儀器和設(shè)備 4.1. 移液器:100 μL、200 μL、1 mL和5 mL。 4.2. 旋渦混合器。 4.3. 離心機(jī)。 4.4. 電子天平:感量為0.01 g。 5. 環(huán)境條件 環(huán)境溫度:20 ℃~30 ℃。 空氣相對(duì)濕度:最佳測(cè)定濕度45 %~65 %。若濕度低于45 %,相應(yīng)延長(zhǎng)待測(cè)液-試紙條反應(yīng)時(shí)間,以質(zhì)控實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn);若濕度為65 %~80 %,微孔與試紙條拆開后立即使用,避免微孔與試紙條長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中受潮;避免在濕度80 %以上濕度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 6. 分析步驟 6.1. 試樣制備 按GB 5491扦取的樣品充分碾磨或粉碎混勻,過40目篩。 6.2. 提取 準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入20 mL 甲醇+水溶液(3.1.2),用旋渦混合器振蕩3 min,離心分層或靜置分層,上清液備用。 準(zhǔn)確移取0.8 mL稀釋緩沖液(3.1.3)于1.5 mL離心管中,加入25 μL上清液,混勻,待檢。 6.3. 測(cè)定步驟 依檢驗(yàn)所需,取相應(yīng)數(shù)量的金標(biāo)微孔和試紙條,做好標(biāo)記。吸取待檢液200 μL于金標(biāo)微孔中,抽吸至孔底的紫紅色顆粒完全溶解,孵育10 min。將試紙條插入金標(biāo)微孔中,反應(yīng)3 min~5 min。 從金標(biāo)微孔中取出試紙條,棄去試紙條下端的樣品墊,觀察顯色情況,進(jìn)行結(jié)果判定。(若試劑盒冷藏保存,使用前需恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度。) 7. 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn),可根據(jù)檢測(cè)樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。 7.1. 空白試驗(yàn) 7.1.1. 試劑空白試驗(yàn):除不稱取試樣外,均按6.2和6.3所述步驟操作。 7.1.2. 基質(zhì)空白試驗(yàn):準(zhǔn)確稱取空白試樣,按6.2和6.3所述步驟操作。 7.2. 陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60 μg/kg的質(zhì)控樣,按6.2和6.3步驟操作。或準(zhǔn)確稱取空白試樣,加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液(3.3.2),使玉米赤霉烯酮添加量為60 μg/kg,按6.2和6.3步驟操作。 8. 結(jié)果判定 通過對(duì)比控制C線和檢測(cè)T線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。 8.1. 無效結(jié)果 無論樣品中有無玉米赤霉烯酮存在,控制C線均會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。若C線未顯色,表明操作不正確或試紙條已失效,檢測(cè)結(jié)果無效(見圖1)。 無效 圖1 試紙條目視判定圖 8.2. 陽(yáng)性結(jié)果 控制C線顯色,檢測(cè)T線顯色比C線淺或者沒有顏色,判定為陽(yáng)性(見圖2)。 8.3. 陰性結(jié)果 控制C線顯色,檢測(cè)T線顯色比C線深或者一致,判定為陰性(見圖2)。 比色法 圖2 試紙條目視判定圖 8.4. 質(zhì)控試驗(yàn)要求 空白試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性,陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。 第二法 消線法 9. 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合,抑制抗體和試紙條中檢測(cè)線(T線)上的抗原結(jié)合,從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。 10. 試劑及材料 同3。 11. 儀器和設(shè)備 同4。 12. 環(huán)境條件 環(huán)境溫度:10 ℃~40 ℃。 空氣相對(duì)濕度:同5。 13. 分析步驟 13.1. 試樣制備 同6.1。 13.2. 提取 準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入12.5 mL甲醇+水溶液(3.1.2),用旋渦混合器振蕩3 min,離心分層或靜置分層,上清液備用。 準(zhǔn)確移取400 μL稀釋緩沖液(3.1.3)于1.5 mL離心管中,加入上清液(小麥50 μL,玉米80 μL),混勻,待測(cè)。 13.3. 測(cè)定步驟 同6.3。 14. 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn),可根據(jù)檢測(cè)樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。 14.1. 空白試驗(yàn) 14.1.1. 試劑空白試驗(yàn):除不稱取試樣外,均按13.2和13.3所述步驟操作。 14.1.2. 基質(zhì)空白試驗(yàn):準(zhǔn)確稱取空白試樣,按13.2和13.3所述步驟操作。 14.2. 陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60 μg/kg的質(zhì)控樣,按13.2和13.3步驟操作?;驕?zhǔn)確稱取空白試樣,加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液(3.3.2),使玉米赤霉烯酮添加量為60 μg/kg,按13.2和13.3步驟操作。 15. 結(jié)果判定 通過觀察檢測(cè)T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。 15.1. 無效 同8.1 15.2. 陽(yáng)性結(jié)果 控制C線顯色,檢測(cè)T線不顯色,判定為陽(yáng)性(見圖3)。 15.3. 陰性結(jié)果 控制C線顯色,檢測(cè)T線顯色,判定為陰性(見圖3)。 消線法 圖3 試紙條目視判定圖 16. 質(zhì)控試驗(yàn)要求 同8.4 第三法 讀數(shù)儀法 17. 具體檢測(cè)步驟及結(jié)果判定可參考相應(yīng)的說明書操作,質(zhì)控試驗(yàn)參照第一法與第二法。 18. 結(jié)論 本方法篩查出的陽(yáng)性樣品進(jìn)行確認(rèn)時(shí),應(yīng)按GB 2761指定方法標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)并判定。 19. 性能指標(biāo) 19.1. 檢出限 60 μg/kg。 19.2. 靈敏度 靈敏度≥95%。 19.3. 特異性 特異性≥90%。 19.4. 假陰性 假陰性≤5%。 19.5. 假陽(yáng)性 假陽(yáng)性≤10%。 注:性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。 20. 其他 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者,在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前,須對(duì)其進(jìn)行考察,滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)時(shí)方可使用。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB 5009.209-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定。 附錄A 快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表 樣品情況a 檢測(cè)結(jié)果b 總數(shù) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異(c2) c2=(N12-N21-1)2/(N12+N21), 自由度(df)=1 靈敏度(p+,%) p+=N11/N1. 特異性(p-,%) p-=N22/N2. 假陰性率(pf-,%) pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽(yáng)性率(pf+,%) pf+=N21/N2.=100-特異性 相對(duì)準(zhǔn)確度,%c (N11+N22)/(N1.+N2.) 注: a樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果; b由玉米赤霉烯酮膠體金試紙條檢驗(yàn)方法得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N:任何特定單元的結(jié)果數(shù),第一個(gè)下標(biāo)指行,第二個(gè)下標(biāo)指列。例如:N11表示第一行,第一列,N1.表示所有的第一行,N.2表示所有的第二列;N12表示第一行,第二列。 C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果,與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 本方法起草單位:成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院。 本方法參與單位:江南大學(xué)、國(guó)家糧食局科學(xué)研究院、廣東省食品檢驗(yàn)所、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院。 本方法主要起草人:肖全偉、姚蕾珺、王昕、張敏、胥傳來、田洪蕓、沈泓、周露 — END —- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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