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1、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交植物體細胞雜交動物細胞工程：動物細胞工程： 植物細胞工程：植物細胞工程：1.1.動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)3.3.動物細胞融合動物細胞融合4.4.單克隆抗體單克隆抗體5.5.胚胎移植胚胎移植2.2.動物細胞核移植動物細胞核移植動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合動物細胞融合單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)核移植核移植動物動物細胞細胞工程工程常用常用技術(shù)技術(shù)一、動物細胞培養(yǎng)一、動物細胞培養(yǎng) 1.1.發(fā)展歷史發(fā)展歷史: : 20 20世紀初，人們不知道世紀初，人們不知道神經(jīng)纖維神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細胞的細是由神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細胞周圍的其他細胞質(zhì)
2、向外突出形成的，還是由神經(jīng)細胞周圍的其他細胞融合而成的。生物學家們就這個問題展開了激烈的胞融合而成的。生物學家們就這個問題展開了激烈的爭論。爭論。19071907年，美國生物學家哈里森年，美國生物學家哈里森(Harrison)(Harrison)從蝌從蝌蚪的蚪的脊索脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實驗不僅解從神經(jīng)細胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實驗不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)決了神經(jīng)纖維的起源問題，
3、而且開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學家的不懈努力下，動物組的先河。此后，在許多科學家的不懈努力下，動物組織培養(yǎng)不斷改進并逐漸發(fā)展成為動物細胞培養(yǎng)?？椗囵B(yǎng)不斷改進并逐漸發(fā)展成為動物細胞培養(yǎng)。2、動物細胞培養(yǎng)的應用和概念：、動物細胞培養(yǎng)的應用和概念： 動物細胞培動物細胞培養(yǎng)就是從動物有養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)機體中取出相關(guān)的組織的組織,將它分散將它分散成單個細胞成單個細胞,然后然后,放在適宜的培養(yǎng)放在適宜的培養(yǎng)基中基中,讓這些細胞讓這些細胞生長和增殖生長和增殖.1、動物細胞培養(yǎng)、動物細胞培養(yǎng)液液的主要成分：的主要成分：葡萄糖葡萄糖、氨基酸、無機鹽、微量元素、促生長因子、氨基酸、無機鹽
4、、微量元素、促生長因子和和動物動物血清血清等。等。與植物培養(yǎng)基相比其特點是：與植物培養(yǎng)基相比其特點是：（1 1）液體培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)基（2 2）含有動物血清）含有動物血清動物體細胞大都生動物體細胞大都生活在活在液體液體的環(huán)境的環(huán)境 幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)養(yǎng)單個細胞3、動物細胞培養(yǎng)過程：、動物細胞培養(yǎng)過程：動物胚胎或幼齡動動物胚胎或幼齡動物的組織、器官物的組織、器官細胞懸浮液細胞懸浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代細胞代細胞原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)50代細胞代細胞傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞株細胞株無限傳代無限傳代細胞系細胞系單個細胞單個細胞加培養(yǎng)液加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)未改變未改變遺傳
5、物質(zhì)遺傳物質(zhì)已改變已改變動物組織細胞間隙中動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡起來形成具有一網(wǎng)絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織定彈性和韌性的組織和器官。和器官。（分解彈性纖維）（分解彈性纖維）（剪（剪碎）碎） 原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：用胰蛋白酶對剪碎的動物組織進行處用胰蛋白酶對剪碎的動物組織進行處理理,分散后培養(yǎng)分散后培養(yǎng),即為原代細胞。即為原代細胞。(培養(yǎng)的第培養(yǎng)的第1代細胞代細胞與傳與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。) 傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)接觸抑制細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)接觸抑制,用胰蛋用
6、胰蛋白酶使其從瓶壁上脫離下來白酶使其從瓶壁上脫離下來,分散到多個培養(yǎng)瓶中分散到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng),即為傳代培養(yǎng)。即為傳代培養(yǎng)。細胞株：細胞株：原代細胞一般傳至原代細胞一般傳至10代左右細胞代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到活到4050代，這種傳代細胞為細胞株。代，這種傳代細胞為細胞株。 細胞系：細胞系：細胞株傳代至細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞
7、為細胞系。種傳代細胞為細胞系。 細胞株和細胞系的區(qū)別細胞株和細胞系的區(qū)別： 細胞系的遺傳細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。容易傳代培養(yǎng)。 思考討論：在動物細胞培養(yǎng)過程中，為什思考討論：在動物細胞培養(yǎng)過程中，為什么要用胰蛋白酶對取出的動物組織進行處么要用胰蛋白酶對取出的動物組織進行處理？理？ 胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的膠原纖維和細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞。 3.動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng) 的條件的條件1.無菌無毒的環(huán)境無菌無毒的環(huán)境2.營養(yǎng)營養(yǎng)3.溫度和溫度和pH4.氣體環(huán)境氣體環(huán)境 思考：思考：
8、2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？培養(yǎng)材料？1、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？有何獨特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？4、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、促生長因子、微量元素和動物血清等。主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、促生長因子、微量元素和動物血清等。獨特
9、之處有：獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基 2、成分中有動物血清等、成分中有動物血清等因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng)成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng)不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體動物個體比較項目比較項目植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的培養(yǎng)目的細胞的全能性細胞的全能性細胞增殖細胞增殖固體培養(yǎng)基
10、固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖蔗糖 植物激素植物激素 葡萄糖葡萄糖 動物血清動物血清植物體植物體細胞株、細胞系細胞株、細胞系快速繁殖、培育快速繁殖、培育無病毒植株無病毒植株獲得細胞或細獲得細胞或細胞分泌蛋白胞分泌蛋白4.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用1.1.蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn) 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體2.2.檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性3.3.健康細胞培養(yǎng)健康細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)健康細胞用于燒傷病人皮膚移植培養(yǎng)健康細胞用于燒傷病人皮膚移植4.4.細胞的生理、藥理、病理研究細胞的生理、藥理、
11、病理研究 二、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物二、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物 動物核移植是將動物的一個細胞的細胞動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核核,移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體胚胎最終發(fā)育為動物個體.用核移植的方法用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物得到的動物稱為克隆動物.胚胎移植技術(shù)胚胎移植技術(shù)胚胎移植的基本程序如下（以牛胚胎移植為例）動物的胚胎移植動物的胚胎移植 解決某些妊解決某些妊娠時間長、每胎娠時間長、每胎產(chǎn)子數(shù)量少的優(yōu)產(chǎn)子數(shù)量少的優(yōu)良種畜的繁
12、殖速良種畜的繁殖速度問題。度問題。核移植核移植胚胎細胞核移植（易）體細胞核移植（難）原因是分化程度高卵細胞卵細胞母綿羊母綿羊母綿羊母綿羊乳腺細胞乳腺細胞細胞質(zhì)細胞質(zhì)細胞核細胞核細胞核移植細胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母綿羊子宮母綿羊子宮胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多莉羊的培育過程多莉羊的培育過程融合后的卵細胞融合后的卵細胞多莉與多莉與“母親母親”2.體細胞核移植技術(shù)的應用前景體細胞核移植技術(shù)的應用前景（1 1）加速家畜遺傳改）加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群良進程，促進優(yōu)良畜群繁殖；繁殖；（2) 2) 保護瀕危物種；保護瀕危物種；（3 3）生產(chǎn)醫(yī)用蛋白；）生產(chǎn)醫(yī)用蛋白；
13、（4 4） 作為異種移植的作為異種移植的供體；供體；（5 5） 用于組織器官移用于組織器官移植。植。3.體細胞核移植技術(shù)存在的問題體細胞核移植技術(shù)存在的問題（1）成功率低；（2）克隆動物存在健康問題；（3）克隆動物食品的安全性問題存有爭議。一、動物細胞融合一、動物細胞融合 細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合兩個細胞正在融合 受精作用受精作用1.概念：動物細胞融合是指兩個或多個動物細胞動物細胞融合是指兩個或多個動物細胞 結(jié)合形成一個細胞的過程，也稱細胞雜交。結(jié)合形成一個細胞的過程，也稱細胞雜交。2.原理：細胞膜的流動性。3.3.誘導融合的方法：誘導融合的方法：（1 1）物理化學方法：與植物
14、體細胞雜交相同，如）物理化學方法：與植物體細胞雜交相同，如聚乙二醇、電激等。聚乙二醇、電激等。 （2 2）生物方法：滅活的病毒。）生物方法：滅活的病毒。4.4.過程過程細胞細胞A細胞細胞B雜種細胞雜種細胞滅活的病毒滅活的病毒物理法物理法化學法化學法仙臺病毒仙臺病毒皰疹病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒新城雞瘟病毒過程：過程：病毒顆粒黏病毒顆粒黏附細胞表面附細胞表面病毒顆粒穿病毒顆粒穿透細胞膜透細胞膜細胞膜連接細胞膜連接細胞融合細胞融合5 5，意義：，意義：（1 1）突破了有性雜交的局限，使遠）突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。緣雜交成為可能。（2 2）制造單克隆抗體。）制造單克隆抗體。比較項目比
15、較項目植物體細胞雜交植物體細胞雜交動物細胞融合動物細胞融合細胞融合原理細胞融合原理細胞融合的方法細胞融合的方法誘導方法誘導方法用途用途細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞膜的流動性去除細胞壁后誘去除細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合導原生質(zhì)體融合使細胞分散后使細胞分散后誘導細胞融合誘導細胞融合物理（離心、振蕩、物理（離心、振蕩、電刺激）電刺激）化學（聚乙二醇）化學（聚乙二醇）物理、化學方物理、化學方法（同左）法（同左）滅活的病毒滅活的病毒獲得雜種植株獲得雜種植株制備單克隆抗體制備單克隆抗體什么是抗體？什么是抗體？ 抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)
16、合的的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。具有免疫功能的球蛋白。B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。淋巴細胞產(chǎn)生抗體。 通過細胞融合技術(shù)獲得的雜交瘤細通過細胞融合技術(shù)獲得的雜交瘤細胞群產(chǎn)生的化學性質(zhì)單一、特異性強的胞群產(chǎn)生的化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體?？贵w稱為單克隆抗體。 特點：特點：特異性強、靈敏度高特異性強、靈敏度高 B淋巴細胞受抗原刺激后，可以淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。產(chǎn)生抗體。 2每一個淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗每一個淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗體。體。 3動物體內(nèi)的動物體內(nèi)的B淋巴細胞可以產(chǎn)生淋巴細胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗百萬種以上的抗體，每種抗
17、體對特定的抗原具有特異性免疫作用。原具有特異性免疫作用。 利用淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能利用淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能 利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用腫瘤細胞無限增殖的特性 利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞性的雜交瘤細胞 利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細胞交瘤細胞 單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程 注射抗原注射抗原B淋巴細胞淋巴細胞骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選細胞融合、篩選雜交瘤細胞雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生足夠
18、數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體思考：思考：1、本過程利用了哪些原理？、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有遺傳物質(zhì)，不僅具有B B細胞分泌抗體的能力，而細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體克隆抗體單克隆
19、抗體的應用單克隆抗體的應用與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強，產(chǎn)量高，特異性強，靈敏度高，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯優(yōu)越性十分明顯。應用主要有：應用主要有：1、臨床診斷、臨床診斷2、作為載體，運載抗癌藥物，形成、作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導彈生物導彈”治療腫治療腫瘤瘤資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另
20、外，用單抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。肌梗塞的診斷。小結(jié)小結(jié)兩個過程兩個過程動物細胞培養(yǎng)過程動物細胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程三個三個“一一”一個誘導細胞融合的新方法一個誘導細胞融合的新方法 滅活病毒滅活病毒一個新細胞雜交瘤細胞一個新細胞雜交瘤細胞一個優(yōu)勢單克隆抗體特異性一個優(yōu)勢單克隆抗體特異性 強、靈敏度高的優(yōu)勢強、靈敏度高的優(yōu)勢1.動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是：（）動物細胞工
21、程技術(shù)的基礎(chǔ)是：（）A動物細胞融合動物細胞融合B胚胎移植胚胎移植C動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)D核移植核移植練習在動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較中，正在動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較中，正確的是（）確的是（）A結(jié)果是相同的結(jié)果是相同的B雜種細胞的形成過程基本相同雜種細胞的形成過程基本相同C操作過程中酶的作用相同操作過程中酶的作用相同D誘導融合的手段相同誘導融合的手段相同. 單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（在這種培養(yǎng)
22、基上不能存活增殖的細胞是（ ） 淋巴細胞淋巴細胞小鼠骨髓瘤細胞小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞自身融合細胞淋巴細胞自身融合細胞小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞雜交瘤細胞雜交瘤細胞A BC D C 練習，下圖為某同學根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設計的，下圖為某同學根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設計的生產(chǎn)破傷風桿菌抗體的實驗方案生產(chǎn)破傷風桿菌抗體的實驗方案2、該方案能達到預期效果嗎？為什么？、該方案能達到預期效果嗎？為什么？4、圖中、圖中B為為_過程，常用過程，常用_作為誘導劑，該細胞繼作為誘導劑，該細胞繼承承_的遺傳特性，既能的遺傳特性，既能_,又能又能_。1、該實驗方案的目的是、該實驗方案的目的是_3、A是從小鼠的脾臟中取得是從小鼠的脾臟中取得_,該細胞能夠產(chǎn)生該細胞能夠產(chǎn)生_5、C過程指細胞培養(yǎng)，該過程包括過程指細胞培養(yǎng)，該過程包括_培養(yǎng)和培養(yǎng)和_培養(yǎng)兩個階段，其培養(yǎng)兩個階段，其中中_代以內(nèi)的的細胞屬于細胞株。代以內(nèi)的的細胞屬于細胞株。制備單克隆抗體制備單克隆抗體B細胞細胞抗體抗體細胞融合細胞融合滅活病毒滅活病毒雙親細胞雙親細胞分泌抗體分泌抗體無限增殖無限增殖原代原代傳代傳代50B體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞雜交瘤細胞足夠數(shù)量的細胞群足夠數(shù)量的細胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC
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